Extracto
marcas de CD44 de las células madre similares a células en una serie de tipos de tumores, incluyendo el cáncer colorrectal (CCR), mientras que CD44 aberrante expresión transmite aumentó potencial tumoral, invasivo y metastásico. Los datos anteriores indican que CD44 es un objetivo directo de la represión transcripcional mediada por p53 en el cáncer de mama. Dado que la inactivación de
p53
mutaciones genéticas son eventos frecuentes en el CCR éstos podrían desencadenar la expresión de CD44. En el presente estudio, por lo tanto, exploramos la relación entre el
p53
estado mutacional y la expresión de CD44 en una cohorte de 90 CRC primarias localizadas y estudiado el efecto de la activación de p53 inducida por la radiación sobre la expresión de CD44. Curiosamente, se observó que, en contraste con el cáncer de mama, la pérdida de función
p53
mutaciones no se asociaron con la expresión de CD44 elevada en el cáncer de colon. Por otra parte, inducida por el daño de ADN activación de p53 no dio lugar a la represión de la expresión de CD44, ni en las células de cáncer de colon ni en las células epiteliales intestinales normales. Nuestros datos demuestran que la expresión de CD44 en las células epiteliales intestinales normales y malignos no está regulado por p53, lo que implica que la regulación de esta diana terapéutica potencialmente importante es el tejido y el tipo específico de cáncer
Visto:. Zeilstra J, Joosten SPJ, Vermeulen L, Koster J, Medema JP, Versteeg R, et al. (2013) Expresión de CD44 en el epitelio intestinal y el cáncer colorrectal es independiente del estado de p53. PLoS ONE 8 (8): e72849. doi: 10.1371 /journal.pone.0072849
Editor: Kanaga Sabapathy, Centro Nacional del Cáncer, Singapur
Recibido: March 1, 2013; Aceptado: July 15, 2013; Publicado: 29 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Zeilstra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido financiado por la Fundación holandesa del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
CD44 comprende una familia de moléculas de adhesión celular y que ejercen efectos pleiotrópicos sobre los procesos biológicos importantes incluyendo la proliferación, la supervivencia, la migración, la transición epitelial a mesenquimal (EMT), y la metástasis del cáncer de señalización (revisado por Zoller [1]) . En la mucosa intestinal, CD44 es un objetivo directo importante de la señalización de Wnt y se expresa de forma destacada en las células madre intestinales [2] - [4]. Hay pruebas de que CD44 está implicado en la iniciación y progresión de los tumores intestinales y el desarrollo de metástasis [1], [3], [5] - [9]. Además, la expresión destacada de CD44 es una característica de las células de CRC altamente tumorogénico [10]. De acuerdo con ello, se ha demostrado recientemente que
CD44
es parte de una firma genética de células madre intestinales que predice la recaída de la enfermedad en pacientes con CRC [11]. Esta firma se asoció específicamente con células CRC dotados de potencial de iniciar de alta tumor así como la capacidad de auto-renovación a largo plazo. Por lo tanto, CD44 representa una posible diana terapéutica para el tratamiento de CRC y por ello es importante entender los diferentes mecanismos que subyacen a la regulación de CD44. En la mayoría de los casos de CCR, la expresión de CD44 se incrementa como resultado de la desregulación de la señalización de Wnt /β-catenina [2], [12]. Sin embargo, existe una amplia evidencia de que otras vías y mecanismos aún no identificados contribuyen a la regulación de /β-catenina expresión del gen diana de Wnt en tumores intestinales [13]. La proteína p53 supresor de tumores es un factor de transcripción que juega un papel crítico en la supresión del cáncer. En respuesta al estrés oncogénico, tales como daño del ADN, la proteína p53 activada se une a sitios de ADN específicos de secuencia, regulando de este modo la transcripción de una amplia gama de genes diana implicados en el control del ciclo celular y la supervivencia de señalización [14]. la inactivación mutacional de la
p53
gen es un evento genético frecuente en la progresión de muchos tipos de tumores humanos, incluyendo el cáncer de mama y cáncer colorrectal (CRC) [15]. Recientemente se ha demostrado que la p53 transcriptionally reprime
CD44
expresión tanto en las células epiteliales mamarias normales y derivados del tumor mediante la unión directa a la
CD44
promotor [16]. Se observó que esta regulación dependiente de p53 de CD44 en ambas glándulas mamarias humanas y de ratón, lo que indica una función conservada evolutivo. Es importante destacar que se encontró la regulación por disminución de la expresión de CD44 a ser un requisito previo para la regulación del crecimiento dependiente de p53 y la inducción de la apoptosis en epitelio mamario [16]. Una interacción funcional similar entre p53 y CD44 también podría tener lugar en las células epiteliales intestinales y tumores. Para explorar si la expresión de CD44 es controlada por la proteína p53 en el CRC, se analizó una cohorte de carcinomas de colon primario para
p53
estado mutacional y la expresión de CD44. Nuestro estudio revela que la pérdida de función de p53 no está asociado con la expresión de CD44 elevada en CRC. Por otra parte, hemos demostrado que la activación de p53 de tipo salvaje es incapaz de reprimir la expresión de CD44 en células de cáncer de colon humano, así como en cultivos primarios de organoides criptas-vellosidades intestinales de ratón.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
el estudio que incluyó muestras de biopsias humanas se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y aprobado por el comité de ética local de la Universidad de Amsterdam, AIEC (Designación general Instellingsgebonden ethische Commissie). Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para la toma de muestras.
