Extracto
cáncer de vejiga urinaria (UBC) ocupa el noveno lugar en el cáncer en todo el mundo. En Egipto, el patrón de cáncer de vejiga es único en que tanto los tipos de células de transición y de células escamosas prevalecen. A pesar de mucha investigación sobre el tema, todavía es difícil predecir la progresión del tumor, la terapia óptima y el resultado clínico. El portador de folato reducido (RFC /SLC19A1) es el sistema de transporte principal para los folatos en las células y tejidos de mamíferos. RFC es también el principal medio de la captación celular de fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer antifolato, sin embargo, el transporte de membrana de antifolatos por RFC se considera como limitante para la actividad antitumoral. El propósito de este estudio fue comparar el nivel de expresión de ARNm de RFC /SLC19A1 en uroteliales y no uroteliales variantes de carcinomas de vejiga. La cuantificación de mRNA en el RFC mucosa de 41 pacientes de cáncer de vejiga sin tratar se realizó mediante RT-qPCR. estado de los niveles de mRNA fueron RFC ~ 9 veces mayor (N = 39; P & lt; 0,0001) en las muestras de tumor de vejiga con respecto a mRNA de vejiga normal. RFC upregulation fue fuertemente correlacionada con el tipo de tumor (urotelial
vs
no urotelial;. P & lt; 0,05), donde mediana de expresión mRNA RFC fue significativamente (p & lt; 0,05) más alta en el urotelial (~ 14 veces) en comparación con la no urotelial (~ 4 veces) variante. Esto puede dar cuenta de la variación en la respuesta a los regímenes que contienen antifolato-utilizados en el tratamiento de cualquier tipo. los niveles de ARNm de RFC no se asociaron con el grado del tumor (I, II y III) o de la etapa (músculo invasivo
vs.
no músculo invasivo) lo que implica que RFC no se puede utilizar para los propósitos de pronóstico en los carcinomas de vejiga y el aumento de su expresión es un evento temprano en tumores de vejiga patogénesis humana. Además, RFC se puede considerar como un marcador potencial para predecir la respuesta a la quimioterapia en antifolato carcinomas uroteliales
Visto:. Abdel-Haleem AM, El-Zeiry MI, Mahran LG, Abou-Aisha K, Rady MH, Rohde J, et al. (2011) Expresión de RFC /SLC19A1 está asociado con el tipo de tumor en el cáncer de vejiga pacientes. PLoS ONE 6 (7): e21820. doi: 10.1371 /journal.pone.0021820
Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Enero, 2011; Aceptado: June 12, 2011; Publicado: 8 Julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Abdel-Halim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el DAAD, así como GUC como la financiación de proyectos MSC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
20-60% de la incidencia de cáncer en todo el mundo se ha asociado a factores nutricionales [1]. Entre los nutrientes más estudiadas implicados en la etiología del cáncer es la vitamina ácido fólico. Los folatos son esenciales para la vida, y la deficiencia de ácido fólico contribuye a una serie de problemas de salud, incluyendo enfermedades cardiovasculares, anomalías fetales, trastornos neurológicos, y el cáncer [1], [2].
El cáncer de vejiga es el noveno más cáncer común en todo el mundo. La mayoría (77%) de los tumores de vejiga se produce en los hombres. Es el séptimo cáncer más común en hombres y 17 en mujeres [3]. El espectro de tumores de vejiga es amplia e incluye el carcinoma de células transicionales (TCC), carcinoma de células escamosas (SCC), el adenocarcinoma y el carcinoma de células pequeñas. TCC es con mucho el más frecuente y mejor estudiado. En los Estados Unidos, 90% de los tumores de vejiga son de la variante urotelial que se desarrolla a partir de células de transición. Por el contrario, en Egipto, el tipo histológico más común de cáncer de vejiga solía ser SCC [4], que constituye del 59% al 81% de los cánceres de vejiga reportados entre 1960 y 1980 [4], [5]. Contrariamente a la principal etiología de fumar y la exposición ocupacional en los países occidentales, la infección crónica de la vejiga con
Schistosoma haematobium
, ha sido el factor de riesgo más importante para el cáncer de vejiga en Egipto [5]. Sin embargo, estudios recientes [5], [6] informó de que SCC en Egipto parece haber disminuido de 78% en 1980 al 27% en 2005.
