Extracto
La caquexia por cáncer es un síndrome paraneoplásico que causa profunda pérdida de peso y la atrofia muscular y la masa se estima en la causa de hasta el 30% de las muertes por cáncer. Aunque la causa exacta es desconocida, los pacientes con caquexia por cáncer han aumentado el catabolismo de proteínas musculares. En el músculo sano, lesión activa las células madre de músculo esquelético, llamadas células satélite, para diferenciar y promover la regeneración. En este caso, aportar pruebas de que este mecanismo se inhibe en la caquexia por cáncer debido a la expresión persistente de CCAAT /potenciador de la proteína de unión beta (C /EBPb) en mioblastos de músculo. C /EBPb es un factor bzip de transcripción que se expresa en las células satélite de músculo y normalmente se downregulated a la diferenciación. Sin embargo, en mioblastos expuestos a un medio caquéctico, la expresión de C /EBPb sigue siendo elevada, a pesar de la activación de diferenciar, lo que resulta en la inhibición de la expresión de miogenina y la miogénesis.
In vivo
, los resultados de la caquexia por cáncer en mayor número de células Pax7 + que también expresan C /EBPb y la inhibición de los mecanismos normales de reparación. La pérdida de expresión C /EBPb en mioblastos primarios rescata la diferenciación en condiciones caquécticos sin restaurar el tamaño de miotubos, lo que indica que C /EBPb es un inhibidor importante de la miogénesis en la caquexia por cáncer
Visto:. Marchildon M, Lamarche É, lala- Tabbert N, St-Louis C, limpiaparabrisas-N Bergeron (2015) Expresión de CCAAT /potenciador de la proteína de unión beta en las células musculares satélite Inhibe Miogenesis en cáncer caquexia. PLoS ONE 10 (12): e0145583. doi: 10.1371 /journal.pone.0145583
Editor: Atsushi Asakura, Universidad de Minnesota Medical School, Estados Unidos |
Recibido: 14 Septiembre, 2015; Aceptado: 4 de diciembre de 2015; Publicado: December 28, 2015
Derechos de Autor © 2015 Marchildon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones a LNA de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (http://www.cihr-irsc.gc.ca) y la Sociedad de Investigación del Cáncer (https://www.crs-src.ca/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado no hay intereses en competencia
Introducción
la caquexia profunda provoca la pérdida de peso y atrofia de la masa muscular, y ocurre de forma concomitante con diversas enfermedades, como la septicemia, el SIDA, la drogadicción y el cáncer [1, 2]. Aunque a menudo junto con la anorexia, la pérdida de peso y el catabolismo de proteínas musculares visto en pacientes caquécticos no puede ser revertida por la suplementación nutricional y por lo tanto no se puede atribuir a una ingesta nutricional deficiente solas [3]. Hasta el 80% de todos los pacientes con cáncer tendrán la caquexia en las etapas avanzadas de la enfermedad [4-6], y esto se correlaciona con la debilidad, aumento de la morbilidad y los resultados pobres. Además, aproximadamente el 30% de las muertes por cáncer se atribuyen a la caquexia en lugar de la carga tumoral, por lo que la caquexia por cáncer una causa importante de mortalidad en América del Norte [1]. Como tal, la creación de estrategias de tratamiento y prevención es de suma importancia como la caquexia está inversamente correlacionado con el éxito de los tratamientos contra el cáncer y la supervivencia de los pacientes [3, 7-9]. La causa de la caquexia del cáncer se cree que se derivan de una combinación de digestivo (disfagia y disgeusia), humoral (inflamación sistémica), endocrino y los factores derivados del tumor [10-13]. Ambos pacientes caquécticos con cáncer y modelos animales de la caquexia han elevado de citoquinas proinflamatorias (por ejemplo TNF, IL-1, IL-6) expresión en el torrente sanguíneo, lo que sugiere que estos factores juegan un papel en el desarrollo de la caquexia [14-18].