Las muestras tumorales, análisis de mutaciones de p53 y la expresión de genes de ensayo
La cohorte del estudio consistió en 90 pacientes en estadio II del AJCC CRC que se sometieron a cirugía curativa intencional en el Centro Médico académico (AMC) en Amsterdam, Países Bajos, en los años 1997-2006 [17]. fresca tejido tumoral congelado representante se cortó en secciones de 20 micras de espesor que fueron colocados de inmediato en el reactivo Trizol (Invitrogen Life Technologies, Breda, Países Bajos), después de lo cual se extrajo el ARN total. la carga tumoral se examinó de forma rutinaria por un patólogo experimentado.
p53
estado mutacional se determinó mediante RT-PCR. En resumen, 2 g de ARN total fue transcrito de forma inversa en un volumen de 25 l de reacción utilizando pdN6 (Amersham Biosciences, Roosendaal, Holanda) y la transcriptasa MMLV (Gibco BRL, Breda, Países Bajos). PCR se realizó en 1 l de molde de ADNc usando Taq polimerasa Platinum (Invitrogen Life Technologies). cebadores oligo se enumeran en la Tabla 1. Los productos de PCR se amplificaron por 35 ciclos de 45 s a 95ºC, 45 s a 60 ° C y 1 min y 30 s a 72 ° C, y se secuenciaron directamente utilizando el kit Big Dye Terminator (Amersham) junto con uno u otro sentido o un cebador oligo antisentido. Las secuencias fueron analizados utilizando el software CodonCode alineador (CodonCode Corp., Dedham, MA). los niveles de expresión de genes en los tumores se evaluaron utilizando el Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 gama plataforma (Affymetrix, Santa Clara, CA). ARN purificado se procesa, se hibridó, y analizan de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos fueron analizados utilizando el paquete de software R2 (http://r2.amc.nl), una aplicación de análisis de microarrays basada en web desarrollado por J. K. Los datos fueron normalizados MAS5 y los valores de expresión se transformaron log2. La significación estadística se evaluó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Probe conjuntos ensayados fueron:
CDKN1A gratis (
p21
), ID: 202284_s_at;
MDM2,
229711_s_at; y
CD44, España 209835_x_at. Otro ensayo de sonda fija
CD44
produjo resultados similares, por ejemplo; 204489_s_at,
P Hotel & lt; 0,01 y 210916_a_at,
P
. & Lt; 0,01) guía empresas
La inmunohistoquímica
tejido tumoral incluido en parafina se tiñó usando mAb de ratón primario anti-p53 humano (Dako, Glostrup, Dinamarca) y mAb primario de ratón anti-CD44 humano (VFF18) que reconoce CD44v6 [18]. La unión del anticuerpo se visualizó usando el sistema de detección Powervision poli-HRP (ImmunoVision Technologies, Daly City, CA) y DAB + (Dako). La intensidad (I) de la tinción se anotó en escalas semicuantitativos como sigue: "0", no hay reacción; "1", la reacción débil; "2", reacción moderada; y "3", fuerte reacción. El alcance de la señal se puntuó como porcentaje de células positivas (P). La puntuación global tinción se calcula multiplicando la intensidad por el porcentaje de células positivas (Puntuación = P * I; máximo = 300). Se utilizó la prueba exacta de Fisher para el análisis estadístico (
P Hotel & lt; 0,001).
