Extracto
El cáncer de vejiga tiene una alta incidencia de morbilidad y mortalidad significativas. expresión atenuada de la proteína de respuesta a daño en el DNA xeroderma pigmentoso grupo de complementación C (XPC) se ha descrito en el cáncer de vejiga. XPC juega un papel esencial como el iniciador principal y daño-detector en la reparación del genoma global de escisión de nucleótidos (NER) de las lesiones inducidas por UV, aductos de ADN voluminosos y reticulaciones intrastrand, tales como las realizadas por el agente quimioterapéutico cisplatino. Por lo tanto, la proteína XPC podría ser un biomarcador informativo para guiar las estrategias de terapia personalizados en un subconjunto de casos de cáncer de vejiga. Por lo tanto, se midió el nivel de expresión de la proteína XPC y NER actividad funcional de 36 tumores de vejiga de una manera estandarizada. Hemos optimizado las condiciones de disociación y
cultivo in vitro Red de células de cáncer de vejiga primario y confirmó atenuados expresión XPC en aproximadamente el 40% de los tumores. Sin embargo, la actividad NER fue similar a la co-cultivadas células de tipo salvaje en todos menos uno de los 36 tumores de vejiga. Llegamos a la conclusión, que (i) funcional deficiencia NER es un fenómeno relativamente raro en el cáncer de vejiga y (ii) los niveles de proteína XPC no son útiles como biomarcador para la actividad NER en estos tumores
Visto:. Naipal KAT, Raams A , Bruens ST, Brandsma I, Verkaik NS, Jaspers NGJ, et al. (2015) Expresión XPC atenuada no está asociado con la reparación del ADN alterada en cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (4): e0126029. doi: 10.1371 /journal.pone.0126029
Editor Académico: Kerstin Borgmann, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: 5 de Enero, 2015; Aceptado: March 27, 2015; Publicado: 30 de abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Naipal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:. la investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 /2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención Nº SALUD-F2- 2010-259893 (DDResponse) a JH, RK y DVG, URL: http://cordis.europa.eu/fp7/home_en.html; Holandés nr subvención Cancer Society (KWF). 2011-5030 a JH, URL: http://www.kwf.nl/Pages/default.aspx; y Vereniging Trustfonds la Universidad Erasmus de Rotterdam a JB, URL: http://www.eur.nl/eur/fondsen/trustfonds/. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BC) es el quinto cáncer más común en Europa, con una incidencia de más de 150.000 casos con resultado de más de 50.000 muertes por año [1]. Los tumores de vejiga presentes ya sea como no músculo-invasivo (CVNMI) (70%) o el cáncer de vejiga con invasión muscular (MIBC) (30%) [2]. MIBC es una enfermedad potencialmente letal con una tasa de supervivencia a 5 años del 50-60% [3]. Terapia de MIBC se centra principalmente en la cirugía y tratamientos quimioterápicos sistémicos, este último principalmente para recurrente y enfermedad metastásica.
Hay una necesidad clínica clara para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento sistémico para MIBC, como la supervivencia de los pacientes tiene MIBC no ha mejorado en las últimas décadas. Los tratamientos dirigidos vías específicas de tumor han demostrado ser eficaz en varios tipos de cáncer, como el cáncer de mama, de ovario y renal pero para BC estas terapias no están disponibles. Las terapias dirigidas respuesta al daño del ADN mecanismos (DDR) son enfoques prometedores en el tratamiento contra el cáncer [4]. mecanismos de DDR son esenciales para el mantenimiento de la estabilidad genómica a través de la reparación del ADN, la regulación del ciclo celular y la apoptosis. La funcionalidad de las vías de DDR específicos es un parámetro importante que contribuye a la sensibilidad de las células malignas a quimioterapia ADN perjudicial y radioterapia. Además, la orientación defectos específicos en las vías de DDR podría dar lugar a un tratamiento más eficaz. Por ejemplo, el defecto causado por DDR
BRCA1
o
BRCA2
mutaciones en cáncer de mama y de ovario sensibiliza estos tumores a inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) [5,6] . Por lo tanto, la determinación del estado de DDR de tumores individuales pueden ser valiosos para el tratamiento de elección contra el cáncer.