Las muestras de biopsia de las lesiones tumorales de vejiga pueden ser fácilmente obtenidos por trans resección -urethral (TUR) antes del tratamiento. A pesar de mucha investigación sobre el tema, todavía es difícil predecir la progresión del tumor, la terapia óptima y el resultado clínico [7]. La estadificación del tumor (sistema TNM) se considera que es el mejor marcador pronóstico; Sin embargo, la falta de predecir con precisión la progresión o recurrencia se experimenta a menudo [8]. Además, el fracaso del tratamiento es un área importante en la que la investigación traslacional del cáncer de vejiga podría beneficiar a los pacientes. Por ejemplo, el régimen de vehículo de motor, (un régimen que contiene antifolato-) exhibe única actividad antitumoral limitada contra el cáncer de células no transitorio, mientras que las tasas de respuesta de hasta ~ 70% fueron reportados en la CTP en el mismo estudio [9]. Si discrepancias genéticas entre las dos variantes de carcinomas de vejiga afectan a su progresión y /o la respuesta a la quimioterapia, entonces la pregunta es; los cuales marcador genético (s) es (son) los más críticos?
El transportador de folato reducido de expresión ubicua (RFC) es considerada como la ruta de transporte importante para los folatos en concentraciones fisiológicas cofactor incluso cuando múltiples sistemas de captación están presentes [ ,,,0],1], [10], [11]. La pérdida de la expresión o función RFC presagia potencialmente profundas consecuencias en el desarrollo fisiológico y [1], [12]. RFC es también un transportador principales de fármacos antifolato utilizados para la quimioterapia del cáncer, como el metotrexato (MTX), pemetrexed, y raltitrexed. La eficacia de la quimioterapia con estos agentes está estrechamente vinculada a los niveles y la actividad de la RFC en ambos tumores y tejidos normales [13], [14]. MTX, por ejemplo, sigue siendo un componente importante del arsenal quimioterapéutico para una variedad de tumores malignos, incluyendo el cáncer de vejiga [15], [16]. Pemetrexed también ha sido considerado recientemente para uso en el tratamiento de cáncer de vejiga [16]. transporte de membrana de estas antifolatos es fundamental para actividad antitumoral, ya que esto proporciona suficiente (no unida) intracelular de los fármacos para mantener la máxima inhibición de enzimas diana (por ejemplo, DHFR; dihidrofolato reductasa) y para la síntesis de derivados de poliglutamato requeridos para alta afinidad de unión a las enzimas intracelulares [13 ]. La expresión del gen transportador de folato reducido se puede estudiar de manera fiable en el ARNm, y se basa en una serie de estudios [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21], el expresión es probable que refleje la actividad de la RFC en ambos tumores y tejidos normales. Por lo tanto, la inspección de las discrepancias en la expresión RFC entre los diferentes tipos de cánceres de vejiga puede allanar el camino para una posible mejora de la quimioterapia que contiene antifolato basados racionalmente.
El presente estudio fue, por lo tanto, realizó para investigar la expresión de ARNm y potencial clínico Relevancia (es decir, asociaciones con el estadio del tumor, grado y /o el tipo histológico) del principal transportador de folato, RFC, en un grupo de tumores de vejiga urinaria humanos de diferentes tipos histológicos.
Materiales y Métodos
declaración de ética
Un número inicial de 61 pacientes con cáncer de vejiga fueron incluidos en este estudio. 'Se analizaron los datos de forma anónima y los pacientes' Todos los pacientes habían obtenido el consentimiento para incluir tejido extirpado para el estudio actual a través del departamento de patología en el Instituto Nacional del Cáncer (NCI), El Cairo, Egipto. Todos los protocolos de investigación fueron aprobados por las juntas de revisión institucional del Instituto Nacional del Cáncer y el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Alemana de El Cairo.