Cell Culture, inmunotransferencia y la transcripción inversa-PCR
células RKO en tiempo real se cultivaron en medio 5A de McCoy supplementented con 10% de FCS hasta subconfluentes. Ratón pequeñas criptas intestinales se aislaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el comité local de ética animal de la Universidad de Amsterdam, DEC (de Dier ethische Commissie) y cultivadas durante una semana como se describe por
Sato et al
. [19]. Los cultivos se exponen a una dosis única de 10 Gy de una fuente de radiación
137Cs de rayos γ a una tasa de dosis de 0,8 Gy /min o incubadas con 500 ng /mL neocarcinostatina (NCS) o bien en combinación con 10 mM nutlin o no . Las células se recogieron en tampón de lisis en los puntos de tiempo indicados. Los anticuerpos utilizados para inmunotransferencia fueron anti-pan CD44 mAb Hermes-3 [20], anti-p21 mAb sx118 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y anti-p53 mAb DO-1 (Santa Cruz Biotechnology). ß-actina se utilizó como control de carga. En paralelo, el ARN total fue aislado utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA) y en tiempo real QRT-PCR se realizó como se describió anteriormente [3], [21]. Se utilizó un camino: el análisis de la varianza (ANOVA) para determinar cambios significativos (
P Hotel & lt; 0,05).
en el tiempo
Resultados
La pérdida de función de la mutación de p53 es no está asociado con niveles elevados de CD44 expresión en el cáncer de colon
La reciente identificación de p53 como un represor transcripcional de
CD44 Hoteles en cáncer de mama y el epitelio mamario [16], nos llevó a examinar si un funcional similar existe relación en el cáncer de colon y el epitelio intestinal. Por lo tanto, hemos examinado la relación entre el estado mutacional de p53 y
los niveles de ARNm de CD44
en una cohorte de 90 carcinomas colorrectales. Todos los tumores incluidos en este estudio fueron adenocarcinomas con la invasión a través de la capa muscular propia, pero sin ganglios linfáticos o metástasis a distancia (Dukes B, AJCC estadio II). estado mutacional se evaluó mediante secuenciación de ADNc de toda la región de codificación de la
p53
gen, que abarca los exones 1 a 11. El análisis de secuencia identificó 25 tumores (28%) con una mutación, dando lugar a una proteína p53 transcripcionalmente inactiva de acuerdo a la definición de Soussi et al. [22] (Tabla 2). La comparación entre los grupos de tipo salvaje y mutante
p53
reveló una significativa disminución de la expresión de ARNm de un doble objetivo canónica transcripcional de p53,
CDKN1A gratis (
p21
) (
P Hotel & lt; 0,01) [23] y
MDM2 gratis (
P Hotel & lt; 0,001) [24] en los tumores con
p53
mutaciones de pérdida de función ( Figura 1A y B). Curiosamente, a diferencia de los tumores mamarios en el que se encontró pérdida de la función de p53 que se correlaciona significativamente con elevada
CD44
expresión [16],
p53
mutación en carcinomas de colon se correlacionó con la disminución de
los niveles de expresión de ARNm de CD44
(
P Hotel & lt; 0,01; Figura 1C). Estos resultados implican que p53 no actúa como un represor transcripcional de
CD44
expresión en el CCR.
niveles de expresión génica relativa en
p53 mutante
y
p53
adenocarcinomas de tipo salvaje para (A)
CDKN1A gratis (
p21
) (**, P & lt; 0,01), (B)
MDM2 gratis (***,
P Hotel & lt; 0,001), (C)
CD44, España (**,
P
. & lt; 0,01)
Expresión de la proteína CD44 no se incrementa en Colón carcinomas con
p53
mutación
con el fin de confirmar que
p53
estado mutacional y los niveles de mRNA de
Hoteles en CD44 especímenes de cáncer de colon primario reflejan los niveles de proteína, se analizó la p53 y la expresión de CD44 por inmunohistoquímica en un subconjunto de los tumores (n = 15 /grupo). Las mutaciones en
p53
a menudo resultan en una estabilización inadecuada de la proteína y la acumulación nuclear [25]. De acuerdo, mientras que los tumores que albergan solamente de tipo salvaje
secuencias de genes p53
mostraron ninguna tinción ya sea para la proteína p53 o la tinción nuclear de células dispersas, los tumores que contienen un
p53
gen mutante mostraron una fuerte tinción nuclear de la mayoría de las células malignas (
P
& lt; 0,001, Figura 2A y B). Se observó la expresión de CD44 en la membrana celular de los tumores grandes, ya sea con la mayoría no mutada
p53 gratis (14 de 15) o mutado
p53 gratis (14 de 15) (Fig. 2A). Es importante destacar que no hubo diferencia significativa en la puntuación de tinción CD44 entre los tumores de ambos grupos (
P
& gt; 0,05; Figura 2B). Estos hallazgos demuestran que, aparte de en el cáncer de mama, la pérdida de la función de p53 en el cáncer de colon no está conectado con el aumento de expresión de la proteína CD44.
