Extracto
Especial rica en AT secuencia de unión ha sido identificado como un organizador genoma que reprograma organización de la cromatina y la transcripción de proteína-1 (SATB1) perfiles. SATB1 promueve el crecimiento tumoral y la metástasis en el cáncer de mama y se asocia con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer. La asociación entre SATB1 y el cáncer colorrectal (CCR) no se ha estudiado intensamente. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de SATB1 en el crecimiento y la metástasis CRC in vitro e in vivo y su correlación con la supervivencia global y los factores clínico-patológicos en pacientes con CCR. Se establecieron estable caída SATB1 y líneas de células que sobreexpresan SATB1. SATB1 knockdown disminución del crecimiento celular, la formación de colonias, la migración y la invasión y aumento de la apoptosis en las células de CRC in vitro (p & lt; 0,05), mientras que la sobreexpresión SATB1 tuvo el efecto opuesto. SATB1 sobreexpresión aumentó el crecimiento del tumor y la metástasis de pulmón e hígado in vivo mediante el uso de modelos animales de xenoinjerto (p & lt; 0,05). Por lo tanto, SATB1 promueve un fenotipo agresivo CRC in vitro e in vivo. El análisis inmunohistoquímico de 560 especímenes de CRC mostró que la expresión SATB1 fue significativamente mayor en los tejidos de CRC que en la mucosa no tumoral emparejados (p & lt; 0,001). Además, la expresión SATB1 fue significativamente mayor en los pacientes con tumores poco diferenciados, una mayor profundidad de invasión, metástasis a distancia, y el estadio TNM avanzada. SATB1 pacientes positivos tenían un peor pronóstico que los pacientes SATB1-negativas, y SATB1 se identificó como un factor pronóstico independiente de CRC (p = 0,009). Sorprendentemente, también se evaluó la expresión SATB2 en CRC y encontramos que SATB2 se expresó más abundantemente en la mucosa no cancerosos en comparación con tejidos de cáncer colorrectal (p & lt; 0,001). Sin embargo, la expresión SATB2 no tuvo influencia en el pronóstico de los pacientes con CCR (p = 0,836). SATB1 expresión se asoció significativamente con el tiempo de supervivencia más corta ya sea en pacientes SATB2-positivos o en SATB2-negativos pacientes (p & lt; 0,001). En conclusión, nuestros resultados indican un papel importante para SATB1 en el CCR la tumorigénesis y metástasis. Por lo tanto, SATB1 puede representar una importante biomarcador pronóstico y la diana terapéutica para el CDN
Visto:. Zhang Y, Tian X, Ji H, Guan X, W Xu, Dong B, et al. (2014) Expresión de SATB1 promueve el crecimiento y metástasis del cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (6): e100413. doi: 10.1371 /journal.pone.0100413
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 15 Septiembre, 2013; Aceptado: 28-may de 2014; Publicado: 27 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por fondos Nacional de Ciencias Naturales (n: 81272765), capital característica clínica de Investigación de Aplicaciones (n: Z121107001012083), el Proyecto clave del Fondo de Desarrollo de Medicina (No: 2009-2095), Fundación Municipal de Ciencias Naturales Pekín (No: 7122030) , talentos excepcionales Plan de subsidios de Pekín (215 Programa, No: 18.02.2009), el Proyecto Especial de Beijing "decenas, centenas y millares" fondos para la salud Talentsand del hospital de cáncer de Beijing (No: 10-04). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muerte asociada al cáncer en los Estados Unidos de América [1] y el segundo cáncer más prevalente en china [2]. Aproximadamente el 15-25% de los pacientes con CCR experimentar metástasis hepáticas sincrónicas, y 80-90% de estos pacientes tienen enfermedad del hígado metastásico no resecable [3]. enfermedad del hígado metastásico es la principal causa de muerte en pacientes con CCR [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar marcadores moleculares sensibles y específicos para predecir CRC metástasis. Una mayor comprensión de los mecanismos subyacentes de la CRC metástasis es esencial en la identificación de biomarcadores de la progresión metastásica en el CCR.