Los pacientes
Sesenta y un biopsias de tumores se obtuvieron mediante RTU en el NCI durante el período de marzo de 2009 a enero de 2010. 17 especímenes fueron excluidos del estudio posterior durante la etapa de verificación de la calidad del ARN (véase más adelante). Para las 44 muestras restantes, estadio y grado tumoral fueron asignados de acuerdo a la TNM [4] por la unidad de patología en el NCI .. Los pacientes incluidos en este estudio (n = 44; 31 machos, 11 hembras y 2 no identificada; rango de edad: el 31 de a 79) fueron asignados en dos grupos principales, según el tipo histológico del tumor: grupo de tumores uroteliales '; TCC y TCC con metaplasia escamosa; y no urotelial grupo de tumores; SCC y adenocarcinoma. En el momento de la inclusión, ninguno de los pacientes había recibido tratamiento en cualquier forma. Características clínicas de los pacientes con cáncer de vejiga incluyen en este estudio se enumeran en la Tabla S1.
La extracción total de ARN y la transcripción inversa
biopsias de tumores extirpados utilizados para el análisis de ARNm se colocaron inmediatamente en el ARN
más tarde
® ARN Estabilización de reactivo (Qiagen, Alemania), se mantuvo a 4 ° C durante la noche y luego se almacena a -20 ° C. ARN total fue extraído a partir de biopsias congeladas (~ 30 mg) utilizando mini-prep Absolutamente ARN kit (Stratagene, Alemania) según las instrucciones de los fabricantes. La integridad del ARN aislado se verificó por electroforesis mediante tinción con bromuro de etidio y por A
Una relación de absorción 260 /
280 (rango 1,8-2,0) (A260 nm = 1 corresponde a 40 mg /ml de ARN). Una relación de intensidad entre 2:01 28S y 18S rRNA se consideró un punto de referencia para el ARN intacto (Figura S1). 17 muestras de tumores fueron excluidos del estudio en base a su perfil de la integridad del ARN (Figura S1). 5 g de ARN total se transcribió de forma inversa con Sprint ™ RT productos completos kit (Clontech, Alemania) en un volumen de 20 l de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
cuantificación de ARNm RFC
el protocolo de RT-qPCR seguido en este estudio se estructura en torno a la información mínima de publicación de experimentos cuantitativos PCR en tiempo real (MIQE) directrices, publicadas por Bustin
et al.
[22]. RFC mRNA se cuantificó por RT-qPCR en el instrumento Mx3005P ™ (Stratagene, EE.UU.). Las transcripciones de β-actina se cuantificó como un control de ARN endógeno [7], [23] para eliminar las variaciones en la cantidad y /o calidad de RNA total añadido a cada mezcla de reacción y cada muestra se normalizó sobre la base de su β-actina contenido de ARNm. Todas las cuantificaciones en este estudio se presentan como la relación entre el gen diana y β-actina. Las secuencias de cebador, temperatura de hibridación y PCR tamaño de los productos para el RFC gen diana y el gen de referencia β-actina se presentan en la Tabla 1. La especificidad de cada par de cebadores se confirmó por análisis de la curva de fusión (Figura S2) que resultó en fusión específico solo producto temperaturas.
