Extracto
Antecedentes
El estudio fue diseñado para detectar el nivel de expresión de oligopeptidasa thimet (THOP1) de proteínas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) e investigar su correlación con las características clínico-patológicas y el pronóstico.
Métodos
la tinción inmunohistoquímica se utilizó para determinar la expresión de la proteína THOP1 en 120 muestras de NSCLC y 53 tejidos pulmonares normales distantes. Cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot se emplearon para medir la expresión de THOP1 en 16 pares de NSCLC primario y los tejidos normales correspondientes.
Resultados
El análisis de tinción inmunohistoquímica sugirió que se encuentra bajo la expresión THOP1 en 71 (59,2%) de las muestras de NSCLC 120 y se correlacionó significativamente con la positiva metástasis en ganglios linfáticos (
P = 0,048
). Sin embargo, la expresión bajo THOP1 se encontró en 22 (41,5%) de los 53 tejidos pulmonares normales. prueba de chi-cuadrado sugirió que la expresión de THOP1 fue significativamente mayor en los tejidos pulmonares normales que en las muestras de NSCLC (
P = 0,032)
. Real-Time PCR y Western Blot mostró que las muestras de NSCLC habían disminuido THOP1 ARNm y la expresión de proteínas en comparación con los tejidos normales correspondientes. El análisis univariante demostró que la baja expresión THOP1 predijo significativamente disminuido 5 años de supervivencia libre de enfermedad (
P = 0,038
) y la supervivencia global (
P = 0,017
). Además, positivo metástasis en ganglios linfáticos (
P
= 0,025) y el estadio TNM avanzada (
P
= 0,009) predijeron de manera significativa disminución de la supervivencia global a los 5 años. Sin embargo, el análisis de regresión de Cox multivariado mostró que sólo una baja expresión THOP1 conservó su importancia como factor pronóstico independiente para la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años desfavorable (
P = 0,046
) y la supervivencia global (
P
= 0,021).
Conclusiones
THOP1 puede tener potencial clínico para ser empleadas como un prometedor biomarcador para identificar individuos con mejor pronóstico y un agente antitumoral novedoso para el tratamiento de pacientes con NSCLC.
Visto: Qi L, Li Sh, Si Lb, Lu M, Tian H (2014) Expresión de THOP1 y su relación con el pronóstico en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (9): e106665. doi: 10.1371 /journal.pone.0106665
Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de mayo de 2014; Aceptado: July 30, 2014; Publicado: 2 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Qi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30571844), la Fundación de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo de la provincia de Shandong (n . 2009GG10002007), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (núm ZR2009CM090). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es una de las neoplasias intratorácicas más comunes en todo el mundo debido a su tardía presentación clínica y la progresión rápida [1], [2]. A pesar de algunos avances en la detección temprana y la resección quirúrgica radical combinada con la terapia adyuvante durante la última década, el pronóstico de los pacientes con CPNM siguen siendo relativamente pobres [3]. En general se reconoce que la heterogeneidad genética y los factores ambientales conducen a la tumorigénesis del cáncer de pulmón al mismo tiempo. Por lo tanto, la identificación de nuevos biomarcadores de pronóstico con posible relevancia pronóstica y terapéutica es importante optimizar el tratamiento del CPNM
oligopeptidasa Thimet (THOP1; EC3.4.24.15 o EP 24.15). Metalopeptidasas es una característica de zinc con un HEXXH motivo de unión y asociadas con el metabolismo de varios neuropéptidos que contienen de 5 a 17 aminoácidos, tales como bradicinina, hormona liberadora de gonadotropina, opioides y neurotensina [4], [5], [6]. La evidencia acumulada sugiere que THOP1 se expresó predominantemente en el citosol, retículo endoplásmico, mitocondrias y núcleo de diferentes tejidos humanos normales y células tumorales [7], [8], [9]. Además, el análisis inmunohistoquímico indica que THOP1 estaba presente en 90% de la línea de células NSCLC H1299 y secretada por las células para escindir y activar DTS-201 [10]. Un estudio reciente demostró que el alto nivel de expresión de ARNm THOP1 en el hígado normal del fondo del carcinoma hepatocelular (HCC) se correlacionó significativamente con una mejor supervivencia [11]. Además, THOP1 podría inhibir la angiogénesis tumoral y la proliferación tumoral promovido por BK en células de melanoma [12]. Estos hallazgos indican THOP1 puede ser un agente anti-tumor potencial para la terapia de tumores.