Especial rica en AT secuencia de la proteína de unión-1 (SATB1) es una proteína nuclear específica de tejido que es predominantemente expresado en timocitos [5] y fue reconocido inicialmente por su papel crítico en el desarrollo correcto de las células T [6] - [8]. SATB1 une los sitios de anclaje ricas en AT especiales que circunscriben la heterocromatina para formar una arquitectura funcional nuclear "como una jaula" que sirve como una plataforma de aterrizaje para los factores de remodelación de la cromatina. Por lo tanto, la red SATB1 puede regular la expresión génica mediante la alteración de la organización funcional de la secuencia de ADN [9], [10]. SATB1 se ha informado recientemente a ser un organizador genoma. SATB1 expresión alterada notablemente la expresión de más de 1000 genes de cáncer de mama, incluidos los genes asociados a metástasis y genes supresores de tumores para promover el crecimiento y la metástasis de tumor de mama [11]. Por otra parte, el análisis de supervivencia multivariante mostró que SATB1 fue un factor pronóstico independiente para el cáncer de mama [11]. SATB1 sobreexpresión también se ha asociado con un mal pronóstico en el carcinoma de células escamosas de laringe [12], cáncer gástrico [13], [14], y melanoma maligno cutáneo [15]. La asociación entre SATB1 y el cáncer colorrectal (CRC) sigue sin estar claro
En este estudio, hemos demostrado la implicación de SATB1 en el crecimiento y la metástasis CRC en base a las siguientes pruebas:. (A) se detectó SATB1 sobreexpresión en tanto CRC líneas celulares y los tumores de CRC, (b) las tasas de crecimiento y la formación de colonias estaban regulados en células desmontables-SATB1 pero hasta reguladas en las células SATB1 sobreexpresan, (c) las capacidades de migración y la invasión eran mucho más pobres en las células desmontables-SATB1, mientras más agresivo en las células SATB1 sobreexpresan, (d) SATB1 sobreexpresión promueve la carcinogénesis y la metástasis in vivo mediante el uso de modelos animales, (e) la expresión de la proteína SATB1 fue más abundante en tejidos de CRC que en los tejidos no cancerosos coincidentes, y (f) la expresión SATB1 se encontró que era un factor pronóstico independiente de los pacientes con CCR.
Materiales y Métodos Líneas
2.1 célula y célula Cultura y
SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO y líneas celulares LoVo CRC se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y la Academia china de Ciencias médicas & amp; Peking Union Medical College, y todas las líneas celulares se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; GibcoBRL, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), estreptomicina (100 mg /ml) y penicilina (100 mg /ml). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2.
2.2 Establecimiento de Estable SATB1-desmontables líneas celulares
Tres ARN corto horquilla secuencias (shRNA) fueron diseñados basado en la secuencia SATB1 (NM_002971) identificado por shRNA Buscador de Target (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, California): shRNA1 (2566), 5'-GTCCACCTTGTCTTCTCTC-3 '; shRNA2 (2364), 5'-AAGGACAATTCCGGTTTAGAG-3 '; y shRNA3 (2797), 5'-AAAGTGTGTACCCCGTAAGCA-3 '. Los oligoduplexes se clonaron en el vector pSilencer3.1 (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, California). Las construcciones resultantes se transfectaron en células LoVo o células RKO utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas con vector vacío (pSilencer3.1) se utilizaron como controles. transfectantes shRNA estables fueron seleccionados mediante el cultivo con 600 mg /ml de G418 (GibcoBRL) durante 3 semanas. RT-PCR, western blot y tinción de inmunofluorescencia se utilizaron para confirmar la regulación a la baja de la expresión SATB1.
2.3 Establecimiento de líneas celulares estables que sobreexpresan SATB1
De longitud completa humana SATB1 cDNA fue clonado en el vector de expresión pcDNA3.1 (Ambion; Life Technologies, Carlsbad, California). células SW480 fueron transfectadas con pcDNA3.1-SATB1 o vector vacío (pcDNA3.1) como un control. Los transfectantes con estable sobreexpresión SATB1 fueron seleccionados mediante el cultivo con 600 mg /ml de G418 durante 3 semanas. RT-PCR, western blot y tinción de inmunofluorescencia se utilizaron para confirmar la regulación de la expresión SATB1.
