evidencia
Extracto
El aumento indica que diversos tipos de células del cáncer son capaces de producir IgG. La función exacta de IgG derivados del cáncer ha, sin embargo, no se ha dilucidado. Aquí hemos demostrado la expresión de genes de IgG con V (D) J recombinación en 80 casos de cáncer colorrectal, líneas celulares de cáncer de colon y 4 un tumor teniendo modelo de ratón inmunodeficiente. expresión de IgG se asocia con la diferenciación tumoral, el estadio pTNM, la afectación ganglionar y la infiltración inflamatoria y positivamente correlacionada con la expresión de ciclina D1, NF-kB y PCNA. Además, se investigó el efecto de IgG derivados del cáncer en los comportamientos malignos de células de cáncer colorrectal y puso de manifiesto que el bloqueo de IgG dio como resultado un aumento de la apoptosis y negativamente afectado el potencial para la formación de colonias de anclaje independiente y la invasión de células de cáncer. Estos hallazgos sugieren que la IgG sintetizada por células de cáncer colorrectal está involucrado en el desarrollo y crecimiento del cáncer colorrectal y de bloqueo de IgG puede ser una terapia potencial en el tratamiento de este cáncer
Visto:. Niu N, Zhang J, Huang T , Sun Y, Chen Z, Yi W, et al. (2012) Expresión de IgG en el cáncer colorrectal humano y su relación con los comportamientos celulares de cáncer. PLoS ONE 7 (11): e47362. doi: 10.1371 /journal.pone.0047362
Editor: Georgina L. Hold, Universidad de Aberdeen, Reino Unido
Recibido: June 9, 2012; Aceptado: September 11, 2012; Publicado: 1 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Niu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la joven y científicos de investigación Premios Fundación de mediana edad de la provincia de Shandong (núm BS2011SW051), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China a NN (Nº 81100885). Los autores también reconocen la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para JG (Nº 30971150). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Recientemente, varios informes han sido publicado que describe la expresión de inmunoglobulinas en células no linfoides incluyendo varios sarcomas y carcinomas [1] - [4]. Antes de estos informes, las inmunoglobulinas siempre habían sido conocidos por ser producida exclusivamente por los linfocitos B. IgG se ha detectado en el tejido de cáncer de colon de unos pocos casos y el fragmento de región constante de IgG se ha visto en un par de líneas celulares de cáncer de colon. Con un anticuerpo contra CA215, que era una parte de inmunoglobulinas expresadas por las células de cáncer de ovario, Lee et al detectó IgG de cadena pesada de las regiones constantes en los tejidos de cáncer de colon con una relación positiva de 44% [1], [5]. En 2003, Qiu et al demostraron expresión de IgG en los tejidos de 6 casos de cáncer colorrectal (CRC) y en una línea celular de carcinoma de colon (HT29) [3]. Con RT-PCR, Kimoto y col detectó IgG de cadena pesada de la región constante de una línea celular de cáncer de colon SW116 [2].
In vitro
estudio con una línea celular de carcinoma de colon HT 29 inducida con asODN sugirió que el cáncer derivado de IgG suprime la apoptosis [6], que está en consonancia con los resultados de Lee et al [1] y Qiu et al [3] que mostró inhibición del crecimiento tumoral con una línea celular de carcinoma en animales y en experimentos in vitro. Estas observaciones dan lugar a la hipótesis de que el cáncer derivado de IgG promueve el crecimiento del cáncer de colon y este es el enfoque del presente estudio
Hasta el momento, la relación entre la expresión de IgG y las características clinicopatológicas y marcadores biológicos [7]. - [9] asociado con el pronóstico y respuesta al tratamiento en el CRC no se ha investigado. En este estudio, lo primero que investigó la expresión de IgG en el tejido de 150 casos de CCR y analizó la correlación de expresión de IgG y varias características clínico-patológicos y biológicos. A continuación, la producción de IgG se confirmó en cuatro líneas celulares de CRC en proteínas y los niveles de ARNm. Se detectaron varios regiones de IgG cadenas pesada y ligera y las enzimas esenciales para la síntesis de IgG en las muestras. Los efectos de la IgG en los comportamientos biológicos malignos, como la proliferación, la formación de clones, la invasión y la apoptosis se investigaron con los experimentos de neutralización de anticuerpos y la inhibición de siRNA. Los resultados permiten conocer nuevos papeles clínico-patológicas de cáncer derivado de IgG en el CCR y fortalecer los fundamentos para el desarrollo de terapias que se dirigen cáncer derivado de IgG.