Cada par de cebadores se evaluó para las estructuras secundarias y SNPs por el
in silico
herramienta de evaluación en RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb). cebador libre de sal altamente purificada de RFC y β-actina (Tabla 1) se generaron en el comercio (Metabion GmbH, Alemania) y optimizado para una de dos pasos (combinado temperatura de hibridación /extensión) protocolo de PCR. Un grupo de muestras de ADNc de cáncer de vejiga 3 se utiliza para la optimización del ensayo y evaluación de la eficiencia de amplificación (Tabla 1) utilizando "la curva estándar" método. entonces una curva estándar para cada gen fue generado automáticamente por el software Mx3005P ™ donde log de la concentración blanco se representó frente al valor correspondiente ciclo de cuantificación (Cq) [22]. Las condiciones para todos los PCR fueron optimizadas con respecto a delante y hacia atrás concentraciones de cebadores y diversas temperaturas de recocido (55-66 ° C). En tiempo real de mezcla maestra de PCR de los siguientes componentes de la reacción se preparó para el extremo concentración indicada: 12,5 l de energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 0,2 l RFC cebador directo (100 nM), 0,2 l inversa RFC cebador (100 nM) y 11,1 l de agua libre de nucleasa para el gen diana; y 12,5 l de energía SYBR® Green PCR Master Mix, hacia adelante 0,75 l de cebador β-actina (300 nM), 0,75 l cebador inverso β-actina (300 nM) y 10 l de agua libre de nucleasa para el gen de referencia. 24 l de la mezcla maestra preparada se pipetearon por pocillo en una placa de 96 pocillos. después se añadió 1 l de plantilla cDNA a cada pocillo de reacción. Aplicaciones de la entrada total de cDNA se realizaron por duplicado. La placa de 96 pocillos fue sellado por una película de adhesivo óptico PCR (Eppendorf AG, Alemania). Se usó el siguiente perfil térmico optimizado: programa de desnaturalización (95 ° C durante 10 min), programa de amplificación y cuantificación repitió 40 veces (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, con una única medida de fluorescencia), curva de fusión programa (55 a 95 ° C con una velocidad de calentamiento de 0,1 ° C por segundo y una medición de fluorescencia continua). Se recogieron los datos de fluorescencia y el ARNm cuantificó con la versión de software Mx3005P ™ 4.1. cq valores fueron calculados automáticamente según el "método del punto de ajuste"; donde Cq se define como el número fraccional de ciclos en que la curva cinética PCR alcanza una cantidad umbral definido por programa de fluorescencia.
El cambio veces en la expresión de β-actina se estimó de acuerdo con el método de Schmittgen y Livak [24]. Como se muestra en la Tabla 2, la variación en la expresión de β-actina fue mínima entre los grupos uroteliales y no uroteliales.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizadas para la normalidad mediante la prueba de Shapiro -Wilk prueba de normalidad. Las pruebas no paramétricas se decidieron en consecuencia. Los valores de P inferior a 0,05 se consideraron significativos. La prueba U de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis se utilizaron para correlacionar la expresión de la RFC con el estadio del tumor, grado y tipo. El software
Graph Pad Prism gratis (versión 5) se utilizó para el análisis estadístico.
Resultados
expresión del ARNm de RFC
La expresión del ARNm del folato RFC transportador se cuantificó en 41 especímenes de cáncer de vejiga, tres muestras sin evidencia de malignidad obtenido a partir de mucosa de la vejiga adyacente al tejido canceroso, y un ARN de vejiga de referencia disponible comercialmente agrupados de los caucásicos 26 macho /hembra; 22-70 años de edad (Clonetech, Alemania). Este último se conoce como el calibrador en las siguientes secciones. Se detectó
expresión de ARNm de RFC de todos los especímenes de vejiga utilizados en este estudio. Los niveles de expresión en estado estacionario de RFC mRNA fueron significativamente (
P
& lt; 0,0001) mayor en los especímenes de cáncer de vejiga por ~ 9 veces (8,661, intervalo de 0,98 a 50, N = 39) que en el calibrador .
clínica
vs.
hisotpathological parámetros
se realizó un análisis multivariado para determinar los factores más importantes con los que se asocia la expresión de ARNm de RFC. La correlación entre los niveles de ARNm de RFC y los parámetros clínico probados de cáncer de vejiga se resumen en la Tabla 3. RFC nivel relativo de expresión fue significativamente (
P Hotel & lt; 0,05). Urotelial superior en
vs
no carcinomas de vejiga -urothelial donde RFC ARNm se incrementó en un ~ 14 veces (13,27; n = 27) en los tumores uroteliales en comparación con 4 veces (4,083; n = 10) aumentará sólo en las variantes no uroteliales (Figura 1A). El nivel medio de expresión de la RFC en el especímenes TCC fue 17,48; n = 23 en comparación con 5,538; n = 6 en las muestras clasificadas como TCC con metaplasia escamosa o carcinomas de células escamosas de transición y mixtos. Sin embargo, se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre la expresión de ARNm de RFC en muestras de cáncer de vejiga clasificados como pura TCC
vs.