2.4 Pacientes y muestras
tejidos tumorales CRC se obtuvieron de 560 pacientes que fueron diagnosticados y tratados en el Departamento de cirugía, Universidad de Pekín Escuela de Oncología entre 2005 y 2008. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía. Cinco ciento cuarenta y dos de estos pacientes fueron seguidos después de la operación, durante un período de al menos 3 años. E información detallada clinicopatológica se obtuvo de 520 pacientes. tumor colorrectal fresco y muestras de mucosa colorrectal normal correspondiente se obtuvieron de 21 pacientes. Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. Análisis histopatológico se llevaron a cabo de forma independiente por dos patólogos. Para el uso de materiales clínicos con fines de investigación, la aprobación de los comités de ética regionales, el Hospital de Cáncer de Beijing, se obtuvo de China. consentimientos informados escritos han sido obtenidos a partir de todos los participantes. La investigación clínica se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
2.5 Extracción de ARN total y la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa
SATB1 expresión de ARNm se determinó mediante la polimerasa con transcripción inversa reacción en cadena (RT-PCR). El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir del ARN extraído (4 g), utilizando el kit EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Invitrogen). amplificación por PCR se realizó usando las siguientes SATB1 y beta-actina de genes específicos de cebadores: SATB1, 5'-AGAGGAAGGCTTGGGAGTA-3 '(sentido) y 5'-GGGCAGCAGAGCTATGTG-3' (antisentido); y Beta-actina, 5'-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 '(sentido) y 5'-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3' (antisentido). Beta-actina se utilizó para normalizar la expresión génica SATB1. Veintiocho ciclos de PCR se realizaron en los que cada ciclo consistió en pre-desnaturalización a 94 ° C durante 3 min, desnaturalización a 94 ° C durante 45 s, hibridación a 55 ° C durante 45 s y extensión a 72 ° C durante 45 s , y después de los 28 ciclos es una elongación final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel en 2% de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. intensidad de la banda se midió directamente en un sistema de análisis de imágenes 2200 Alfa (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.).
2.6 Análisis de transferencia Western
Las células y tejidos frescos se lisaron en 1 × sodio dodecil sulfato (SDS) tampón de lisis. Igual cantidad de proteínas totales fueron separados por SDS-PAGE, electrotransferred a membranas de difluoruro de polivinilideno (Pall Corporation, Ciudad de México, México), y se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de conejo SATB1 (1:500 dilución, PRS4631; Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Beta-actina (1:10000, Sigma-Aldrich) se utilizó como control de carga. Las bandas de proteínas fueron evaluadas por un aumento de quimioluminiscencia (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.).
2.7 tinción de inmunofluorescencia y de escaneo láser confocal Microscopía
Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio, se fijaron con 4 % de paraformaldehído, permeabilizadas utilizando 0.1% de Triton X-100, se lava, y se bloqueó con 5% de albúmina de suero bovino. Las células se incubaron con anticuerpo primario SATB1 (1:100, PRS4631, Sigma-Aldrich) seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina (01:50; Zhongshan puente Golden Biotecnología, Beijing, China). Los cubreobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) que contiene diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción nuclear y se examinan bajo un microscopio de fluorescencia, las imágenes se construyeron utilizando un software (versión 2.2.1 LAS AF , TCSSP5, Leica, Alemania).
crecimiento
2,8 Cell
El crecimiento celular se evaluó por 3- (4,5-methylthiozol-2-il) bromuro de (MTT) -2,5-difeniltetrazolio. Las células (3 × 10
3 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24, 48, 72, y 96 h. Se añadió MTT (10 l) en cada pocillo, y las células se cultivaron durante 4 h adicionales. Los medios de cultivo se retiró y se añadió a cada 200 l de DMSO (Amresco Inc., Solon, OH, EE.UU.) también. La absorbancia a 570 nm se midió con un lector de microplacas (Imark, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). curvas de crecimiento de la célula se construyeron mediante el trazado de absorbancia (a oscuras por DMSO) contra el tiempo.