nucleótidos de reparación por escisión (NER) es responsable de la reparación de una amplia gama de diferentes tipos de daños de ADN producido por el medio ambiente agentes mutagénicos y carcinogénicos. Las lesiones no relacionados estructuralmente reparados por NER incluyen UV inducida distorsiones hélice, aductos de ADN voluminosos y entrecruzamientos intrastrand (por ejemplo, inducidas por fármacos como cisplatino) [7]. Dos subpathways principales de NER NER incluyen mundial genoma (GG-NER) y NER acoplada de transcripción (TC-NER). Xeroderma pigmentoso grupo de complementación C (XPC) está implicada específicamente en GG-NER y sirve como una proteína de reconocimiento de daños en el complejo con HR23B. Sólo después del reconocimiento por daños XPC-HR23B las proteínas del núcleo NER son reclutados a la lesión y NER se lleva a cabo [8]. Esto sugiere que XPC es la tasa de factor limitante en GG-NER
Varias líneas de evidencia sugieren que los genes NER juegan un papel en el desarrollo y progresión de la BC.; polimorfismos en algunos genes NER aumentan el riesgo antes de Cristo, sobre todo en los fumadores [9-12]. Además, se demostró que atenúa la expresión de la proteína XPC NER está presente en ~ 40% de todos los tumores de vejiga y un factor que contribuye en la progresión del tumor [13]. Además, la hipermetilación del
XPC
promotor del gen es significativamente mayor en BC comparación con la mucosa normal y se asocia con una mayor estadio patológico, la presencia de mutaciones de p53 y la metástasis [14]. Estas observaciones sugieren que la específica
XPC
defectos en BC causan NER defectuosa y un mal resultado en un subgrupo de tumores. Por otro lado,
XPC
defectos puede ser explotado para quimioterapia dirigida individualizada. Al dirigirse selectivamente el defecto NER el uso de compuestos que inducen daños en el ADN específica cuya reparación requiere NER, por ejemplo, Cisplatino, el aumento de la citotoxicidad se podría lograr en las células tumorales deficientes en NER.
En el presente estudio, que tuvo como objetivo identificar los niveles de expresión XPC en BC muestras clínicas individuales junto con la actividad NER funcional, como punto de partida para la terapia individualizada . Hemos establecido un método reproducible para obtener un cultivo de células sola capa de corto plazo a partir de muestras de tumor de vejiga frescas para llevar a cabo nuestros ensayos y concluir que la baja expresión de XPC no necesariamente se traduce en NER defectuoso
Materiales & amp.; Métodos
Recogida de muestras de cáncer de vejiga humana
muestras
BC (n = 105) se recogieron en el Erasmus MC de Rotterdam. Nueve muestras tumorales se obtuvieron mediante cistectomía radical y la restante por Trans uretral resección (TUR). Tras la recolección, las muestras de tumor fueron transportados directamente al laboratorio en medio de transporte (RPMI-1640, suero de ternera fetal al 10% y antibióticos). Todas las muestras entonces se les dio un código único y los investigadores estaban cegados para los datos del paciente. Todas las muestras tumorales fueron evaluados después de estándar de tinción HE y el estadio tumoral y grado fueron evaluados por el patólogo de acuerdo con la clasificación de la OMS 1973 y 2009.
especímenes de vejiga fueron recogidos como material residual quirúrgica. De acuerdo con las políticas del hospital los pacientes fueron informados de que el material residual puede ser utilizado con fines de investigación a menos que los pacientes optan por no participar. Todos los materiales fueron codificados de tal manera que los investigadores no pudieron rastrear información para el paciente individual. Por lo tanto, no se obtuvo el consentimiento explícito por escrito /oral, informado y la necesidad de consentimiento informado por escrito /oral, se renunció por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico Erasmus y este proyecto específico de investigación y procedimiento fue aprobado por el IRB (METC-2012-113).