Materiales y Métodos
, tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina de 150 casos que habían sido tratadas /analizadas para CRC y los especímenes emparejados normales de la mucosa colorrectal (utilizados como controles negativos) y veinte muestras de biopsias frescas de adenocarcinoma colorrectal se recogieron del hospital Afiliado de la Universidad médica de Weifang. pTNM etapa se realizó según el sistema de clasificación TNM del AJCC /UICC [10]. Diferenciaciones de los cánceres se calificaron así /moderada o pobre. infiltración inflamatoria se evaluó de acuerdo con los criterios para la inflamación crónica (infiltración de células mononucleares) describió anteriormente [11]. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de la Universidad Médica de Weifang y el consentimiento por escrito se obtuvo de los pacientes
Las líneas celulares
CRC líneas celulares humanos de diferentes diferenciación (moderadamente diferenciado, HT29 y SW480.; pobremente diferenciado, LOVO y HCT116) [12] y Raji (línea de células B de leucemia linfocítica como control positivo), Jurkat (línea de células T leucemia linfocítica como control negativo) fueron adquiridos de ATCC (12 de junio de 2008). CRC líneas celulares se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal ultrabajo-IgG (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) y en DMEM sólo 12-24 horas antes del experimento.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica ( IHC) se realizó sobre la CRC e igualó los tejidos marginales con controles apropiados como se describe anteriormente [13], [14]. Los detalles de anticuerpos primarios de inmunoglobulina de la cadena γ (Igγ), inmunoglobulina κ cadena (Ig), CEA (antígeno carcinoembrionario), CD16 (FcyR III), CD32 (FcyR II), CD64 (FcyR I), P53, PCNA, Bcl-2 , MMP-2, NF-kB, y ciclina D1 se enumeran en la Tabla S1. Suero normal de cabra sustituido para el anticuerpo primario se utilizó como controles negativos. Doble etiquetado de IgG y de NF-kB o ciclina D1 o PCNA en células de cáncer se llevó a cabo como se describe anteriormente [15].
inmunorreactividad de puntuación
Las secciones teñidas se examinaron y se puntuaron de forma independiente por 2 de los autores (NN y WY) sin información de los datos clínico-patológicos. La evaluación se realizó en cinco regiones de cáncer seleccionados al azar con un aumento de 400 ×. Los niveles de expresión de IgG en las células cancerosas se basan en la suma de la puntuación del porcentaje de células positivas (calificaron como: 0 = & lt; 5%, 1 = 5 a 25%, 2 = 25 a 50%, 3 = & gt; 50%) y el de la intensidad de la tinción (evaluado como: 0, ausencia de señal; 1, la luz roja o rosa; 2, de color rojo, y 3, de color rojo oscuro). Los casos con puntuaciones de 0-3 fueron etiquetados como "débilmente teñida" y los casos con 4-6 como "fuertemente manchado '. proteínas localizadas-nucleares se obtuvieron únicamente en función de su porcentaje positivo en las células del cáncer [16]:. & lt; 25% se agrupó como "negativo", ≥25% se agrupó como "positiva"
preparación
sonda de cRNA y hibridación in situ
La longitud apropiada de la sonda para ISH era de 300-500 pb, y las regiones constantes de la cadena κ y λ era demasiado corta para ser eficaces sondas. Por lo tanto dos sondas antisentido de ARNc específicas dirigidas contra la inmunoglobulina G1 humana de cadena pesada (IGHG1) se prepararon y se realizó la hibridación in situ (ISH) como se describe anteriormente [4], [17]. los tejidos y los tejidos de los nódulos linfáticos en la pared colorrectal amígdalas se utilizaron como control positivo, y se desliza tejido de las amígdalas incubaron con sondas sentido o tejido CRC se incubaron con una sonda no relacionada se emplearon como controles negativos.
tándem corto repetir el análisis análisis FODA
Breve repetición en tándem (STR) de las líneas celulares de CRC se realizó por vía terrestre · HUAGENE BIOCIENCIAS CO., LTD (Guangzhou, china) usando el sistema PowerPlex 16 HS (Promega).