En un individuo sano, la homeostasis del músculo masa se logra mediante el equilibrio de proteínas musculares catabolismo con la síntesis de proteínas. atrofia del músculo esquelético, como se ve en la caquexia por cáncer, está mediada al menos en parte por la regulación al alza de ATP dependiente de ubiquitina ligasas E3 (MuRF, MAFbx /atrogina-1) que estimulan la degradación de las proteínas estructurales del músculo por el proteasoma 26S e inhiben directamente la maquinaria de traducción [19, 20]. Las citoquinas pro-caquécticos estimulan la expresión de estas ligasas y de ese modo promueven aumento del recambio de proteínas musculares [18, 21-23].
Las células satélite son la fuente principal de la capacidad de regeneración de músculo esquelético y se encuentran entre el sarcolema y la membrana basal de las fibras musculares diferenciadas [24]. Estas células se pueden activar tanto proliferan y se diferencian en respuesta a estímulos externos, lo más importante lesión muscular y el ejercicio [25]. Las células satélite se definen por su expresión de CD34
+ y Pax7, entre otros [26, 27]. Como las células satélite se diferencian, pierden progresivamente expresión de Pax7 y expresan de una manera coordinada la myogenic bHLH factores de MyoD, miogenina y MRF-4 que son responsables de la inducción de genes-miocitos específico [28]. En condiciones de desgaste muscular, hay una reducción de la expresión de MyoD de tal manera que además de hipercatabolismo, la disminución de la regeneración ha sido implicado en la patogénesis de la caquexia, que une la inhibición de la expresión MyoD y reducida capacidad de diferenciación en el desarrollo de la caquexia
in vivo
[29-31].
CCAAT /potenciador de la proteína de unión beta (C /EBPb) es un factor de transcripción bzip involucrado en muchos procesos de regulación y diferenciación tanto como un activador y un represor. Por ejemplo, se requiere para la regeneración del hígado, actúa como un factor de compromiso potente para la diferenciación de los adipocitos, y regula la respuesta de fase aguda del sistema inmune [32-36]. Además, hemos demostrado que C /EBPb es también un importante regulador de destino de las células madre mesenquimales en los modelos de cultivo de tejidos, donde actúa como un activador de la adipogénesis y un represor de la osteoblastogénesis [37-39]. En el músculo sano, la expresión de C /EBPb se limita a Pax7
+ células satélite y su expresión disminuye tras la activación [40-42]. expresión /EBPb ectópico C inhibe la miogénesis a través de la inhibición de la expresión de la proteína MyoD, lo que lleva a la reducción de miogenina y expresión MyHC y disminución de la actividad fusogénica [41].
In vivo
, sepsis, el cáncer y los glucocorticoides puede upregulate la expresión de C /EBPb en el músculo, así como desencadenar la caquexia [43, 44]. En efecto, la caquexia puede estimular la expresión de C /EBPb en las fibras musculares que conducen a la expresión de atrogina-1 y fibra atrofia [45]. El injerto del tumor carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) en C /EBPb animales nulos impidió la estimulación de atrogina-1 en las fibras musculares y atrofia muscular [45], lo que sugiere que la pérdida de C /EBPb puede inhibir la atrofia muscular en la caquexia por cáncer. Sin embargo, el nullizygous animales C /EBPb está inmunodeprimido, y por lo tanto es poco probable que tenga respuestas normales a prendimiento del tumor, incluyendo la producción de citoquinas necesaria para el desarrollo de la caquexia [46, 47], lo que sugiere que los modelos condicionales proporcionarían una mayor profundidad de entendimiento. Además, el modelo nullizygous no puede distinguir el papel de la C /EBPb en la fibra muscular frente a los efectos potenciales en la población de células satélite regeneración de conducción.
Múltiples líneas de evidencia indican que la inhibición de la regeneración del músculo esquelético, si a través de la pérdida de precursores miogénicos, la inhibición de MyoD o a través de la activación del receptor de activina de tipo 2, participa en el desarrollo de la caquexia del cáncer [31, 48-50]. Aquí, nos muestran, utilizando modelos de caquexia por cáncer, que la estimulación de la expresión de C /EBPb en las células satélite y mioblastos por el entorno caquéctico evita que la respuesta regenerativa miogénica.