Los que tienen TCC con metaplasia de células escamosas (Figura 1D). Esto muestra que la expresión de ARNm en RFC tumores no uroteliales es mucho menor que en sus contrapartes uroteliales y el componente escamoso está predominantemente asociado con la expresión de ARNm reducida RFC. El nivel de expresión de la RFC en muestras de cáncer de vejiga que contienen óvulos bilharzial se comparó con aquellos que no tienen evidencia de infección bilharzial donde RFC mRNA fue significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) disminuyó (BA) en muestras de cáncer de vejiga asociado bilharzial (3,13; n = 7) en comparación con el grupo asociado no bilharzial (9,76; n = 32). (Figura 1E)
líneas horizontales sólidas demuestran la mediana de cada grupo individual. Todos los datos se muestran como la relación entre el gen diana y beta-actina. *
P-valor
, no paramétrico, pruebas de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis. BA, Bilharizal-asociado
Se examinó la correlación entre los niveles de expresión de ARNm de RFC y los marcadores de la agresividad del tumor. (Es decir, grado y estadio). La expresión de ARNm de RFC no se correlacionó con el grado del tumor (Figura 1B), donde no hubo una diferencia estadísticamente significativa (
P = 0,3008
) detectada entre los grados I, II, o III. Además, la expresión RFC no se alteró estadísticamente (
P
= 0,2666) entre los especímenes invasivos del músculo invasivo y no musculares (Figura 1C). Cabe destacar que todas las muestras de SCC (n = 8) fueron clasificados como tumores músculo-invasivo, lo que apunta a la naturaleza más agresiva de SCC y carcinomas uroteliales no. Además, una diferencia estadísticamente significativa (
P = 0,2162
) se encontró entre las edades de los pacientes con carcinoma urotelial (media = 60,42)
vs.
Los del grupo no urotelial (media = 52.88).
Discusión
Dado que las células de mamíferos no pueden sintetizar los folatos
de novo
, los procesos de captación celular estrictamente regulados han evolucionado para mantener suficientes niveles de folatos intracelulares [25], [26]. En el contexto de malignidad, el principal sistema de folato transportador, RFC, el aumento de expresión es coherente con la necesidad de aumentar la retención celular de folatos para soportar los requisitos de las células cancerosas que se dividen rápidamente para la síntesis de ADN y la replicación. En el presente estudio, nuestros hallazgos en biopsias de cáncer de vejiga humana estaban de acuerdo con esta noción donde la expresión RFC ARNm se incrementó significativamente por ~ 14 veces en carcinomas de vejiga uroteliales (TCC y TCC con metaplasia escamosa) y por ~ 4 veces en el variantes no uroteliales (SCC & amp; adenocarcinoma). La expresión alterada de la RFC también se ha reportado en las leucemias, particularmente B precursoras [11], [26], [27], osteosarcoma [17], cáncer colorrectal y primaria linfomas del sistema nervioso central [1] por lo tanto la transcripción y proteínas los niveles.