citometría de flujo
Para la detección de IgG, citometría de flujo con HT29, SW480, HCT116, se realizaron las líneas de células LOVO como se describe anteriormente [3]. Igγ monoclonal de ratón anti-humano (1:500, Sigma) y de cabra marcado con FITC anti-IgG de ratón (1:100, Jackson, West Grove, PA, EE.UU.) se utilizaron como los anticuerpos primarios y secundarios. línea de células Raji se utilizó como control positivo. FITC-CD19 (Sigma) se utilizó para comprobar la posible contaminación por los linfocitos B.
inmunofluorescencia doble tinción
La inmunofluorescencia (IF) doble tinción con Igγ y Ig se realizó en líneas celulares como se describió anteriormente [4], [13]. De cabra anti-IgG de conejo-TRITC (1:100, Jackson) o de cabra anti-IgG de ratón-FITC (1:100, Jackson) se utilizó como anticuerpo secundario. IgG de ratón normal y la IgG de conejo normal (Santa Cruz) se utilizaron en lugar de los anticuerpos primarios. DAPI (señal azul) (1:500; Sigma) se utiliza para visualizar los núcleos
RT-PCR
ARN total fue aislado de las líneas de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad,. CA, EE.UU.). RQ1 RNasa libre de DNasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) se utilizó para el tratamiento de las muestras de ARN para excluir la contaminación de ADN genómico. Cinco g de ARN total extraído se transcribe de forma inversa con oligo (dT)
18 imprimación (Fermentas, Burlington, Ontario, Canadá) usando superíndice III transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
PCR fue llevado a cabo con lA Taq polimerasa (Takara, Dalian, china). cebadores específicos para IGHG1, la región tercera determinantes de complementariedad (CDR3) del gen de la cadena pesada (que incluye la secuencia VDJ), constante (Ig) y la región variable (VK) de Ig, la región constante de Igλ (Igλ), Iγ-Cγ transcripciones de la línea germinal estériles (Iγ-Cγ), la activación inducida por la citidina deaminasa (AID), la recombinación gen activador de -1 y 2 (RAG1 y RAG2) fueron los mismos como se describe anteriormente [3], [4]. CD19 se amplificó para excluir la contaminación por los linfocitos y β-actina se amplificó como referencia interna [3]. Los detalles de los cebadores se enumeran en la Tabla S2. Identificación del producto de PCR se confirmó mediante secuenciación de ADN y voladura.
microdisección de captura por láser (LCM) asistida RT-PCR
LCM asistida RT-PCR se realizó en 20 casos de CCR quirúrgico recién congelado muestras como se describe anteriormente [4]. IGHG1, Ig, el segmento de recombinación CDR3, CD19 y β-actina se amplificaron con los mismos cebadores como, por RT-PCR. Los linfocitos de nódulos linfáticos en la pared del colon se emplearon como control positivo, y se utilizó agua en lugar de la plantilla de cDNA como un control negativo. Las muestras con CD19 detectable fueron excluidos de los experimentos posteriores.
Western blot y siRNA baja regulación
Las proteínas de citosol de cuatro líneas celulares humanas CRC (40 g /carril) se analizaron con SDS al 10% -PAGE (Igγ en condiciones no reductoras y Ig en condiciones reductoras). IgG de suero humano estándar (0,02 g /carril, Sigma) se utilizó como control positivo. Cabra Igγ anti-humano (1:2500; Sigma) o el ratón anti-humano Ig (1:2000, Abcom) se utilizaron como los anticuerpos primarios
siRNA (5'-CCAAGGACACCCUCAUDAUTT-3 ', 5. '-AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT-3') fue diseñado de acuerdo a la región constante de cáncer derivado de IgG y se transfectaron en células LOVO con X-tremeGene SiRNA reactivo de transfección (Roche, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una secuencia aleatoria se empleó como control negativo. Efectividad de IgG abajo de la regulación se verificó con Western blot.