Resultados
El medio condicionado de humanos cánceres induce la expresión de C /EBPb en mioblastos
Dado que C /EBPb es un importante regulador del sistema inmune y está aguas abajo de numerosas vías de señalización de citoquinas, predijimos que medio condicionado de los cánceres humanos sería estimular la expresión de C /EBPb en mioblastos. mioblastos C2C12 se cultivaron con medio acondicionado (CM) a partir de varias líneas celulares de cáncer humano para 2 días y la expresión C /EBPb se evaluó mediante Western Blot. La incubación de células C2C12 con CM de todos los tumores ensayados estimuló la expresión C /EBPb en diversos grados, con PC-3, MCF7 y líneas A549 que producen el aumento más robusto en la expresión (Fig 1A). Por el contrario, la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 y la línea de cáncer de colon humano HCT116 estimulan la expresión de C /EBPb lo menos. La incubación con PC-3 CM también estimuló
CEBPB
la expresión de ARNm en casi 2 veces (Fig 1B). Curiosamente, las células PC-3 expresan TNF, IL-1β y mRNA PIF, y la expresión de C /EBPb se ha demostrado ser regulada positivamente por IL-6, una citoquina cuya expresión se upregulated de IL-1 y TNF señalización [15, 51 -53]. De hecho, mientras que PC-3 células expresan
IL1B
, la transcripción era indetectable en las células SKOV3, lo que sugiere un mecanismo para explicar la estimulación de la expresión diferencial /EBPb C en mioblastos por estas dos líneas celulares de cáncer (Fig 1C).
(a) mioblastos C2C12 se incubaron con medio condicionado de los cánceres humanos indicados o medio condicionado (UM) mezclado 1: 1 con medio de mioblastos fresco durante 48 horas. expresión C /EBPb se evaluó mediante Western blot. β-actina es un control de carga. (B)
CEBPB
la expresión de ARNm en mioblastos tratados con PC-3 de soporte y medio condicionado durante 48 horas. * P & lt; 0,05, n = 5. (C)
IL1B
expresión en SKOV3 y células de cáncer de PC-3. * P & lt; 0,05, n = 5.
Tumor medio acondicionado inhibe la miogénesis
Para investigar el papel de C /EBPb en las células madre de músculo durante la caquexia por cáncer, se utilizó un tejido validado modelo de cultivo [53] en el que subconfluentes C2C12 mioblastos se incubaron con medio condicionado (CM) de la cánceres de próstata humano PC-3 y DU145, o con medios de comunicación no condicionado (UM) durante 2 días antes de la inducción para diferenciar (Fig 2A). De acuerdo con informes anteriores, la incubación con CM de ambos tipos de cáncer abrogó la miogénesis, como se evidencia por una reducción en el número y tamaño de cadena pesada de miosina (MyHC) miotubos positivos (Fig 2B) [53]. El índice de fusión (# núcleos en MyHC + células /# miocitos) se redujo ~ 60% en PC-3 medio y ~ 30% por medio DU145 en comparación con los controles (Fig 2C), el índice de diferenciación (#nuclei en MyHC + células /Total núcleos) se redujo aproximadamente 40% en las células pre-tratadas con medio de PC-3, y ~ 30% de los tratados con medio DU145, en comparación con los controles (Fig 2C), lo que sugiere que se vio afectada tanto por el número y la madurez de los miotubos por una breve exposición a medio acondicionado tumor. En mioblastos proliferantes, la exposición a CM de ambos tumores estimula la expresión de C /EBPb después de dos días, sin afectar a la expresión de Pax7 (figura 2D). La expresión de MyoD se redujo en las células tratadas con CM DU145, aunque no en las células tratadas con PC-3 medio (Fig 2D). Después de la diferenciación (día 7), pre-tratamiento con PC-3 myogenin inhibido medio acondicionado y la expresión de MyHC, en consonancia con la diferenciación alterada, sin afectar a la expresión de MyoD (Fig 2E). Además, la expresión de ARNm de
MYOD1
,
MYOG
y neonatales
Myh
isoformas (
Myh1
,
Myh2
,
Myh8
y
Myh13
) fueron inhibidas por la exposición a PC-3 con respecto al medio de las células expuestas a medio condicionado (figura 2F). medio DU145 reducirse de forma similar
MYOG
y neonatal
Myh
isoforma de expresión, sin impactar
MYOD1
expresión.