la discrepancia en la expresión del ARNm RFC entre urotelial de vejiga y los tumores uroteliales no, se informó en el estudio actual, se podría atribuir a aguas arriba eventos genéticos que tienen lugar en cada tipo, que puedan afectar a la regulación transcripcional de la transportador. Tanto TFS ubicuos y específicos de tejido que transactivate o reprimen la transcripción en respuesta a los requerimientos de cofactores de folato controlan los niveles netos de transcripciones RFC en los tejidos [1], [18]. La literatura y la minería vía utilizando el
LitInspector
de software [28] mostró que el RFC (SLC19A1) tiene la posibilidad de interacciones con CREB1 (unión CAMP elemento sensible a la proteína-1). secuencia consenso de CRE /AP-1-al igual que es uno de los dos sitios principales de la regulación de los promotores basales RFC [18]. CREB, que se une a la CRE /AP-1, se encuentra entre las TFS activados por la ERK (MAPK), que son componentes de la vía de señalización RTK-RAS. Acumulación evidencia indica que los componentes clave de esta vía de señalización se activan frecuentemente en carcinomas uroteliales humanos [29], pero no en los tipos no uroteliales [30], [31]. En las células de fibrosarcoma humano, CREB-1 y c-Jun fueron los factores de transcripción específicos de células que participan en CRE de unión en el promotor RFC. Hallazgos similares fueron reportados por CREB-1 y ATF-1 en células de carcinoma hepatocelular humano y células de leucemia humana [18], [32]. Además, dos tercios de las líneas celulares resistentes a antifolato muestran una marcada disminución en el factor de transcripción de unión a un único sitio CRE presente en el promotor mínimo A del gen RFC [33]. Por lo tanto, cada vez hay más pruebas que sugieren que la unión de CREB-1 a la CRE en el promotor RFC es un importante contribuyente a la inducción de la expresión génica RFC en líneas celulares de cáncer y tumores malignos [18], [32], [33]. Por lo tanto, la hipótesis de que la activación constitutiva de la vía RAS-RTK es probablemente un factor que representa el aumento de la expresión de ARNm de RFC en los carcinomas uroteliales. En carcinomas uroteliales no, sin embargo, las mutaciones RAS son poco frecuentes y otras mutaciones entran en juego (p16 & amp; p15 eliminación [31], [32], Bax, Bak & amp; sobreexpresión de EGFR y p53 inactivación [32]). Por lo tanto, esperamos que diferentes eventos genéticos que han llevado a la modesto aumento en el nivel de mRNA en RFC carcinomas uroteliales no, y, posiblemente, diferentes TFS implicados en la activación de la transcripción RFC. Esto se ve apoyado por el hecho de que el aumento de expresión RFC es muy probable que esté asociado con la inactivación de genes supresores de tumores, en donde 5-metil tetrahidrofolato (5-CH3-THF) es un cofactor en la síntesis de novo de S-adenosilmetionina que participa en la metilación de las islas CpG. RFC es la principal vía de entrada para el THF y el aumento de la expresión RFC sería en consecuencia conducir a la acumulación del folato reducido metilado [11], [15] lo que eventualmente puede conducir a la inactivación de diversos genes supresores de tumores similares; p16, p15 y /o p53 [34], [35].
Además, en base a nuestros resultados actuales, RFC sobreexpresión implica que carcinomas de vejiga urotelial serían intrínsecamente más sensibles a los antifolatos mientras que los carcinomas uroteliales no mostrarían una respuesta menos favorable a la quimioterapia antifolato. Esta especulación puede explicar por qué el régimen de exposiciones única actividad antitumoral limitada vehículo de motor, contra el cáncer de células no transitorio, mientras que las tasas de respuesta de hasta ~ 70% se registraron en TCC en el mismo estudio [9].
Nuestros resultados muestran que el RFC mRNA aumento de la expresión no está asociada con el grado del tumor o implicado fase que el aumento de expresión de mRNA RFC parece ocurrir temprano en el proceso de la progresión tumoral de múltiples pasos. Esta hipótesis se ve apoyada por el aumento de la expresión del ARNm RFC consistentes entre los diferentes grupos de edad en nuestro estudio. Sin embargo, se ha informado de que sólo ~ 15% de los tumores superficiales de bajo grado procederá a infiltrarse en la musculatura y que los tumores de músculo invasivo de alto grado, ya sea originados por el carcinoma plano in situ (CIS) /displasia severa o surgir
de novo
[29]. En consecuencia, una hipótesis alternativa podría ser que el aumento de expresión RFC mRNA se produce como consecuencia de eventos independientes entre los diferentes tipos de carcinomas de la vejiga. Curiosamente, todas las biopsias de tumores uroteliales no utilizados en este estudio fueron apuntando músculo invasivo de diagnóstico de las características desfavorables de los tumores uroteliales no como ya se ha sugerido por Erdemir
et al.