Los estudios en animales
LOVO células cultivadas (5 × 10
6) fueron inoculados sc en las axilas frontal izquierda de la inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Cincuenta sangre l se obtuvo de la vena del ojo utilizando tubos capilares en el 0 ª, 7, 14 y 21 días después de la inoculación. 1 suero l se analizó con 10% SDS-PAGE bajo condiciones con los mismos anticuerpos no reductor como se describe anteriormente. Al día 21, los tumores se cosecharon y H & amp;. E tinción, IHC e ISH se realizaron en secciones de tejido
La proliferación celular y análisis de apoptosis
A ensayo de proliferación celular MTS (CellTiter 96 AQ Uno Cell Solución Ensayo de proliferación de Kit, Promega) se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió anticuerpo de ratón Igγ anti-humano (10 a 1000 nM, Sigma) al medio de cultivo libre de suero y se incubaron durante 48 h y se analizó OD490 [18]. anticuerpo de ratón anti-humano IgM (cadena μ específica, 10-1000 nM, Sigma) se utilizaron como control negativo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La neutralización de anticuerpo IgG con conejo anti-IgG de ratón se realizó con concentraciones crecientes (0 a 1000 nM) de conejo anti-IgG de ratón añadido al sobrenadante inmediatamente después de la adición de 100 nM de ratón Igγ anti-humano.
para el análisis de apoptosis, las células fueron incubadas CRC durante 48 h en medio de cultivo libre de suero con 100 nM de IgG y se analizaron con el kit de Anexina V-PI (Enfermedad humana Universidad de Pekín Genómica del Centro de Investigación, Pekín, china) como se describe anteriormente [3]. IgM de anticuerpos (100 nM, Sigma) se utilizó como control negativo. células LOVO transfectadas por siRNA también se investigó la propiedad de proliferación y apoptosis como se describe anteriormente.
ensayo de agar blando en la formación de clon
ensayo de agar suave se llevó a cabo como se describe anteriormente [19]. Igγ ratón anti-humano (100 nM, Sigma) y se utilizó anticuerpo IgM anti-humano (100 nM, Sigma) o PBS en lugar del anticuerpo Igγ se utilizaron como controles.
ensayo de invasión celular
ensayo de migración celular de modificación se realizó con células LOVO y anticuerpo IgG 100 nM de ratón anti-humano (Sigma) como se describe anteriormente [20]. La membrana se tiñó con H & amp; E. Cinco campos al azar por membrana se fotografiaron con un microscopio BX51 (Olympus) en × 400 aumentos. Las células invadidas se contaron y números medios se calcularon para cada membrana. También se examinaron las células LOVO transfectadas por siRNA.
El análisis estadístico
diferencia en la expresión de IgG entre las muestras normales de la mucosa y los tumores primarios, diferencia en la expresión de IgG entre las diversas características clinicopatológicas y la correlación entre IgG expresión y las diferentes variables biológicas relacionadas con el cáncer se probaron utilizando la χ
2 test. los valores de dos caras p de menos del 5% se consideraron estadísticamente significativas. La mayoría de los cálculos se realizaron con el programa SPSS 12.0.
Resultados
Expresión y distribución de la proteína IgG y su ARNm en el tejido CRC
humana
En todos los casos investigados, tanto Igγ y Ig se detectaron principalmente en el citoplasma de las células cancerosas y linfocitos B en el estroma (Figura 1A-e), y también en el tejido conectivo mesenquimales (pero no el músculo liso) de tejidos de cáncer (Figura 1A, e). Co-expresión de CEA con IgG y su ARNm se detectó en las secciones de tejido consecutivos (Figura 1A). En las muestras de mucosa normal correspondiente, IgG no fue detectable en el epitelio glandular (Figura 1B). Igγ se expresó débilmente en 83 (55,3%) y fuertemente expresada en 67 (44,7%) de los 150 adenocarcinomas. receptores de IgG solamente se detectaron en las células inflamatorias del estroma, pero no en las células de cáncer de
A:. Co-expresión de CEA, la proteína IgG y mRNA IGHG1 en las células de CRC. B-D: La expresión de IgG (señales rojas) en el tejido normal del colon (B), bien diferenciado (C) y pobremente diferenciado (D) CRC. E: Expresión de la IgG en las células de cáncer de nidos (flechas) que se infiltran en la capa profunda del músculo de la pared del colon. El nivel de expresión de IgG es mayor en la infiltración de células cancerosas (E) que en las células cancerosas del tumor "primario" se muestran en D. F: nidos de CRC (CRC) y los ganglios linfáticos (LN) antes y después de LCM. G: electroforesis en gel de agarosa de amplificación por RT-PCR de células de CRC microdissected y los ganglios linfáticos. H: Co-localización de la proteína IgG expresada en el citoplasma (señal roja) y (señales de color púrpura-azul) Ciclina D1 (panel izquierdo), NF-kappa B (panel central) y PCNA con localización nuclear (panel derecho). ML: capa muscular. Bares = 50 micras (A-E, G), 20 micras (F).