2.9 La apoptosis y análisis de citometría de flujo
Estable SATB1 que sobreexpresa, SATB1-desmontables, y las células de control de vector vacío (1 x 10
6 células) se cultivaron en placas de 60 mm durante 48 horas y cosechada. Las células se marcaron con yoduro de propidio y AnnexinV. Los controles negativos consistieron en células no marcadas y controles de isotipo adecuados. Un mínimo de 10.000 eventos en cada muestra fueron recogidos y analizados utilizando un citómetro de flujo. (FACSAria; BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.)
Ciclo
2.10 de Análisis por citometría de flujo
Estable SATB1 que sobreexpresa, SATB1-desmontables, y las células de control de vector vacío se cultivaron en placas de 60 mm y privadas de suero durante 24 h. Las células fueron cultivadas en DMEM suplementado con 10% de FBS durante 48 h. se recogieron las células viables, se fijaron en etanol al 70% y se analizaron por citometría de flujo.
2,11 colonias en agar suave Formación
Stable SATB1 sobreexpresan, SATB1-caída, y las células de control de vector vacío (3 × 10
3) se resuspendieron en DMEM que contenía 3 ml de 0,4% de agarosa, 20% FBS, piruvato sódico 0,5 mM, 10 m MHEPES, y 1% de penicilina /estreptomicina y en capas en la parte superior de 4 ml de 0,8% de agarosa en DMEM en placas de 60 mm. Después de 3 semanas, se contaron las colonias y se fotografiaron.
2.12 Curación de Heridas Ensayo
células de control de vectores estables SATB1 que sobreexpresa, SATB1-desmontables y vacíos se cultivaron en placas de 60 mm hasta que la célula la densidad alcanzó el 90% de confluencia. Una herida horizontal fue creado usando una micropunta 10 l estéril. Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los restos celulares. Se seleccionaron tres áreas diferentes en cada plato para comparar la distancia de migración de las células desde el origen de la herida. Las imágenes fueron capturadas a las 0 y 24 h para evaluar cierre de la herida.
2.13 Transwell migración y la invasión ensayos
Estable SATB1 sobreexpresan, SATB1-desmontables, y las células de control de vector vacío (1 × 10
5) se suspendieron en medio libre de suero de 200 l y se sembraron en la cámara superior de un inserto transwell con un niño de 8 micras membrana de tamaño de poro (Corning Costar Corp., Cambridge, MA, EE.UU.). DMEM que contiene 10% de FBS se colocó en la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de la incubación durante 24 h, las células no migradas en la cámara superior del inserto transwell se retiraron con un hisopo de algodón, y las células migradas en la parte inferior de la membrana de filtro se fijaron y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. El número de células migradas se contó en 5 campos microscópicos seleccionados al azar y se fotografió. El protocolo utilizado para el ensayo de invasión fue el mismo que el utilizado para el ensayo de migración, a excepción de que el inserto transwell se recubrió con Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania).
2,14 In Vivo Carcinogenesis
células de control de vectores SATB1 sobreexpresan y vacíos estables (2 × 10
6) en solución salina balanceada de 100 l Hank (HBSS; GibcoBRL, Life Technologies) se inyectaron en 5 hembras de 4 semanas de edad BALB /c atímicos ratones . SATB1 que sobreexpresan las células de control de vector y vacías se inyectaron por vía subcutánea en el flanco dorsal izquierdo y derecho de cada ratón, respectivamente. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana, y los ratones se sacrificaron después de 4 semanas. Los tumores fueron extirpados, medidos, y se pesaron. Los tumores se fijaron en formalina al 10% para el análisis histopatológico o se almacenaron a -80 ° C para la RT-PCR y Western blot. Todos los experimentos con animales se realizó de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Facultad de Oncología de la Universidad de Pekín (Número de Permiso: 2012-07). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
2.15 modelo de xenoinjerto animal de pulmón e hígado Metástasis
Se determinó el efecto de la expresión SATB1 sobre la CRC metástasis en modelos de ratón con xenoinjerto de cáncer de pulmón y las metástasis de hígado. En el modelo de metástasis hepática, una sola célula suspensiones de células de control de vectores que sobreexpresan SATB1 y vacíos estables (2 × 10
6) en 100 l se inyectaron lentamente HBSS en el bazo de ratones Balb /c atímicos bajo anestesia. En el modelo de metástasis de pulmón, una sola célula suspensiones de células de control de vectores que sobreexpresan SATB1 y vacías (2 × 10
6) en 100 l HBSS fueron inyectados en la vena lateral de la cola. Cinco ratones fueron incluidos en cada grupo de tratamiento. Los ratones se sacrificaron 8 semanas después de la inyección, y los bazos, hígados y pulmones fueron extirpados quirúrgicamente. Se documentaron el número y tamaño de los focos metastásicos en el hígado y el pulmón. Las muestras fueron fijadas en formol al 10% o se almacenaron a -80 ° C para su posterior análisis.