[19]. La importancia clínica de diferenciación escamosa parece ser una característica de pronóstico desfavorable debido a su asociación con tumores invasivos de alto grado
.
A pesar de que se detectó una diferencia significativa entre los niveles de expresión en los cánceres de vejiga RFC bilharzial- y no bilharzial-asociado , este hallazgo no puede ser concluyente ya que sólo 7 casos (18% del total) de cáncer de vejiga en bilharzial asociados fueron incluidos en este estudio (cf 32 casos y asociado no bilharzial). Además, el mayor nivel de expresión de ARNm de RFC en BA-TCC (2 muestras)
frente
el SCC o tipos mixtos (5 muestras) puede también implicar que RFC aumentó la expresión de ARNm es realmente independiente de la infección bilharzial.
Vale la pena mencionar (ya que esto apoya la relevancia) es que las características de las muestras de cáncer de vejiga utilizados en este estudio eran representativos de la población de pacientes con cáncer de vejiga 'con respecto a sexo, edad y tipos histológicos. La proporción de pacientes female:male era ~1:3. La edad media de todos los pacientes de cáncer de vejiga incluidos en el estudio fue 60, donde la edad media de los grupos no uroteliales fue menor que la de los pacientes de carcinoma de vejiga uroteliales (53
vs.
60) que indica el agresivo naturaleza de las variantes no uroteliales de cáncer de vejiga. Además, el 64% de los pacientes tenían tumores de vejiga, mientras que sólo el 24% presenta con las variantes no uroteliales. Estos datos demográficos estaban de acuerdo con el cambio de patrón de cáncer de vejiga en Egipto ya se ha informado de Felix
et al.
En 2008 [5], por lo tanto, destacando la aparición y la prevalencia del tipo de células transicionales y retracción de la tipos no uroteliales.
en conclusión, la expresión RFC puede ser considerado como un arma de doble filo (Figura 2). El aumento de expresión RFC promovería quimiosensibilidad a antifolatos tiempo, la expansión intracelular tamaño del grupo de ácido fólico; que puede conducir a la resistencia adquirida. Esta idea es apoyada por el hallazgo de que la pérdida de los exportadores de folato condujo a la resistencia a los antifolatos través de una expansión del tamaño del grupo de folato [21]. En particular, en carcinomas de vejiga, Rady
et al.
, (Resultados no publicados) informó que las exportaciones del BCRP (mono-, di- y triglutamates de folatos) la expresión se redujo, mientras que MRP3, que han restringido la capacidad para exportar sólo los folatos monoglutamato, se encontró que se sobreexpresa [Los trabajos no publicados por Rady et al. 2009]. Por otra parte, MRP3 fue significativamente mayor en la relación urotelial a la variante de carcinoma de vejiga no urotelial [Los trabajos no publicados por Rady et al. 2009]. Estas variaciones en los niveles de expresión de bombas de eflujo antifolatos y de afluencia implican que la utilización de un panel de biomarcadores genéticos para cada tipo de tumor puede ser más apropiado para la definición de respuesta a la quimioterapia en lugar de un solo marcador genético independiente.
A diagrama que representa el papel de doble filo propuesta del RFC en la quimioterapia del cáncer. El aumento de expresión es predictiva de antifolatos de transporte (MTX). Al mismo tiempo, el aumento de expresión de la RFC dará lugar a la expansión de tamaño de la piscina folato obligando a una inhibición de retroalimentación negativa sobre la captación de antifolatos.