(A) Esquema del procedimiento de tratamiento para el modelo de cultivo de tejido de la caquexia. El medio condicionado de las células PC-3 se mezcló 1: 1 con medio fresco, y se añadió a la proliferación de los mioblastos C2C12 durante 48 horas después de lo cual las células fueron inducidas a diferenciarse en DMEM fresco que contiene 2% de suero de caballo durante 5 días. (B) tinción inmunocitoquímica para la expresión de la cadena pesada de miosina en C2C12 cultivos tratados con medio condicionado de los cánceres de próstata DU145 PC-3 o o medios no condicionado (UM) como en (A). manchas DAPI núcleos azul. Se indujeron (C) C2C12 culturas para diferenciar como en (A) y el índice de fusión (# mionúcleos /myotube) y el índice de diferenciación (# mionúcleos /# total de núcleos) se calculó, y se muestran en relación con UM. Los valores reales se muestran en los bares. * P & lt; 0,05, n = 7. (D) Análisis de transferencia Western de C /EBPb, Pax7, y la expresión de MyoD en la proliferación de las células C2C12 en día 2 después de la incubación con medio acondicionado. La actina es un control de carga. (E) Western blot de la expresión del marcador miogénica en las células C2C12 diferenciadas en el día 7. La actina es un control de carga. (F) QRT-PCR análisis de
MYOD1
,
MYOG
y la cadena pesada de la miosina neonatal (
Myh1
,
Myh2
,
Myh8
,
Myh13
) expresión, que se muestra en relación con las células tratadas con medio condicionado (UM) en el día 7. * p & lt; 0,05, n = 4.
la inhibición de la miogénesis por medio acondicionado tumor varía con la capacidad de inducir la C /EBPb en C2C12 y mioblastos primarios
Desde se espera que el medio acondicionado para contener una mezcla de factores de crecimiento y citoquinas que pueden influir en la entrada en la miogénesis, repetimos el en la cultura modelo de caquexia usando medio condicionado de células SKOV3 que estimula sólo débilmente la expresión de C /EBPb. Mientras que el pretratamiento con medio de SKOV3 permitió la diferenciación robusto, pre-tratamiento con PC-3 medio inhibió la formación de miotubos, disminuyendo el índice de diferenciación en aproximadamente un 50% y el índice de fusión de ~ 40% (Fig 3A y 3B). Además, de acuerdo con las diferencias en la inducción de C /EBPb por SKOV3 y PC-3 CM, miogenina expresión y la expresión de MyHC se redujo en las células expuestas a PC-3 medio en comparación con controles SKOV3 (figura 3C).
(a) la inmunocitoquímica tinción de expresión de cadena pesada de miosina en mioblastos C2C12 pre-tratados con medio condicionado de SKOV3 o células PC-3 se mezcla 1: 1 con medio fresco, durante 48 horas, y se indujo para diferenciar durante 5 días. manchas DAPI núcleos azul. Se indujeron (B) C2C12 culturas para diferenciar como en (A) y los índices de diferenciación y fusión se calcula como en relación con las células tratadas con SKOV3. Los valores reales se muestran en las barras respectivas. * P & lt; 0,05, n = 5. (C) C /EBPb, y expresión de proteínas marcador miogénica en mioblastos C2C12 tratadas como en (A). La ciclofilina B (CYPB) se muestra como control de carga. (D) la tinción inmunocitoquímica de la cadena pesada de la miosina (MYH) expresión en mioblastos primarios pre-tratados con medio condicionado de SKOV3 o células mezcladas 1 3 PC-: 1 con medio fresco, durante 48 horas, y inducidas a diferenciarse durante 48 horas adicionales en DMEM que contiene 10% de suero de caballo. manchas DAPI núcleos azul. Se indujeron (E) cultivos de mioblastos primarios para diferenciar como en (D) y los índices de diferenciación y fusión se calcularon como en relación con las células tratadas con SKOV3. Los valores reales se muestran en las barras respectivas. ** P & lt; 0,01, n = 4. (F) Porcentaje de Pax7 + células en relación con los núcleos restante total en las células C2C12 cultivadas en medio condicionado y diferenciados como en (D) como se determinó por inmunocitoquímica. * P & lt; 0,05, n = 4. (G) C /EBPb, y expresión de proteínas marcador miogénica en mioblastos primarios tratados como en (D). Ciclofilina B (CYPB) se muestra como control de carga.