2.16 Análisis inmunohistoquímico de microarrays de tejidos
fijados con formalina, tumor colorrectal incluido en parafina y adyacente normal de la mucosa colorrectal especímenes se construyeron en microarrays de tejidos (TMA). secciones de bloque TMA (4 M) se deparaffinized y rehidratada clasificado en el alcohol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en un horno de microondas por tampón de EDTA. Las células se incubaron en peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena y luego en la leche no grasa 5% para evitar la unión no específica. secciones de bloque de TMA se incubaron durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo monoclonal específico SATB1 conejo (1:50, ab92307; Abcam, Cambridge, CA, EE.UU.) o un anticuerpo monoclonal de conejo contra SATB2 (1:200, TA307098; OriGene Technologies, Inc .). Para los controles negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos con PBS. Todas las secciones se examinaron microscópicamente y se puntuaron por dos patólogos independientes que fueron cegados a la información clínica de los sujetos. A diferencia de las secciones ordinarias, SATB1 o SATB2 tinción inmunohistoquímica en los chips de micromatriz de tejido era casi el 100% nuclear teñida o no teñida de tejido tumoral o la mucosa colorrectal normal, por lo que la evaluación de su tinción, que sólo tuvo en cuenta la intensidad de la tinción de inmunohistoquímica positiva núcleo. intensidad nuclear se denota como negativo, positivo débil, moderadamente positiva o muy positiva. Y cuando se lleva a cabo el análisis estadístico, se combinaron los pacientes de tinción positiva débil, moderadamente positiva y fuertemente positiva como grupo de una tinción positiva.
2.17 Análisis estadístico
software SPSS 16.0 (SPSS Inc. , Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para realizar los análisis estadísticos. Todos los experimentos in vitro se realizaron por triplicado y se repitieron 3 veces. No pareada de 2 colas
t
pruebas fueron utilizados para comparaciones de grupos después de verificar la normalidad y la homogeneidad de la varianza. Los datos de las ilustraciones y el texto se presentan como la media ± desviación estándar. prueba de ji cuadrado de dos colas (χ
2) o se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la relación entre la expresión SATB1 y los factores clínico-patológicos o expresión SATB2. Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar el pronóstico del paciente, y los valores de p se calcularon mediante la prueba de log-rank. Se utilizó el análisis multivariado por Cox modelo de regresión de riesgos proporcionales para determinar el efecto de la expresión SATB1 y los factores clínico-patológicos en la supervivencia del paciente. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
3.1 Expresión de SATB1 en líneas celulares de CRC
La expresión del ARNm y la proteína de SATB1 en 6 CRC celular humana. líneas, SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, y LoVo se muestran en la Fig. 1A. SATB1 ARNm y la expresión de proteínas no se detectaron en SW480, SW620, HT-29, y las células HCT116. SATB1 mRNA se detectó en las líneas de células RKO y LoVo altamente metastásicas. Además, la proteína SATB1 fue altamente expresado en las células RKO y LoVo. Así líneas celulares LoVo y RKO fueron elegidos para una serie de experimentos desmontables SATB1, y líneas de células SW480 para los experimentos de sobreexpresión SATB1.