cultivo de tejidos
especímenes tumorales se cortaron manualmente en piezas más pequeñas utilizando tijeras quirúrgicas y posteriormente sometidos a la disociación utilizando Miltenyi Biotec Kit tumor disociación en combinación con un gentleMACS Disociador según el protocolo del fabricante. Las suspensiones celulares fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en medio Amniomax-C100 (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA) y se incubaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO
2 y el oxígeno atmosférico. Si un número suficiente de células tumorales se adjuntan, un pequeño número de fibroblastos humanos de tipo salvaje, C5RO, se añadieron al cultivo para servir como controles internos para ensayo estandarizado síntesis no programada de ADN (UDS) que se realizó al día siguiente. Para distinguir las células C5RO de las células tumorales, su citoplasma se marcó de antemano con perlas de poliestireno 2.0μm [15].
líneas de células de vejiga se obtuvieron de ATCC (HT-1197 [ATCC CRL-1473] y T24 [ATCC HTB-4] y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS y antibióticos.
ADN no programada Synthesis (UDS) de ensayo
ensayo UDS se realizó por las células que irradia rayos UV con 16 J /m
2 luz UVC y, posteriormente, el etiquetado de las células durante tres horas con 20μM 5-etinil-2'- desoxiuridina (EDU, un análogo de la timidina) en el medio de cultivo (Hams F10 sin timidina, 10% FCS dializado, antibióticos) [16, 17]. Después, las células se lavaron y se incubaron en medio suplementado con 10μM timidina durante 15 minutos para eliminar EdU no específica células se fijaron usando 3,7% de formaldehído en PBS que contenía 0,5% de Triton X-100. incorporación EdU unión. se visualizó por microscopía de fluorescencia utilizando la química de click-lo (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se cuantifica por análisis de imágenes usando Fiji (ImageJ).
inmunofluorescencia tinción
para visualizar XPC-proteínas, células fijadas se incubaron con un anticuerpo primario contra XPC (Santa Cruz D-10; sc-74410 diluyó 1/1000) durante 90 min y un secundario Alexa 488 o 594 de anticuerpo conjugado durante 60 min, antes de montar en DAPI que contiene medio de montaje (Vectashield). La especificidad del anticuerpo fue probado en XPC tipo salvaje (C5RO) vs células deficientes (XPC XP21RO).
Análisis de imágenes
XPC, así como la tinción UDS de al menos 50 núcleos de células tumorales individuales se cuantificado por el software de imagen estándar (ImageJ) y se compara con al menos 20 núcleos C5RO en la misma diapositiva. Posteriormente, los niveles de XPC estandarizado y UDS de las células tumorales se calcularon como:
La inmunohistoquímica tinción
Para visualizar XPC en parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) secciones de los tumores de vejiga, las secciones se calentaron a 95 ° C durante 15 min con tampón de recuperación de antígeno (DAKO S1699) y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 20 minutos. Se añadió; (sc-74410 diluyó 1/1000 anti-XPC Santa Cruz D-10), seguido de incubación durante la noche a 4 ° C anticuerpo primario. anticuerpos HRP secundarios se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente y se visualizaron utilizando la química de peroxidasa DAB (DAKO K6438). Las muestras fueron analizadas cuantitativamente usando un sistema de puntuación inmunohistoquímica (S1 Fig). Esta puntuación inmunorreactividad (IRS) sistema tiene en cuenta el porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción observada [18].
Immunoblotting
inmunotransferencia se realizó mediante anticuerpo policlonal de conejo anti-XPC [19 ] y monoclonal de ratón anti-tubulina (clon: B-512, Sigma-Aldrich) durante una hora a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpos secundarios IRDye 800CW burro anti-IgG de ratón (H + L) (LI-COR) y IRDye 680RD burro anti-conejo IgG (H + L) (LI-COR) durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando Odyssey 3.0 (LI-COR).
supervivencia de la colonia
150 células por pocillo fueron sembradas en seis pozos de placas y cada condición se sembró por triplicado. Al día siguiente, cuando se unen las células, que se trataron con 0, 2, 4, 6, y 8 J /m
2 UVC. Después de 8 días de incubación, las células se tiñeron con 0,1% de Coomassie Brilliant Blue durante al menos 30 min. Se contaron las colonias con GelCount (Oxford Optronix).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando IBM SPSS Statistics v21 y v5 GraphPad Prism.