De acuerdo con el modelo C2C12, pretratamiento de mioblastos primarios con medio condicionado de la delantera del tumor PC-3 a la formación de menores y miotubos más pequeños después de 2 días en medio de diferenciación en comparación con las células tratadas con medio condicionado del tumor SKOV3 (Fig 3D). El índice de diferenciación se redujo ~ 30% con PC-3 pre-tratamiento en comparación con las células tratadas con SKOV3, mientras que el índice de fusión se redujo ~ 50% en mioblastos tratados con PC-3 (Fig 3E). Además, el número de células Pax7 + restantes en los cultivos después de la diferenciación, según se determina usando inmunocitoquímica, se incrementó significativamente en cultivos pre-tratados con PC-3 medio en aproximadamente un 25% en comparación con los controles (Fig SKOV3 3F). Como se predijo, los niveles de C /EBPb se incrementaron en las células PC-3 tratado en comparación con los controles, y la expresión de miogenina y la cadena pesada de la miosina se redujeron. Curiosamente, en contraste con nuestras observaciones en el modelo de C2C12, mioblastos primarios tratados con PC-3 CM también demostraron una disminución de la expresión de la proteína MyoD, que concuerda con nuestras observaciones anteriores en este sistema (Fig 3G) [41, 42].
C /EBPb se incrementa en mioblastos primarios aislados de ratones caquéctico
Para determinar si el entorno canceroso podría estimular la expresión de C /EBPb en mioblastos
in vivo
, aislamos muscular células satélite de sana y caquéctico LLC portadores de tumores animales y les diferencian
ex vivo gratis (figura 4A). Mientras que las SC purificados a partir de los músculos sanos diferenciados de manera eficiente, mioblastos aislados de animales caquécticos producen menos y más pequeños miotubos (Figura 4B). El índice de diferenciación se redujo en un 38% en cultivos de animales caquécticos y el índice de fusión se redujo 46% en comparación con los controles sanos (figura 4C). Como se ampliaron estas células en medio normal durante 5 días antes de la inducción para diferenciar, los niveles de C /EBPb se aumentaron sólo ligeramente después de la diferenciación, lo que resulta en la expresión de MyoD normalizado (figura 4D) y una pequeña disminución en la expresión miogenina. mioblastos primarios extraídos de los ratones caquéctico también demostraron una disminución en la expresión de MyHC en comparación con controles simulados, en consonancia con el defecto observado diferenciación (Fig 4D). Por lo tanto, similar a nuestros experimentos, las células satélite CM procedentes de animales LLC injertado-tumorales tienen una mayor expresión C /EBPb y un defecto en la diferenciación que persiste
ex vivo.
(A) 5x10
5 carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) de células sup o PBS (Sham) se inyectaron en el flanco de ratones C57BL /6 y se permite que se injertan durante 3 semanas para inducir la caquexia. (B) La inmunocitoquímica para la expresión de la cadena pesada de miosina en mioblastos primarios aislados de ratones sham-inyectado y LLC-inyectado y diferenciadas durante 2 días. (C) La diferenciación (DI) y de fusión (FI) índices a partir de cultivos aislados y diferenciados como en (B). * P & lt; 0,05, n = 5. (D) El análisis de Western de C /EBPb y la expresión del marcador miogénica en células aisladas de ratones sanos o caquécticos como en (A) y después de la expansión cultivo durante 5 días, diferenciadas durante 2 días. Ciclofilina B (CYPB) es un control de carga.
La caquexia por cáncer inhibe la regeneración muscular in vivo
Para evaluar la capacidad de regeneración del músculo esquelético en los animales caquécticos, que se lesionó el músculo TA izquierda con cardiotoxina (CTX) una vez que se estableció la caquexia y se evaluó la reparación de una semana más tarde (figura 5A). Siete días después de la lesión, el músculo TA de animales sanos reparado de manera eficiente con numerosas fibras musculares con núcleos céntricos visibles, mientras que el TA lesionados de los animales caquécticos tenía fibrosis extensa y la infiltración de células inflamatorias con poca evidencia de regeneración (Figura 5B). De hecho, mientras que la reparación de fibra restaurado área de sección transversal a niveles no lesionados en los ratones de control sanos, en ratones caquécticos, regenerando área de la fibra muscular de la sección transversal se redujo aún más en un 28% después de la lesión, que mide sólo 59% de músculo no caquécticos lesionado-CTX (Fig 5C). Consistente con estas observaciones, el peso TA de animales sanos heridos en la necropsia habían regresado a la de los controles, mientras que el peso de la TA lesionado en animales caquécticos era sólo el 73% del control no lesionado caquéctico (Fig 5D).