(A) de ARNm y proteínas SATB1 expresiones se determinaron en 6 líneas celulares (A) CRC , SW480, SW620, HT-29, HCT116, RKO, y LoVo; (B) los tumores colorrectales representativos y mucosa normal correspondiente; (C) los tumores moderadamente diferenciados y pobremente y mucosa normal; y (D) los tumores colorrectales representativos y los tumores de metástasis hepáticas sincrónicas focos coincidentes. SATB1 ARNm y la expresión de proteínas se determinaron por RT-PCR y Western blot, respectivamente, y se normalizaron a beta-actina. T, los tumores colorrectales; N, corresponde mucosa normal; M, tumores metástasis hepáticas sincrónicas focos.
3.2 Expresión de SATB1 en CRC primaria y metástasis hepática focos
El nivel de expresión del ARNm y la proteína SATB1 se determinó en el tumor primario y coincide CRC muestras de mucosa no tumorales. Entre los 21 casos coincidentes, SATB1 mRNA y la proteína se detectaron en 17 muestras de tumores, pero no en ninguna de las muestras de mucosa no tumorales (Fig. 1B). Por otra parte, SATB1 ARNm y la expresión de la proteína fueron mayores en muestras de tumores poco diferenciados que en muestras de tumores moderadamente diferenciados (fig. 1C). SATB1 ARNm y la expresión de proteínas en CRC primaria fue similar a la de emparejado focos de metástasis hepática síncrono (Fig. 1D).
3,3 represión de SATB1 expresión se reduce la proliferación celular, la formación de colonias, migración y la invasión in vitro
Para evaluar el papel de SATB1 en la progresión del CRC, se establecieron tres líneas celulares LoVo desmontables-SATB1 estables usando shRNA. SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, y SATB1-shRNA3 líneas celulares fueron efectivos en la regulación negativa de SATB1 mRNA y expresión de la proteína (Fig. 2A). expresión de la proteína de SATB1 fue apenas detectable en las células SATB1-shRNA1 y SATB1-shRNA2. SATB1 expresión mRNA se redujo en casi 90% en las células SATB1-shRNA1, y por 70% y 60% en las células SATB1-shRNA2 y SATB1-shRNA3, respectivamente (Fig. 2A). La tasa de crecimiento de todas las líneas celulares SATB1-shRNA fue más lenta que la de las células de control del vector vacío (P & lt; 0,05, Fig 2B.). Como se muestra en la Fig. 2C, las células SATB1-shRNA1 tuvo un porcentaje significativamente mayor de células apoptóticas que las células control (45,1% V.S. 20,3%, p & lt; 0,01). Sin embargo, el porcentaje de células apoptóticas no fue significativamente diferente entre la SATB1-shRNA2, SATB1-shRNA3, y control de las células (datos no presentados). SATB1 knockdown detención del ciclo celular en fase G1 inducida: el porcentaje de células en fase G0 /G1 fue mayor en SATB1-shRNA1 (46,4%) y SATB1-shRNA2 células (45,6%) que en las células de control (36,8%) (p & lt; 0.01; Fig. 2D). En contraste, el porcentaje de células en G2 /fases M y S fue significativamente menor en las células shRNA1 y shRNA2 que en las células de control (P & lt; 0.01; Fig. 2D). cambios en el ciclo celular no se observaron en las células SATB1-shRNA3 (datos no mostrados). Estos resultados indicaron que SATB1 puede desempeñar un papel importante en la promoción del crecimiento y la supervivencia de las células de CRC.