Resultados
XPC expresión en el cáncer de vejiga
Cuarenta y siete de 105 muestras tumorales recogidas contenían tumor suficiente para generar secciones FFPE. expresión de la proteína XPC se investigó en estos 47 tumores por inmunohistoquímica y se observó una amplia gama de niveles XPC. La mayoría (58%) de las muestras está representada expresión fuerte XPC (IRS = 3), mientras que 38% de las muestras muestra niveles reducidos (IRS = 1 o 2). Con tan sólo se detectaron niveles de fondo 4% (2 casos) (IRS = 0) (Fig 1A y S1 Fig). XPC niveles no mostraron correlación significativa con el estadio del tumor (Kruskal-Wallis, p = 0,53) ni con el grado del tumor (U de Mann-Whitney, p = 0,66). (Fig 1B y 1C)
A. Distribución de frecuencias de las clasificaciones XPC IRS en 47 muestras RTUV. B. Distribución de frecuencias de las clasificaciones XPC IRS basado en el estadio del tumor. Las diferencias en las clasificaciones del IRS no fueron estadísticamente significativas (test de Kruskal-Wallis, p = 0,5266). C. Distribución de frecuencias de las clasificaciones XPC IRS basado en el grado del tumor. Las diferencias en las clasificaciones del IRS no fueron estadísticamente significativas (prueba de Mann-Whitney, p = 0,6612).
Optimización del cultivo ex vivo de células de cáncer de vejiga disociadas
A continuación, se investigó si las diferencias en proteína XPC expresión correlaciona con las variaciones en la capacidad de reparación del ADN. actividad NER puede ser cuantificado mediante la medición de la síntesis de ADN de reparación-asociado (también llamado la síntesis de ADN no programada (UDS)). El ensayo UDS mide la incorporación de un nucleósido, 5-etinil-2 'desoxiuridina marcada (EDU), después de la exposición a la radiación UV-C (predominantemente 254 nm), y se determina en células que no están sometidos a DNA S-fase dependiente la síntesis de [20]. El ensayo UDS requiere una única capa de células de las células, ya que la radiación UV-C no penetra en biopsias de tejido de espesor. Por lo tanto, se estableció un método reproducible para obtener un cultivo de células sola capa de corto plazo a partir de muestras de tumor de vejiga frescas.
En primer lugar se compararon varios métodos de disociación para obtener cultivos de células de biopsias BC sobre cubreobjetos de vidrio. disociaciones enzimáticas utilizando diversas proteasas resultaron en bajas tasas de éxito con respecto a la unión de las células del tumor. Se consideró la unión exitosa cuando las células tumorales asociadas a más de 5% de la superficie de placa de cultivo. Unión entre 5-30% se consideró intermedio, mientras que más del 30% indicó fijación apropiado (Tabla 1). Obtuvimos apegados células tumorales en sólo el 35% de los tumores por tratamiento colagenasa VII, mientras que ningún archivo adjunto se logró con tripsina o tratamientos Dyspase (Tabla 1). En particular, en caso de las células correspondientes a la hoja de la cubierta de vidrio, pequeños grupos de células unidas de manera más eficiente que las células individuales (S2A FIG). Por otro lado, los ensayos de disociación utilizando el kit Tumor disociación Miltenyi Biotec y los gentleMACS disociador resultaron en culturas capa de células individuales en aproximadamente el 80% de los tumores (Tabla 1). Para distinguir estas células de tumor urotelial de los fibroblastos, que a menudo contaminan dichos cultivos primarios, se realizó una tinción contra citoqueratina 18. En caso de embargo su caso, la mayoría de las células teñidas positivas para citoqueratina 18, indicativo de un cultivo de células de tumor urotelial puro (S2B la figura) . Por otro lado, las biopsias de tumores que muestran efectos de cauterización en la tinción HE, indicativo de la eliminación del tumor diatérmico, no adjuntar a cubreobjetos posiblemente debido a la muerte celular (tumor) por el calentamiento excesivo. Por otra parte, las muestras de biopsias de tumores derivados de especímenes de cistectomía unidos con éxito en sólo uno de cada nueve muestras, lo que indica que los tumores de vejiga invasivos son difíciles de cultivar
ex vivo en una sola capa de células.