(A) representación esquemática del modelo de lesión. La caquexia se indujo mediante injerto de las células de cáncer LLC subcutánea y que les permite crecer durante 3 semanas. Una vez que se estableció la caquexia, los animales fueron heridos por la inyección de cardiotoxina (CTX) en el músculo TA. lesión Sham se logró utilizando PBS. Lesión se le permitió reparar durante una semana antes del análisis. (B) H & amp; E-manchado TA secciones transversales de farsa y los ratones inyectados con LLC que en (B) 7 días después de la lesión CTX. El TA contralateral fue inyectado con PBS solo. Barra de escala = 20μm. (C) XSA promedio de fibra de PBS y la falsa lesionado-CTX y ratones LLC como en (B). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, n = 4. (D) de masa TA en PBS y la falsa lesionado-CTX y ratones LLC como en (B). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, n = 5. (E) Porcentaje de células Pax7 + (en relación con DAPI total + núcleos) en PBS y heridos-CTX TA de farsa y animales LLC. ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, n = 5. (F) Porcentaje de células /EBPb + /Pax7 + C (en relación a animales de simulación no lesionados) en PBS y heridos-CTX TA de farsa y animales LLC. * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001, n = 3.
Hemos marcado siguiente, el número de células Pax7 + TA en secciones transversales (figura 5E). Mientras que aproximadamente el 1,6% de los núcleos teñidos positivamente para Pax7 en los músculos TA no lesionados de animales de simulación, este número llegó a 3,5% en animales que portan LLC no lesionados. Después de CTX lesión, Pax7 + células aumentó en ambos farsa y animales LLC, con un aumento de 2 veces para los animales de control simulado en comparación con la pierna sana y un aumento de 4,5 veces sobre la pierna sana en animales portadores de tumores a casi 20% de núcleos. Además, aunque la lesión no afectó el porcentaje de Pax7 + /C /EBPb + células satélite en animales sanos, en la cohorte portador de un tumor, el porcentaje de células doble positivas se incrementó tanto en el músculo no lesionado y heridos (Fig 5F), consistente con
ex vivo
el análisis de las células satélite (figura 4D). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la caquexia por cáncer aumenta el tamaño Pax7 + compartimento y estas células tienen una mayor expresión de C /EBPb pero reducida capacidad regenerativa.
La pérdida de expresión /EBPb C protege mioblastos de la caquexia en cultivo
para confirmar un papel para C /EBPb en el desarrollo de la caquexia por cáncer, aislamos
CEBPB
fl /fl
Pax7
+ /+ (WT) y
CEBPB
fl /fl
Pax7
Creer /+ (cko células satélite), y pre-tratadas con CM del tumor PC-3 o el tumor SKOV3 ( control) antes de la inducción para diferenciar en condiciones de bajo suero. Después de 2 días en medio de diferenciación, los cultivos se inmunotiñeron para MyHC expresión (Fig 6A). Mientras que el tratamiento previo con PC-3 CM inhibe la diferenciación de mioblastos en WT, pérdida de expresión de C /EBPb rescató la diferenciación en estas condiciones (Figura 6A y 6B), lo que sugiere que la pérdida de expresión /EBPb C protege mioblastos desde el medio caquéctico. A pesar de la restauración del índice de diferenciación en cultivos CKO, pérdida de la expresión /EBPb C no restauró myotube tamaño (índice de fusión) que se redujo después de la incubación con el medio de PC-3 (Fig 6C). Mientras que el tratamiento de células WT con PC-3 medio aumentó el porcentaje de células Pax7 + en los cultivos, consistente con una reducción en el índice de diferenciación, las culturas que carecen de C /EBPb tuvieron significativamente menos células de reserva después de la diferenciación en condiciones tanto de control y caquécticos (Fig 6D ). Aunque no se observaron diferencias en la expresión del marcador miogénica al comparar WT y las células en medio de control cko SKOV3, análisis de Western reveló que MyoD y miogenina expresión se redujeron las células inWT siguiente pre-tratamiento con PC-3 medio (Fig 6E). Sin embargo, en las células CKO, la expresión de MyoD se incrementó después de la incubación con PC-3 medio en comparación con WT y expresión myogenin fue restaurada a los niveles de control (Fig 6E). Por lo tanto, la pérdida de C /EBPb en células satélite de músculo puede rescatar la miogénesis en presencia de medio acondicionado, sin restaurar tamaño myotube.