Se establecieron (a) tres líneas celulares LoVo SATB1-desmontables estables usando shRNA. Las células transfectadas con el vector vacío sirvieron como controles. La eficacia de SATB1 caída se verificó mediante RT-PCR (panel superior izquierdo), western blot (panel inferior izquierdo) e inmunofluorescencia (panel derecho). β-actina se utilizó para garantizar la igualdad de carga. (B) La proliferación celular de control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, y SATB1-shRNA3 se determinó mediante el ensayo de MTT. (C) La apoptosis de las células de control de vector vacío SATB1-shRNA1 y se determinó mediante citometría de flujo análisis de PI y Anexina V tinción. (D) La citometría de flujo análisis de ciclo celular en el control de vector vacío, SATB1-shRNA1, y SATB1-shRNA2 células. (E) la formación de colonias en agar blando de control de vector vacío, SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, y SATB1-shRNA3 células después de 3 semanas. * P & lt; 0,001. (F) La migración de control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, y SATB1-shRNA3 se determinó mediante un ensayo de cicatrización de la herida (panel izquierdo) y ensayo de migración transwell (panel superior derecho). El número de células migradas en el ensayo de migración transwell se cuantificó contando las células en la parte inferior de la membrana de filtro en 5 campos microscópicos seleccionados al azar (panel inferior derecho). * P & lt; 0,001, el número de células migradas en comparación con el control. (G) la invasión de la célula de control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1, SATB1-shRNA2, y SATB1-shRNA3 se determinó mediante un ensayo de invasión de Matrigel Transwell. El número de células invadidas se cuantificó contando las células en la parte inferior de la membrana de filtro en 5 campos microscópicos seleccionados al azar. * P & lt; 0,001, el número de células invadidas comparación con el control
Desmontables de expresión SATB1 disminuyó el tamaño tasa de formación de colonias y de colonias (Fig 2E.).. En las células de control, casi 100 a 120 colonias se pudo observar en los campos microscópicos seleccionados al azar. Por el contrario, la formación de colonias eran mucho menos en los tres células SATB1-shRNA (shRNA1: 28,75 ± 8,5; shRNA2: 34,5 ± 7,8; shRNA3: 40,5 ± 4,5). Desmontables de SATB1 también redujo la motilidad celular como se evidencia por el cierre de la herida más amplias en las líneas celulares SATB1 3-shRNA en comparación con los de las células de control (Fig. 2F). La capacidad invasiva fue significativamente menor en las células SATB1-shRNA1, shRNA2, y shRNA3 que en las células de control (P & lt; 0,001; Fig. 2G). Estos resultados fueron consistentes con los de la ensayo de migración transwell (Fig. 2F).
Además, hemos probado la tasa de crecimiento y capacidad de migración /invasión en líneas de células RKO. SATB1-desmontables de líneas de células RKO se estableció utilizando líneas celulares (shRNA1 SATB1-shRNA1 RKO con nombre). Tanto de los niveles de ARNm y de proteína de SATB1 se downregulated eficazmente por shRNA1 (Fig. 3A). Consistente con desmontables experimentos SATB1 en líneas celulares LoVo, la tasa de crecimiento de líneas de células SATB1-shRNA1 RKO fue más lenta que la de las células de control del vector vacío (p & lt;. 0.05, Figura 3B), y líneas de células RKO SATB1-shRNA1 también mostraron la detención del ciclo celular en fase G1 (Fig. 3C). Migración de ensayo proporcionado la evidencia de que desmontables de gen SATB1 podría reducir la motilidad celular (p & lt;. 0.001 Fig 3D). Y en líneas de células RKO, la capacidad invasiva se redujo significativamente por abajo de la regulación de la expresión SATB1, como se muestra en la Fig. 3E (p & lt; 0,001).