(A) secciones en serie de un carcinoma de colon sin y con una pérdida de la función p53 mutación (
es decir
., R175H, Tabla 2), se tiñeron para p53 y la proteína CD44 (barras indican 50 micras). (SEGUNDO). La inmunohistoquímica (IHC) La puntuación de p53 y la expresión de la proteína CD44, respectivamente (***,
P Hotel & lt; 0,001, ns = no significativo).
p53 no reprime
Hoteles en CD44 las células del cáncer de colon normal y epitelio intestinal
los resultados anteriores no excluyen la posibilidad de que la p53 de tipo salvaje puede (parcialmente) suprimir la expresión de CD44 en el epitelio intestinal normal y neoplásico tras la activación por el estrés genotóxico . Para hacer frente a esta posibilidad, a fin de determinar los efectos del daño inducido por la activación de p53 ADN sobre los niveles de CD44 en las células de cáncer de colon RKO humanos. Estas células expresan p53 de tipo salvaje y K-Ras y son diploides [26]. De particular interés, las células RKO también contienen tipo salvaje
APC
y
CTNNB1
genes y la falta constitutiva β-catenina /TCF mediada por la transcripción-4 [27]. Esto es de importancia ya que la regulación transcripcional de
CD44 fotos: por p53 podría estar enmascarada por la activación constitutiva vía Wnt, dando lugar a ß-catenina /TCF mediada-4
CD44
expresión. RKO células fueron expuestas a 10 Gy de radiación γ-después de lo cual la expresión de
CDKN1A gratis (
p21) y
CD44
y se analizaron por tiempo real QRT-PCR. Expresión de
c-MYC
, un objetivo directa de genes Wnt [28], [29] también se ensayó para controlar el mantenimiento de un estado estacionario de β-catenina /actividad transcripcional impulsado por TCF-4. Además, p53, p21, y los niveles de proteína CD44 se analizaron por inmunotransferencia. Como era de esperar, ionizante daño en el ADN inducido por radiación resultó en la estabilización de p53 (Figura 3A) y se observó la consiguiente transactivación de p21 en todos los puntos de tiempo (Figura 3A y B). Sin embargo,
de expresión de genes y proteínas CD44 CD44
niveles no disminuyó con el tiempo (Figura 3A y B), mientras que
c-MYC
niveles de mRNA se mantuvo estable (Figura 3B). Estos datos indican que p53 no es capaz de reprimir
CD44
expresión en células de cáncer de colon humano.
(A) Análisis de inmunotransferencia de p53, p21 y los niveles de proteína CD44 en las células de cáncer de colon RKO trató con ionizante radiación. Actina se utilizó como control de carga. Resultados (B) QRT-PCR que muestran niveles de expresión génica relativa de
CDKN1
A (
p21
),
CD44, España y
c-MYC
. Los datos representan la media ± SEM de experimentos por duplicado;. (*,
P Hotel & lt; 0,05 en comparación con t = 0).
Para extender nuestras observaciones al epitelio intestinal normal, junto investigado la respuesta a CD44 activación de p53 en las células epiteliales que recubren el eje cripta-vellosidad del intestino delgado de ratón. Para este fin, se emplearon
in vitro
de ratón en cultivo epiteliales intestinales organoides criptas-vellosidades [19]. Organoides que comprenden múltiples dominios de las criptas (Figura 4A) se expusieron a 10 Gy de radiación γ-después de lo cual
Cdkn1a
,
Cd44
, y
c-Myc
los niveles de expresión de mRNA se analizada por tiempo real QRT-PCR. Al igual que en las células RKO,
Cdkn1a
niveles de mRNA se incrementaron en los organoides en respuesta a la radiación ionizante (Figura 4B). Estos resultados son consistentes con estudios previos sobre la activación de p53 inducida por la radiación en el compartimento de cripta de ratón [30].