(A) La inmunofluorescencia indirecta de la cadena pesada de la miosina (MyHC) expresión en mioblastos primarios aislados a partir de
CEBPB
fl /fl
Pax7
+ /+ (WT) y
CEBPB
fl /fl
Pax7
Creer /+ (CKO) ratones y se cultivaron con o SKOV3 PC-3 medio acondicionado durante 2 días, y inducidas a diferenciarse para un adicional de 2 días. (B) índice de diferenciación (# mionúcleos /# núcleos) de mioblastos primarios culturas en (A). * P & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001, n = 6. (C) Índice de Fusión (# mionúcleos /myotube) para células diferenciadas como en (A). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, n = 6. (D) Porcentaje de células Pax7 + en relación con el total de los núcleos en cultivos a partir de (A) después de la diferenciación, designado como células de reserva. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, n = 6. (E) Análisis de transferencia Western de C /EBPb y la expresión del marcador miogénica en mioblastos primarios tratados como en (A). La ciclofilina B (CYPB) es un control de carga.
Discusión
C /EBPb es un factor de transcripción implicado en numerosos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la regulación del ciclo celular, la función del sistema inmune y la supervivencia celular [33, 54-59]. Como tal, la expresión /EBPb C se ve influido por muchas vías diferentes, incluyendo la señalización de citoquinas, factores de crecimiento, el proteasoma y cAMP señalización [42, 60, 61]. Aquí, demostramos que la expresión de C /EBPb puede ser estimulada por la exposición al medio condicionado de cánceres humanos, con diferentes eficiencia. Aunque este medio condicionado contiene mediadores de citoquinas probables, los factores exactos en los medios condicionados de conducción expresión C /EBPb siguen siendo desconocidos y pueden ser diferentes para cada cáncer. Sin embargo, la estimulación de la expresión C /EBPb en mioblastos correlacionada con la inhibición de la miogénesis que podría invertirse con la pérdida de C /EBPb.
Pre-tratamiento de la proliferación de mioblastos con medio condicionado fue suficiente para inhibir la miogénesis, incluso a pesar de la diferenciación se llevó a cabo en medio libre de señales pro-caquexia. Por tanto, estos experimentos por separado los efectos anti-miogénica de medio condicionado de los miotubos efectos atrofia que se pueden producir. Curiosamente, el defecto miogénica se recapitula en mioblastos primarios aislados de ratones caquécticos, incluso después de la expansión en medio de cultivo que no contiene suero de ratón o de medio condicionado. Es concebible que la exposición a un medio caquéctico impulsa la modificación epigenética persistente de loci implicados en la miogénesis que impidieron la expresión adecuada de proteínas necesarias para la diferenciación. La exposición a TNF, una citoquina con frecuencia asociado con la caquexia, se ha demostrado que induce la metilación de islas CpG dentro de la locus MyoD, y la histona transferasas metilarginina PRMT5 y WDR77 /MEP50 puede inducir la represión transcripcional de C /EBPb genes diana mediante la inducción de la dimetilación simétrica histona H4 de arginina 3 [62, 63]. Dado que los mioblastos primarios que carecen de C /expresión EBPb pueden diferenciar normalmente tras la exposición a medio caquexia inductor, C /EBPb es probable que requiere para el patrón de estas modificaciones epigenéticas propuestos. Si bien la diferenciación después del tratamiento con el medio PC-3 acondicionado se restaura con la pérdida de C /EBPb, el tamaño myotube, medida como el índice de fusión, no fue rescatado. Estos resultados sugieren que el tratamiento previo con un medio caquéctico antes de la diferenciación reduce la capacidad fusogénica de las células después de la diferenciación, incluso en medio normal. Como tal, además de conducir directamente la atrofia de las fibras maduras y la reducción de su diferenciación, caquexia también puede poner en peligro la fusión de células diferenciadas con éxito. Si bien la resección del tumor puede curar la caquexia, que aún se desconoce si las respuestas regenerativas se recuperan por completo o si un defecto persiste una vez que el entorno caquéctico se resuelve, y debe ser analizada más.