estrategias de recubrimiento diferentes de cubreobjetos, como la gelatina, fibronectina o poli-L-lisina no dieron lugar a una mejor unión de las células (datos no presentados). Por último, hemos probado diferentes medios de cultivo celular para aumentar la unión de las células tumorales. Medios compuestas de DMEM o RPMI-1640 (ambos suplementados con 10% de FCS y antibióticos) mostraron unión de las células en menos de 50% de las muestras, mientras que medio Amniomax-C100 logra fijación en más de 80% de las muestras (Tabla 2). La combinación del método de disociación Miltenyi Biotec y medio Amniomax-C100 se utilizó en todos los experimentos posteriores y resultó en un cultivo de células de tumor BC de una sola capa a corto plazo dentro de los dos días después de la extirpación del tumor.
UDS en muestras de cáncer de vejiga
funcional-NER actividad se analizó en las células tumorales unidas de 36 tumores de vejiga diferentes utilizando el ensayo de UDS. Además, se evaluó los niveles XPC-proteína en las mismas células por tinción de inmunofluorescencia. La puntuación para la XPC y UDS se realizó usando un método de puntuación que comparó la intensidad media de la tinción de las células tumorales a la de los fibroblastos normales C5RO humano, que fueron co-cultivadas en la misma hoja de la cubierta como las células tumorales. Los fibroblastos en los cultivos mixtos se marcaron con 2 micras perlas de poliestireno para discriminar los de las células tumorales (Fig 2). Casi el 42% (15/36) de los tumores de vejiga se expresan al menos dos veces los niveles más bajos de proteína XPC de fibroblastos co-cultivadas (0-50%) (Tabla 3). La mayoría de los tumores que aparecen cerca de los niveles normales de proteína XPC (50 a 180% de los fibroblastos co-cultivadas). No se observó intensidad de la tinción XPC de menos de 5%, un nivel típico para los fibroblastos deficientes en XPC (XP21RO) obtenidas de un paciente XP-(Fig 3A). Sorprendentemente, la expresión XPC mostró muy débil correlación con la UDS en estos tumores: R
2 = 0,32 (Figura 3B). La mayoría de los tumores con niveles relativamente bajos XPC muestran niveles UDS normales (Figs 2B y 3). se observó UDS normales (más de 50% de los fibroblastos co-cultivadas) en 34 de 36 muestras de tumores (Tabla 3). Dos tumores demostraron una reducción de UDS (menos de 50% de los controles de fibroblastos co-cultivadas), sin embargo, en una de ellas la UDS estaba cerca de 50%, mucho mayor que el observado en XPC
- /- células (Figs 2C y 3A) . El otro tumor mostró XPC y los niveles de UDS similar a la de XPC
- células - /. Desafortunadamente, debido a la falta de material no pudo realizarse un análisis genético adicional en este tumor. En conclusión, los niveles relativamente bajos de expresión XPC todavía puede apoyar la actividad TNE y la disminución de la expresión XPC no necesariamente influir en la actividad NER en células cultivadas ex vivo antes de Cristo.