Cd44
la expresión de ARNm no se modificó significativamente después de exposición a la radiación, mientras que los niveles de expresión
c-Myc
se mantuvo estable (Figura 4B). Del mismo modo, la inducción química de la activación de p53 usando NCS también dio lugar a un aumento de los niveles de
Cdkn1a
ARNm. incubación simultánea con el agente de estabilización de p53 nutlin más elevada
Cdkn1a
niveles de mRNA. En ambas condiciones
Cd44
la expresión de ARNm no se alteró significativamente, mientras que
c-Myc
niveles de expresión se mantuvo (Figura 4C) .Estos resultados estables confirman nuestros hallazgos en las células RKO humanos y en el colon primaria carcinomas, y demostrar que
CD44
la expresión génica no está regulada por p53 en las células epiteliales intestinales normales y transformadas.
(a) cripta-vellosidad organoid después de una semana de cultivo. Las flechas indican los compartimentos de cripta (B) QRT-PCR resultados que muestran los niveles de expresión génica después del tratamiento de radiación para el
Cdkn1a
,
Cd44, España y
c-Myc.
Datos representan la media ± SEM de experimentos por duplicado; (*,
P
& lt; 0,05 en comparación con t = 0). (C) QRT-PCR resultados que muestran los niveles de expresión génica después del tratamiento con NCS solos o NCS más nutlin para
Cdkn1a
,
Cd44
y
c-Myc gratis (*,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P
. & lt; 0,01 en comparación con t = 0)
Discusión
La identificación de p53 como un represor transcripcional de la expresión CD44 en cáncer de mama [16] nos llevó a investigar la relación entre
p53
estado mutacional y la expresión de CD44 en el cáncer de colon. Se demuestra que, aparte de en el cáncer de mama,
CD44
mRNA y los niveles de proteína están no aumentó en los carcinomas de colon con la pérdida de p53 funcional, en comparación con los tumores sin
p53
mutaciones (Figura 1C, 2B ). Además,
CD44
expresión tanto en el epitelio intestinal normal y neoplásico no se vio afectada por la activación química o radiación mediada por p53, lo que indica que p53 no funciona como un represor transcripcional de
CD44 Hoteles en células epiteliales intestinales.
la diferencia observada entre el tejido específico de mama y de colon en la regulación transcripcional de
CD44
podrían explicarse por la complejidad de la función de p53. Se requieren al menos dos características de la proteína p53 para su función de regulación de genes: p53 tiene que reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN en el promotor del gen diana y p53 debe reclutar varios co-reguladores de la transcripción (revisado por Laptenko y Prives [14 ]). La
CD44
promotor contiene una secuencia de p53 no canónica de unión [16], sin embargo, múltiples interacciones con co-activadores y co-represores, así como con los componentes de la maquinaria transcripcional general dictan su capacidad para dirigir promotor activación [14]. Por ejemplo, las interacciones con ASPP1, BRCA1 o PTEN, o la actividad coordinada de ambos p63 y p73, se han identificado como factores determinantes que las respuestas específicas directos [14], [31]. por lo tanto, diferencias en la expresión y la actividad de estos co-reguladores entre mama y el epitelio intestinal podrían contribuir a un papel divergente para p53 en el control transcripcional de la
CD44
de genes en células de la mama y el epitelio de colon y cáncer. Además, p53 puede sufrir varios tipos de modificación post-traduccional, incluyendo la fosforilación, acetilación y ubiquitinación [32], que pueden dirigir la selección promotor [33]. Por lo tanto, la función de p53 depende de una regulación compleja y apretado, y modificaciones o las interacciones de células específicas puede explicar su incapacidad para reprimir CD44 en las células epiteliales intestinales. Nuestra conclusión de que la expresión de CD44 en los carcinomas normales del epitelio intestinal y de colon es independiente de la expresión de p53 y p53 estado mutacional es de importancia para la comprensión de la patogénesis de la CRC y puede tener importantes implicaciones terapéuticas. CD44 expresión aberrante es ventajoso para el crecimiento, la supervivencia y la diseminación de las células tumorales [1]. En CRC estas funciones biológicas de CD44 se extienden más allá de su capacidad para antagonizar las funciones de pro-apoptóticos y citostáticos de p53 [16], [34]. Esto puede, al menos en parte, explicar el papel limitado de p53 en la modulación del fenotipo inmediata de adenomas intestinales recién formados [35]. Además, varios estudios han demostrado que el CD44 es un marcador robusto con importancia funcional de las células madre de cáncer de colon [10], [11], [36] - [38]. Estas células se cree que son relativamente resistentes a la terapia y responsable de tumor-propagación, lo que hace CD44 una diana atractiva para el tratamiento dirigido de células madre de cáncer, independiente de p53.