En el adenocarcinoma, la expresión de IgG fue diferente entre los grados de diferenciación. En general, sólo unas pocas células cancerosas aisladas (& lt; 25%) resultaron positivas en los adenocarcinomas bien diferenciados (Figura 1C), mientras que más células cancerosas individuales o agrupados queridos fueron positivos en los adenocarcinomas moderadamente diferenciados, y la mayoría de las células cancerosas (& gt; 50% ) fueron positivos en los adenocarcinomas pobremente diferenciados (Figura 1D). En los nidos de cáncer que se infiltran en la capa muscular más profunda, la relación positiva fue mayor y la intensidad de la tinción más fuerte que en las células cancerosas no se infiltran ubicados en la mucosa (Figura 1E y D).
IgG mRNA (IGHG1 ) era detectable en el citoplasma de las células cancerosas con la hibridación in situ (Figura 1A, panel de la derecha; Figura S1 a). La especificidad de las sondas y la rigurosidad de ISH estaba bien establecida con 2 pares de sondas (sentido y antisentido) para diferentes regiones de la región constante de IgG y una sonda no relacionada al azar. Todas las 2 sondas antisentido dieron completamente identitical en la distribución e intensidad de las señales positivas. En el control positivo, los nódulos linfáticos de la pared colorrectal (Figura S1 B), IGHG1 se encuentran en el citoplasma de los linfocitos B. En los controles negativos (sonda aleatoria aplicada a los tejidos de CRC y sentido sondas aplicadas a tejido de las amígdalas), no hay señal positiva se detectó (Figura S1 C y D). Todos los casos dieron positivo para IgG inmunotinción también fueron positivos para IGHG1 ARNm hibridación in situ. La presencia de IgG mRNA también se confirmó con LCM asistida RT-PCR (Figura 1F y G). IGHG1 y Ig eran amplificados con éxito tras el aislamiento de las células de cáncer de CRC muestras congeladas. Todos los veinte muestras dieron positivo. Por otra parte, CDR3, incluyendo la secuencia de V-D-J, también fue amplificado con éxito de estas muestras. No hay transcripciones CD19 fueron detectables, con lo que, con exclusión de la contaminación de linfocitos B. CD19, IGHG1, Ig, y CDR3 fueron amplificados de las muestras de control positivas. No banda era detectable cuando se usó el control negativo.
Correlación de la expresión de IgG con características clinicopatológicas y biológicas de CRC
Tabla 1 muestra la correlación de la expresión de IgG en las células cancerosas primarias con los diversos clinicopathological variables. Hubo una mayor frecuencia de fuerte expresión de IgG en el adenocarcinoma pobremente diferenciado (67,3%) que en las más diferenciadas (bien y moderadamente diferenciado, 33,7%; p = 0,035). la expresión de IgG no mostró diferencias significativas entre las etapas individuales pTNM (P = 0,091). Sin embargo, cuando se comparó la expresión de IgG en la etapa I-II con neoplasia que en la etapa III-IV, el último tuvo una mayor frecuencia de fuerte tinción que lo hizo la primera (59,7 vs. 32,5%, P = 0,027). Cuando cánceres con infiltración inflamatoria débil se compararon con aquellos con fuerte infiltrado inflamatorio, había una tendencia para que los primeros tienen una mayor frecuencia de fuerte tinción que el segundo (49,5 vs. 33,3%, P = 0,041). En términos de puesta en escena de los ganglios linfáticos, el CRC de la etapa N
1 y N
2 ocuparon una proporción significativamente más alta de IgG-positivos (54,8, 63,9 vs 32,5%, P = 0,042). No hubo correlación significativa de la expresión de IgG con la edad, el género, la ubicación del cáncer o patrón de crecimiento (todos p & gt; 0,05) guía empresas
La Tabla 2 presenta la relación entre la expresión de IgG y las expresiones de varios marcadores biológicos.. expresión IgG mostró correlación positiva con las expresiones de la ciclina D1 (P = 0.046), NF-kB (P = 0,019), y PCNA (P = 0,037), y una correlación negativa con la expresión de Bcl-2 (P = 0,041), y no hay correlación significativa con la expresión de MMP-2 y p53 (tanto P & gt; 0,05). Co-localización de ciclina D1, NF-kB o PCNA (tinción nuclear) e IgG (tinción citoplasmática) se estableció claramente con doble inmunotinción (Figura 1H).