El defecto diferenciación después del tratamiento con PC-3 medio puede ser atribuido a un fallo para inducir myogenin completamente, que puede ser revertida por la pérdida de C /EBPb. En los mioblastos primarios, expresión de la proteína MyoD se redujo también por la exposición al medio caquéctico, pero no se observó en las células C2C12. De hecho, la expresión de C /EBPb es menor en C2C12 en comparación con los mioblastos primarios, y por lo tanto las diferencias en los niveles de C /EBPb después de la exposición a medio acondicionado puede en sí mismo explicar la sensibilidad diferencial de la expresión de MyoD en los dos sistemas [41]. C /EBPb puede inhibir la capacidad de MyoD de transactivar el promotor myogenin y la expresión de miogenina se downregulated consistente en todos los modelos probados, lo que sugiere que la interferencia con la función de MyoD como un posible mecanismo para la pérdida de expresión de miogenina en mioblastos pre-tratados con medio condicionado [ ,,,0],41].
expresión de la proteína MyoD es regulada negativamente por C /EBPb, sin cambios concomitantes a
MYOD1
niveles de ARNm [41]. Además, la proteína MyoD no podía ser rescatado con la inhibición del proteasoma [42]. Curiosamente, la pérdida de la expresión de C /EBPb no aumenta la expresión de MyoD en condiciones de control (SKOV3) en comparación con las células WT aunque en estos experimentos, la eficiencia de la diferenciación de los cultivos es de aproximadamente 80%, por lo que es más difícil de ver aumentos en la expresión del marcador miogénica . Sin embargo, en ausencia de C /EBPb después del tratamiento con PC-3 medio, nosotros observamos un aumento en la expresión de MyoD sobre la observada en los cultivos de WT, lo que sugiere que la pérdida del mecanismo inhibitorio C /EBPb está en juego en este sistema.
Mientras que la pérdida de la expresión de C /EBPb puede mejorar la diferenciación después de medio acondicionado pre-tratamiento, no queda claro si la inhibición de la miogénesis en la caquexia por cáncer contribuye a la patogénesis del síndrome. Desde caquexia también induce lesión muscular [50], la estimulación de la respuesta regenerativa se prevé que sea de protección, y, de hecho, muchos informes han demostrado que el fortalecimiento de la regeneración mejora la atrofia muscular visto en la caquexia [49, 50, 64]. Desafortunadamente, nuestros resultados muestran que esta respuesta es inhibida por la expresión de C /EBPb, potencialmente exacerbando la pérdida de masa muscular. No obstante, los mecanismos para estimular la miogénesis mejoran la histología muscular y la vida útil en modelos animales que sugieren que la promoción de la regeneración es una vía terapéutica importante para el tratamiento de la caquexia.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
mioblastos C2C12 y carcinoma de pulmón de Lewis (ATCC) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco). células de adenocarcinoma de próstata DU145 (ATCC) PC-3 y se cultivaron en RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 2 mM L-glutamina (Sigma). SKOV3 ovario adenocarcinoma colorrectal y carcinoma HCT116 se cultivaron en medio McCoy, MCF7 de adenocarcinoma de glándula mamaria se cultivaron en DMEM y el carcinoma de epitelio de pulmón A549 se cultivaron en medio F-12K, todo complementado con suero bovino fetal 10%.
Esquelético se aislaron células musculares mioblastos primarios como se describe [65]. Bajar los músculos las extremidades posteriores de ratones C57BL /6 hembra se diseccionaron y se sometieron a digestión con dispasa y colagenasa (Roche) a 37 ° C durante 1-2 horas hasta que se disociaron músculos.