A. Parte superior izquierda de la imagen muestra todos los núcleos con DAPI. A la derecha es una imagen de campo brillante (BF) en el que la célula C5RO se etiqueta con perlas de poliestireno citoplásmicos. Siguiente: XPC tinción fluorescente se presentan XPC expresión de la proteína de las células tumorales a ser similar en comparación con el tipo salvaje fibroblastos adyacente. Alta imagen de la derecha: EDU tinción fluorescente que muestra la señal UDS de las células tumorales a ser similar en comparación con el tipo salvaje fibroblastos adyacente. la fila B. medio de imágenes representan una muestra de tumor de vejiga que tiene la expresión XPC menor en comparación con las células C5RO sin embargo, los niveles normales de UDS. C. Fila inferior de las imágenes representan un tumor de vejiga que tiene la expresión XPC baja, así como bajos niveles de UDS. La flecha blanca indica células de tipo salvaje C5RO. Otros núcleos representan muestra específica del cáncer de vejiga.
A. Cada tumor está representado con su respectiva puntuación para los niveles de XPC y UDS como porcentaje de células C5RO co-cultivadas. No hay tumores muestran niveles tan bajos como XPC XP21RO, una línea celular deficiente XPC. Un tumor mostró puntuaciones de UDS similares a XP21RO. B. Diagrama de dispersión de la UDS y las puntuaciones XPC de cada tumor. niveles XPC son con frecuencia menor que 50%. Dos tumores muestran niveles UDS de menor que 50%, sin embargo de uno de estos niveles UDS están cerca de 50%. El coeficiente de determinación (R
2 = 0,32) indica que no hay o correlación muy débil.
Este hallazgo es inesperado a la luz de una publicación anterior muestra que los niveles de expresión variada XPC entre un pequeño panel de líneas celulares de BC establecidos individuales y que la línea celular con un nivel bajo de proteína XPC había disminuido la capacidad de reparación del ADN. Obtuvimos esta línea celular (HT-1197) de la colección ATCC y la comparamos con una línea celular de BC con la expresión XPC normal (T24). Sorprendentemente, no se observó una diferencia en los niveles de proteína XPC ni los de UDS entre los fibroblastos normales, T24 y células HT-1197, a pesar de que los fibroblastos derivados de un paciente XP (XP21RO) demostraron una reducción claramente los niveles de proteína XPC y redujeron UDS (S3 A la figura) . Posteriormente, se comparó el nivel de XPC HT-1197 y otras células XPC-competente y deficientes conocidos por inmunotransferencia (Figura S3 B). Una vez más, HT-1197 no mostró un nivel XPC reducida, mientras que las células deficientes en XPC conocidos mostraron una clara ausencia de la proteína XPC. También se analizó la sensibilidad de HT-1197 y T24 a la radiación UV-C mediante la realización de un ensayo de supervivencia de la colonia y no se encontraron diferencias en la sensibilidad (S3C figura). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la TH-1197 no tiene un nivel de proteína XPC disminuido ni disminución de la capacidad NER.
expresión XPC y el riesgo de recurrencia de BC
Por último, para investigar si la recurrencia del tumor tiene ningún impacto XPC en los niveles de expresión de proteínas se recogieron los datos clínicamente relevantes adicionales y se compararon los niveles de proteína XPC de CVNMI primaria a la de CVNMI recurrente. XPC niveles no fueron significativamente diferentes (Mann-Whitney, p = 0,58) entre estos dos grupos (Fig S4A). También los niveles de proteína XPC no difirieron significativamente (U de Mann-Whitney, p = 0,77) entre los tumores que mostraron recurrencia dentro de un año y los tumores que no lo hicieron. Estos datos se generaron a partir seguimiento de los pacientes, independientemente de si una muestra de BC analizado era un tumor primario o una recurrencia (S4B Fig). Esto implica que los niveles de expresión XPC mal correlacionan con el riesgo de recurrencia de CVNMI.