(A) líneas de células RKO SATB1-desmontables se estableció utilizando shRNA1. Las células transfectadas con el vector vacío sirvieron como controles. La eficacia de SATB1 caída se verificó por RT-PCR y Western blot. β-actina se utilizó para garantizar la igualdad de carga. (B) La proliferación celular de control de vector vacío, y las células SATB1-shRNA1 RKO se determinó mediante el ensayo de MTT. (C) La citometría de flujo análisis de ciclo celular en el control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1 RKO. (D) La migración de control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1 RKO se determinó mediante ensayo de migración transwell. * P & lt; 0,001, el número de células migradas en comparación con el control. (E) la invasión de la célula de control de vector vacío, las células SATB1-shRNA1 RKO se determinó mediante Matrigel Transwell ensayo de invasión. * P & lt; 0,001, el número de células invadidas comparación con el control
3.4 La sobreexpresión de SATB1 promueve la proliferación celular, la formación de colonias, migración y la invasión in vitro
A fin de verificar el papel. de SATB1 en la progresión del CRC, una línea de células que sobreexpresan SATB1 se estableció utilizando células SW480 poco metastásicas. SATB1 sobreexpresión se verificó por transferencia de western, RT-PCR, y la tinción de inmunofluorescencia (Fig. 4A). La tasa de crecimiento fue mayor en las células SATB1 sobreexpresan que en las células de control del vector vacío (P & lt; 0.05; Fig. 4B). El porcentaje de células apoptóticas fue menor en las células que sobreexpresan SATB1-que en las células de control (28,7% V.S. 36,1%, p & lt; 0.01; Fig. 4C). La sobreexpresión de SATB1 promueve la progresión del ciclo celular de la fase G0 /G1 a G2 M y S fases /(56,3% G0 /G1 fase en líneas celulares SATB1 sobreexpresan en comparación con 63,6% G0 fase G1 /en las células de control) (Fig. 4D). tasa de formación de colonias y tamaño de las colonias eran más altas en las células que sobreexpresan SATB1-(67,5 ± 9,5) que en las células de control (24,75 ± 2,75) (Fig. 4E). SATB1 sobreexpresión aumentó la migración de células como se evidencia por el cierre completo de la herida y las células más emigrado en las células que sobreexpresan SATB1-(Fig. 4F). Además, la capacidad de invasión fue mayor en las células que sobreexpresan SATB1-(109 ± 8,7) que en las células de control (12,75 ± 4,5) (Fig. 4G).
células SW480 (A) se transfectaron con el pcDNA3 vector de expresión 0,1-SATB1 o vector vacío. SATB1 regulación al alza de la expresión de ARNm y proteínas se verificó mediante RT-PCR (panel superior izquierdo), western blot (panel inferior izquierdo) e inmunofluorescencia (panel derecho). β-actina se utilizó para garantizar la igualdad de carga. (B) La proliferación celular de control de vector vacío y las células pcDNA3.1-SATB1 se determinó mediante el ensayo de MTT. (C) La apoptosis de control de vector vacío y células pcDNA3.1-SATB1 se determinó mediante citometría de flujo análisis de PI y Anexina V tinción. (D) La citometría de flujo análisis de ciclo celular en el control de vector vacío y células pcDNA3.1-SATB1. (E) la formación de colonias en agar blando de las células de control de vectores y pcDNA3.1-SATB1 vacías después de 3 semanas. (F) La migración de control de vector vacío y pcDNA3.1-SATB1 células se determinó mediante un ensayo de cicatrización de la herida (panel izquierdo) y ensayo de migración transwell (panel derecho). * P & lt; 0,001, el número de células migradas en comparación con los controles. (G) la invasión de la célula de control de vector vacío y células pcDNA3.1-SATB1 se determinó por Matrigel Transwell ensayo de invasión (* p & lt; 0,001).
3,5 SATB1 promueve el crecimiento y metástasis de las células en CRC vivo
a continuación, se evaluó el efecto de la sobreexpresión SATB1 en CRC carcinogénesis in vivo, el ARNm y la expresión de proteínas de SATB1 fueron mayores en los tumores de las células que sobreexpresan SATB1-que en los tumores de las células de vector vacío (Fig. 5A). Los tumores de las células que sobreexpresan SATB1-tuvieron una tasa de crecimiento más rápida que los tumores de las células de control, que era consistente con las tasas de crecimiento in vitro (p & lt;. 0.01, Fig 5A, panel superior). Los pesos de los tumores de las células que sobreexpresan SATB1-eran aproximadamente 5-6 veces más pesados que los de las células de vector vacío, lo que indica que SATB1 podría promover el crecimiento de tumores colorrectales in vivo (Fig. 5A, panel inferior).
(A) mRNA y las expresiones de proteínas de SATB1 inxenograft tumores de control de vector vacío y las células pcDNA3.1-SATB1 se determinaron por RT-PCR y Western blot, respectivamente (panel superior izquierdo). Entonces, el crecimiento del tumor se determinó en un modelo de xenoinjerto in vivo. Las células de control de vectores que sobreexpresan SATB1 y vacíos estables (2 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco dorsal izquierdo y derecho, respectivamente, en 5 mujeres ratones BALB /c atímicos. tamaños de los tumores se midieron dos veces por semana, y los ratones se sacrificaron después de 4 semanas.