Conclusiones y direcciones futuras
El presente estudio fue llevado a cabo para investigar alteraciones en la expresión RFC entre las diferentes variantes de carcinomas de la vejiga. expresión de ARNm de RFC se demostró que era dependiente del tipo pero etapa- y grado independiente. Aunque la diferenciación entre urotelial y carcinomas de vejiga urotelial no se puede hacer mediante el examen microscópico, nuestro objetivo final sería integrar el diagnóstico molecular en la práctica clínica. Evaluación prospectiva de un panel de los transportadores de folato (como; RFC, BCRP, y MRP3), puede predecir la respuesta a la terapia de antifolato, sugieren nuevas estrategias terapéuticas y, por tanto, mejorar el resultado del tratamiento para los pacientes con cáncer de vejiga individuales. Las diferencias entre los tumores de vejiga, descritos y no uroteliales de la vejiga podrían reflejar diferentes etiologías y /o factores de riesgo. Un estudio más amplio diseñado para proporcionar correlaciones de la extensión de la RFC metilación con características clínico-patológicas tales como la edad, el sexo, el grado histológico, el estadio y la progresión podría proporcionar información útil adicional acerca de la etiología de los niveles RFC alterado de expresión entre los diferentes tipos de cánceres de vejiga. Otros objetivos de metilación del ADN conocidas en la vejiga también pueden ser incluidos para ver el efecto de la mayor expresión de RFC y superior de transporte de folato en la metilación del ADN.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Evaluación de la Calidad de ARN. En gel de agarosa La electroforesis de minipreparaciones de ARN total. carriles especímenes "se etiquetan en función de su número de código asignado a ellos después de la recolección. La observación de bandas nítidas de los ARNr 28S (4,8 kb) y 18S rRNA (1,8 kb) fue la indicación de ARN intacto (T82, T65, T22 y T38). S22 y S38 contienen trazas de ADN genómico, sin embargo los cebadores de RFC y β-actina fueron diseñados para abarcar el exón unión /intrón para reducir al mínimo la amplificación del ADN genómico. T118 mostró degradación parcial pero las bandas 28S y 18S eran muy débil; el rendimiento total de ARN T118 fue sólo 2 mg. T107 mostró ARN degradado y se excluyó del análisis adicional. ARN (flechas) y de ADN marcadores de tamaño (1031-1080 bp) se incluyeron para comparación. Esta imagen fue fotografiada utilizando el sistema de adquisición de imágenes UVIsoft (Tokio, Japón)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s001 gratis (TIF)
figura S2.
de fusión análisis de la curva. Melting análisis de la curva para la demostración de la especificidad de los cebadores. Panel A: colorante fluorescente cae rápidamente cuando el ADN se derrite. El punto de fusión se define como el punto de la curva de fusión, que es más fácil determina como el máximo en la primera derivada negativa de la curva de fusión de inflexión. Las curvas de disociación, tanto para el objetivo (RFC) y de referencia se muestran (ACTB) genes. Cada producto muestra un solo pico agudo que indica la especificidad de los pares de cebadores y la ausencia de dímeros de cebadores o los productos de amplificación no específicos. NTC no registró un valor de CT o Ct valores registrados en el rango entre (35-38), que difiere en más de 5Ciclos desde el valor Ct más alta registrada por las muestras (no se muestra). Las curvas planas del colorante pasivo ROX indican que no hay un rápido aumento (no se muestra). Panel B: electroforesis en gel de agarosa de productos PCR convencional usando transcripción inversa de ADNc de una muestra de tumor (T42) y transcripción inversa de ADNc del calibrador (disponible en el comercio, el ARN normal de la vejiga, Clonetech). bandas individuales de los tamaños correctos para el RFC y el gen de referencia indican la especificidad de los productos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021820.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
Características clínicas de los pacientes con cáncer de vejiga.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021820.s003 gratis (XLS)
Reconocimientos
Agradecemos mucho el apoyo del Prof. Dr. Ashraf Zaghloul y Ahmed Moustafa de la Instituto nacional del cáncer, en el suministro de las muestras de pacientes con cáncer de vejiga. Agradecemos a Prof Raid Amin, director de Servicios de Asesoramiento estadísticos UWF, por su ayuda en el análisis estadístico de los resultados. Prof. Stephen Bustin y el Prof. Sanaa Eissa contribuyeron a través de muchas discusiones fructíferas, y elaborados en muchos aspectos de la RT-qPCR. También estamos agradecidos a Shady Saad y Deena Amr por su ayuda en el establecimiento de las metodologías y diseño experimental del estudio.