Discusión
De acuerdo con estudios anteriores [13,14], encontramos que la expresión de la proteína XPC atenuada es una común fenómeno en BC, tanto en las células tumorales disociadas, así como en muestras de FFPE. Sin embargo, los estudios anteriores no analizaron NER actividad funcional en BC. Por lo tanto, hemos desarrollado un
ex sistema de cultivo celular in vivo
para realizar ensayos de UDS, una prueba de funcionamiento para la actividad NER. Aquí se confirma que la expresión XPC varió ampliamente entre BC muestras primarias pero, sorprendentemente, se encontró que bajan los niveles de proteína XPC no influyeron en general TNE capacidad en BC. Más importante aún, la deficiencia funcional NER parece ser mucho menos frecuente en BC que cabría esperar sobre la base de estudios anteriores. Los niveles reducidos de la proteína XPC en estos tumores parecían suficientes para soportar funcionalmente NER. Además, no observamos una correlación entre la expresión XPC y el grado tumoral o etapa, tampoco se ha observado una relación con el riesgo de recurrencia del tumor. Llegamos a la conclusión de que los niveles de proteína XPC no deben utilizarse como un biomarcador para seleccionar los tumores de vejiga de alteración de la capacidad de reparación del ADN
.
En el presente estudio, mostramos que graves defectos NER funcionales que confieren a los productos químicos que causan hipersensibilidad NER-reparable daños, son poco comunes en BC. Por lo tanto, es poco probable que la alteración de la actividad NER puede explotarse terapéuticamente en BC. Además, la frecuencia de defectos XPC en BC puede ser sobreestimado en la literatura, ya que no se encontró un defecto XPC ni NER en la línea celular HT-1197, de la que se informó anteriormente para albergar este tipo de defectos [13]. Las diferencias en el método de detección de los niveles de expresión XPC o capacidad de reparación del ADN podrían explicar estas discrepancias. Sin embargo, muchos informes sugieren que
XPC
polimorfismos de genes pueden influir en el riesgo BC o pronóstico [10,12,21]. Todavía no se sabe si estos polimorfismos influir en la expresión XPC pero puede ser que la expresión y polimorfismos XPC rebajado tienen una influencia sutil sobre la actividad NER, lo que podría contribuir al aumento de la mutagénesis y carcinogénesis, especialmente en los casos de exposición a agentes que dañan el ADN determinado, por ejemplo, humo de cigarro. Nuestro estudio es el primero en describir la correlación entre los niveles de actividad NER y proteína XPC funcionales medidos directamente en el cáncer de vejiga primario. En nuestra actividad ensayo, NER de más de 50% (de los fibroblastos co-cultivadas) se considera normal y una disminución leve no será recogido. actividades NER Por otro lado, UDS análisis realizados en varios defectos de genes NER, en el ratón, así como células humanas, muestran redujo significativamente (menos de 50% de los fibroblastos co-cultivadas). Esto concluye que el ensayo UDS es adecuado para detectar una deficiencia NER. En las células XP21Ro niveles XPC aparentes de alrededor de 5% se correlacionaron bien con la actividad NER residual 10%. Ninguno de los tumores analizados mostró este bajo nivel de XPC, lo que sugiere que los niveles observados XPC son capaces de soportar cerca NER normal y que XPC probablemente no es limitante en estos tumores. El modelo de cultivo vivo tumor primario ex utilizado en este estudio fue especialmente diseñado y optimizado con el fin de analizar con precisión las características NER de muestras de tumor de vejiga individuales. El tumor primario se disocia y se cultivaron las células en cubreobjetos de vidrio para facilitar la UDS estandarizados ensayos y mediciones XPC por imágenes de inmunofluorescencia. Este sistema de cultivo mostró reproducibilidad robusta y por lo tanto se puede utilizar para la examinación de muestras tumorales clínicos utilizando
ex vivo
ensayos funcionales. La alta tasa de éxito de este método evita la introducción de un sesgo de selección causado por consecuencia de tan sólo un subgrupo de muestras clínicas de cáncer. Por lo tanto, este método de cultivo puede contribuir a la identificación de biomarcadores que pueden predecir la respuesta a los tratamientos contra el cáncer
Nuestro diseño experimental tiene la ventaja de que otras células pueden ser co-cultivadas con las células tumorales como controles internos, eliminando variabilidad experimental entre las muestras. De hecho, varias células de control se pueden incorporar el uso de perlas de poliestireno de diferente tamaño o color fluorescente. De esta manera, también dimos cuenta de que un tumor con UDS inferiores mostraron mayores niveles de la capacidad de reparación residual de una XPC
- /-. Celular, lo que indica que NER no fue abrogada por completo en esa muestra
Por lo tanto, la importante primera conclusión a partir de nuestros resultados es que los niveles XPC no se pueden usar como un biomarcador para guiar la elección de terapia o respuesta al tratamiento con agentes que dañan el ADN NER-reparable en BC. También llegamos a la conclusión de que el
ex vivo
sistema de cultivo y el ensayo UDS son herramientas muy adecuados para identificar tumores (que no sean BC) con una alteración de la actividad NER. Además, nuevos ensayos de reparación de ADN funcionales podrían desarrollarse para evaluar la actividad de otras vías de reparación del ADN en células tumorales y en última instancia, identificar los defectos de reparación del ADN que podrían ser explotadas terapéuticamente. En particular, este estudio pone de manifiesto la gran importancia de los ensayos funcionales para evaluar los resultados de las mediciones más indirectos, tales como los niveles de ARN y la expresión de proteínas.