Expresión de la proteína IgG y su ARNm en líneas celulares de CRC
las identidades de las líneas celulares de CRC empleadas fueron verificadas con la prueba de STR y los perfiles de confirmación mostraron 100% con las proporcionadas por la ATCC (Figura S2 a y B). La concentración de IgG en ultrabaja-IgG FBS para el cultivo celular se confirmó que era 2,3 ± 0,9 g /ml, suficientemente bajas para el experimento. expresión de la proteína IgG se demostró en las cuatro líneas celulares de CRC con IF. Co-expresión de Igγ y Ig también se confirmó (Figura 2A). Igγ y Ig se localizaron principalmente en el citoplasma, y parcialmente en los núcleos de las células cancerosas. No se detectó ninguna señal de IgG en las células Jurkat
R: Igγ y Ig se detectan en las cuatro líneas de CRC por inmunofluorescencia doble tinción. (Igγ, TRITC; Ig, FITC, se fusionan, de color amarillo.). Bares = 50 micras. B: Porcentaje de células positivas de IgG en Raji, HT29, SW480, y LOVO. C: electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación RT-PCR. R, DNasa tratada RNA como plantilla; C, el ADNc como plantilla. D: detección de IgG mediante Western blot en las cuatro líneas celulares. E: proteína y ARNm de IgG se detectan con IHC e ISH en tumores recogidos en 21 días a partir de células LOVO en ratones SCID. IgG es detectable en el suero en el día 7, 14 y 21.
La contaminación de los linfocitos B se descartó el uso de marcado con FITC inmunotinción de CD19 (Figura S2 C). El porcentaje de células positivas de IgG se determinó por FACS con anticuerpos Igγ. El porcentaje de células positivas de IgG fue 75,2%, 20,04%, 24,4%, 39,54% y 30,91% en Raji, HT29, SW480, LOVO y las líneas celulares HCT116, respectivamente (Figura 2B). El porcentaje de células IgG-positivo promedio de HT29 moderadamente diferenciado y líneas de células SW480 (22,22%) fue menor que la de las líneas de células poco diferenciadas LOVO y HCT116 (35.23%, p = 0,043).
En la RT-PCR , la sensibilidad y especificidad estaban bien establecidos en varios experimentos. En primer lugar, se utilizó DNasa libre de RNasa para eliminar el posible efecto de ADN genómico. CD19 se amplificó para descartar la posible contaminación de los linfocitos B. En segundo lugar, se investigaron varias regiones de IgG cadenas pesada y ligera y las enzimas esenciales para la síntesis de IgG. En tercer lugar, se emplearon extensas controles positivos y negativos para la misma amplificación. Forth, todos los productos amplificados fueron secuenciados y la identitied de los productos amplificados se confirmaron. Uso de transcripciones RT-PCR, IGHG1, Ig, VK, Igλ y Iγ-Cγ se detectaron en las cuatro líneas celulares, con las intensidades de las bandas positivas que son más débiles que las de las células Raji. Por otra parte, CDR3, incluyendo el V (D) J secuencia de recombinación y RAG1 y RAG2 se detectó también, mientras que la ayuda se detectó sólo en LOVO y líneas celulares HCT116 (Figura 2C y la Figura S1e).