Apoyo a la Información
S1 Fig. sistema de puntuación inmunoreactividad (IRS).
A. sistema de puntuación IRS. B. imágenes representativas de tinción XPC en muestras de cáncer de vejiga en las diferentes categorías de IRS
doi: 10.1371 /journal.pone.0126029.s001 gratis (PDF)
S2 Fig. Pequeños grupos de células unir para cubrir los resbalones.
A. Representativos imágenes de campo claro se muestran diferentes macizos del mismo tumor inherentes a la hoja de la cubierta y se extienden hacia fuera. B. En caso de embargo su caso, la mayoría de las células teñidas positivas para citoqueratina 18, lo que indica un cultivo de células de tumor puro y no hay fibroblastos contaminantes. Azul = DAPI, Verde = citoqueratina 18. doi: 10.1371
/journal.pone.0126029.s002 gratis (PDF)
S3 Fig. HT-1197 pantallas normales de proteína XPC y los niveles de UDS.
A. imágenes de inmunofluorescencia comparando XPC y los niveles de UDS XP21RO, T24 y células HT-1197 a la de las células C5RO. XP21RO son conocidos por ser deficientes en XPC y UDS. No se observa diferencia entre T24 y HT-1197. Imagen BF = campo brillante que muestra células C5RO etiquetados con 2 micras perlas de poliestireno, el nivel de expresión XPC = Verde, Rojo = nivel de UDS Azul = DAPI,. Las flechas blancas indican los núcleos de la línea celular respectiva. B. Inmunotransferencia para XPC comparar HT-1197 a T24, XPC conocido deficientes y salvajes de tipo fibroblastos. ensayo de supervivencia de C. colonia que muestra la capacidad de formación de colonias de células HT-1197 y T24 después de la radiación UV. No se observa diferencia entre HT-1197 y T24. Las barras de error indican la desviación estándar a partir de cuatro experimentos independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0126029.s003 gratis (PDF)
S4 Fig. los niveles de proteína XPC y la recurrencia de los tumores.
A. Los tumores se dividieron en dos grupos, los tumores primarios y tumores recurrentes, y estandarizados de proteína XPC puntuaciones de expresión se compararon de estos grupos. No se observó ninguna diferencia significativa entre estos grupos. prueba de Mann-Whitney, p = 0,58. B. seguimiento de los pacientes los datos que indican ninguna diferencia entre los niveles de XPC de tumores que no se repetiría un año después de la RTU y los tumores que se repetiría. Cada punto de datos representa un tumor. La línea horizontal representa la mediana y las barras de error indican el rango intercuartil
doi:. 10.1371 /journal.pone.0126029.s004 gratis (PDF)
Reconocimientos
Los autores quieren agradecer el equipo clínico del departamento de Urología y el departamento de Patología del Centro Médico Erasmus de Rotterdam para la ayuda en la recogida de material de investigación.