Cuarenta (40) g de proteína total se extrajo de cada línea celular. La proteína total se ejecuta en un gel de transferencia Western y se hizo reaccionar con anticuerpo de IgG. Una banda en el mismo peso molecular, pero con menor intensidad que, se detectó la banda obtenida con 0,02 g de IgG humana (Figura 2D). Cuanto mejor se diferenciaron las líneas celulares, menos de IgG se expresó. En condiciones reducida, se detectaron bandas de Ig a 25 KD en HT29, SW480, LOVO y líneas celulares HCT116. De manera similar a las observaciones de Huang et al [21], también se detectó una banda adicional a 23 KD en HT29, líneas celulares SW480, y LOVO. Las cantidades de Ig eran menores que los de IgG en suero estándar.
expresión y secreción de IgG en portadores de tumores ratones SCID
Al día 21 después de la inoculación de las células LOVO cultivadas en los ratones SCID, la se recogieron los tumores. El tumor consistió en células cancerosas en clúster con los bordes de celda indistintas y sin estroma. Todas las células cancerosas fueron IgG positiva, con señales positivas granulares en el citoplasma. La distribución de IGHG1 mRNA detectado con hibridación in situ fue similar a la de la proteína IgG detectado por IHC (Figura 2E).
SDS-PAGE mostró que a medida que el cáncer se hizo más grande, se detectaron bandas significativamente más fuertes de IgG humana en el suero de ratones SCID (Figura 2E).
el bloqueo de los derivados del cáncer IgG afecta a los comportamientos biológicos de células CRC
en comparación con los controles negativos (suero de ratón e IgM anti-humano) , IgG anti-humano mostró un aumento significativamente la inhibición de la proliferación de células LOVO, especialmente a las concentraciones de 100 y 1000 nm (Figura 3A). Para el experimento siguiente, elegimos 100 nm como la concentración más eficaz. Como conejo anti-IgG de ratón puede impedir la unión de IgG de ratón anti-humano de moléculas de IgG humanos como consecuencia de impedimento estérico [22], se puede utilizar para antagonizar los efectos de IgG anti-humano. El tratamiento con anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón disminuyó de manera efectiva la inhibición del crecimiento de células de cáncer de ratón anti-IgG humana (Figura 3B)
A:. MTS con una serie de concentraciones de IgG anti-humano (10 a 1.000 nM ) de anticuerpos. B: El tratamiento con anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón aumenta las tasas de apoptosis en células LOVO. C: apoptótica porcentaje de células LOVO es más alta después de la incubación con el anticuerpo IgG que con anticuerpo IgM o suero de ratón. D: El bloqueo de cáncer derivado de los resultados de IgG en los cambios morfológicos. E: anticuerpo IgG disminuye el crecimiento maligno de anclaje independiente de las células CRC. F: El bloqueo de la IgG derivada de cáncer suprime el potencial de invasión de las células de CRC. Bares = 50 micras.
El análisis de la apoptosis (Figura 3C) mostró que el tratamiento con el anticuerpo IgG dio lugar a una mayor tasa de células apoptóticas LOVO (40,16%) en comparación con los tratados con el anticuerpo IgM (13,7% , P = 0,0364) o suero de ratón (10,9%, P = 0,0417).
características morfológicas de las células LOVO también se vieron afectados por el tratamiento con anticuerpo IgG (Figura 3D). Cuando se incubaron con anticuerpo anti-IgM (100 nM), las células LOVO crecieron ligeramente mientras que el desarrollo de varios procesos celulares. En contraste, se incubaron con anticuerpo anti-IgG (100 nM), las células se convirtieron en LOVO redonda con mucho menos número de procesos celulares y mostraron un patrón de crecimiento orientado cluster-limitado.
análisis agar blando mostró que LOVO células de cáncer de co -cultured con el anticuerpo anti-IgG humana se hizo más lenta y genera colonias significativamente más pequeños, que no eran transparentes y tenían bordes de las celdas borrosas, que los de las mismas células cancerosas LOVO tratados con el anticuerpo IgM anti-humano (Figura 3E). El tratamiento con PBS en lugar de anticuerpo IgG dio resultados similares a los que se trató con anticuerpo IgM anti-humano. El número medio de la formación de colonias en las células LOVO tratados con IgG anti-humana (23,7 ± 5,2 /35 mm avión) fue significativamente menor que la de las células LOVO tratados con anticuerpo IgM (46,1 ± 3,2 /35 mm avión, P = 0,0374).
el ensayo de invasión celular demostró que el número medio de células invadidas fue menor en las células LOVO incubadas con anticuerpo IgG anti-humana (32,3 ± 3,9) que en las incubadas con el anticuerpo IgM (116,5 ± 5,2, P = 0,0293) (Figura 3F).
Efecto de IgG interferencia en los comportamientos biológicos de las células CRC
Para investigar posibles funciones de IgG en los comportamientos biológicos aún más, por la regulación de la expresión de IgG con la interferencia de siRNA fue realizado. Como se muestra en la Figura S3 A, la síntesis de proteínas IgG más de 50% se redujo eficazmente con siRNA. En MTS, IgG baja regulación suprimió la proliferación de las células LOVO (Figura S3 B). Anexina V-PI inmunofluorescencia doble tinción mostró que las células temprana (anexina V +) y tardía (PI +) apoptótica se incrementaron con IgG desmontables de siRNA en comparación con si-control (Figura S3 C). Mientras tanto, IgG caída también disminuyó transwell células (Figura S3 D).
Discusión
El aumento de los niveles séricos de IgG e IgA se detectan a menudo en pacientes con cánceres epiteliales [23], [24] incluyendo aquellos con CRC [25], [26]. Además, IgG e IgA se han encontrado que se expresa en líneas celulares y tejidos de diversos tipos de cáncer epitelial, incluyendo CRC [3], [4], [6], [27], [28]. Aunque el fenómeno de la expresión de Ig en los cánceres se ha establecido, la función de cáncer derivadas de Ig no está claro. Además, se sabe poco acerca de las relaciones entre IgG derivados del cáncer y las características clinicopatológicas y comportamientos biológicos de los carcinomas. Chen et al. han informado recientemente de que la expresión de IgG en sacomas de tejidos blandos se asoció con el grado del tumor y la expresión de PCNA, Ki-67 y Ciclina D1 [29]. En el presente estudio, se confirmó la presencia de la expresión de IgG en las células colorrectales, tanto en la proteína y los niveles de mRNA. La falta de expresión del receptor de inmunoglobulina y la detección de IgG de ARNm en células de CRC descartaron la posibilidad de que la IgG circulante se recogió por estas células cancerosas. Hemos demostrado una correlación positiva entre la expresión de IgG, el grado de diferenciación tumoral, el estadio pTNM y compromiso de los ganglios linfáticos. La expresión de IgG fue más fuerte en los tejidos de CRC con pobre diferenciación o con pTNM estadio III-IV, que en aquellos con una mejor diferenciación o pTNM I-II. la expresión de IgG podría estar asociado negativamente con la infiltración inflamatoria, como cánceres con infiltración inflamatoria más ligero mostraron más fuerte expresión de IgG. Nuestros resultados en los tejidos de cáncer colorrectal son consistentes con nuestras observaciones en líneas de células colorrectales, mostrando una menor cantidad de IgG en células de cáncer de diferenciación moderada (HT29 y SW480) en comparación con los de mala diferenciación (LOVO y HCT116). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que el cáncer derivado de IgG podría estar involucrado en el proceso de de-diferenciación, infiltración y metástasis de CRC, y que podría desempeñar un papel auto-protector durante el desarrollo del cáncer. De hecho, en ciertas condiciones se han encontrado inmunoglobulinas para promover el crecimiento del cáncer [30], [31], y este fenómeno principalmente se ha atribuido a los blindajes de los epítopos diana en la superficie de las células cancerosas por anticuerpos "anti-tumorales" [32 ], [33]. Un estudio de los pacientes con cáncer de ovario sugiere que tales anticuerpos de bloqueo pueden ser glicosilados de manera aberrante moléculas de IgG, que son incapaces de provocar respuestas inmunes [24]. Además de cadenas pesadas de inmunoglobulina, receptores de células T (tales como TCR-a y TCR-b), también se encontraron inmunoglobulina -como moléculas de adhesión celular (tales como CD47, CD54, CD58) que se expresa en las células del cáncer [34]. anticuerpos TCR e IgG dirigidos a citotoxicidad dependiente del complemento y la apoptosis de líneas celulares de cáncer. Así que estas "proteínas de la superfamilia de inmunoglobulina" se plantearon la hipótesis de ser auto-protección y que participan en la proliferación de las células del cáncer [34]. Una alternativa, papel indirecto para IgG en la estimulación del crecimiento tumoral podría implicar factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) que se realiza por inmunoglobulinas y se ha demostrado para prevenir las respuestas de células T citolíticas [35].