Expresión de THOP1 y su papel en el pronóstico de NSCLC no se ha investigado hasta el momento. Por lo tanto, se han detectado niveles de expresión de la proteína THOP1 en pacientes con CPNM empleando el método inmunohistoquímico para investigar su correlación con las características clínico-patológicas, recidiva tumoral y el pronóstico postoperatorio.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital Qilu. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente para publicar los detalles del caso, y la adquisición de las muestras de tejido se llevó a cabo según lo prescrito por las directrices institucionales.
Los pacientes
Las muestras tumorales (n = 120, significan edad 61 ± 4,35 años) y distantes tejidos pulmonares normales (n = 53, 5 cm del margen del tumor) se recogieron de pacientes con NSCLC que fueron sometidos a resección completa del tumor (lobectomía o neumonectomía) con disección de los ganglios linfáticos regionales entre enero de 2006 y diciembre de 2007 a Departamento de Cirugía Torácica, hospital Qilu. El examen histológico y el grado de diferenciación de las células del cáncer se basan en el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud en 2004 y revisado sistema de estadificación TNM de la UICC de 2009. Ninguno de los pacientes habían sido sometidos a una resección incompleta y recibido quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Las características clínicas de estos 120 pacientes se presentan en la Tabla 1.
La inmunohistoquímica
tinción inmunohistoquímica para THOP1 se llevó a cabo utilizando el método de estreptavidina-peroxidasa. En resumen, las secciones 4-m de espesor se cortaron de los bloques incluidos en parafina, se desparafinaron en xileno y se deshidrataron a través de una serie de alcohol graduado. Las secciones se incubaron en tampón de citrato (pH 6,0) con un horno de microondas. Después de ser enfriada a temperatura ambiente, los portaobjetos se incubaron en peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 min para bloquear la actividad peroxidasa endógena y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra THOP1 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU., dilución 1:50) durante la noche a 4 DO. Posteriormente, se aplicaron el anticuerpo secundario biotinilado y el reactivo de complejo de estreptavidina conjugada con peroxidasa, seguido de contratinción con hematoxilina de Mayer. Los controles positivos y negativos fueron incluidos en cada paso.
Evaluación de la expresión de la proteína THOP1
Los immunostained diapositivas fueron evaluados por dos investigadores independientes de una manera ciega y reevaluados por estos investigadores bajo un microscopio multicabezal en casos discordantes para llegar a un consenso. La expresión de la proteína THOP1 se evaluó mediante el cálculo de una puntuación total inmunotinción como el producto tanto de la puntuación de intensidad (0, tinción negativa; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, fuerte tinción) y la puntuación de porcentaje (0, 0- 5%; 1, 6-25%; 2, 26 a 50%; 3, 51 a 75%; 4, ≥76%), respectivamente. Por lo tanto, la puntuación total varió de 0 a 7. El valor de corte para la expresión alta y baja THOP1 se determinó sobre la base de un valor medido heterogeneidad a través de un análisis estadístico de log-rank con respecto a la supervivencia global. El percentil que rindió al mínimo
P
valor fue elegido como punto de corte [13]. En resumen, los 120 pacientes fueron dispuestas por orden de la puntuación total tinción detectado mediante análisis inmunohistoquímico de grande a pequeño. En cada percentil de 10 a 90, los datos se dividieron en dos grupos y se analizaron las diferencias en la supervivencia global mediante la prueba de log-rank. El percentil 41 o correspondiente a la puntuación total tinción de 4 cedió al mínimo
P
valor (
P = 0,017
) y fue elegido como el punto de corte. Por lo tanto, la puntuación total de 4 tinción fue elegido como el punto de corte para la discriminación entre la expresión de alto y bajo THOP1. Los tumores con una puntuación total de tinción ≥4 fueron definidos como de alta THOP1 expresión, y los tumores con una puntuación total de tinción. & Lt; 4 fueron definidos como de bajo THOP1 expresión
La extracción de RNA, transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN totales se extrajeron de los tejidos mediante el uso de la Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El ADN complementario (ADNc) se sintetizó por el Sistema de superíndice III primer capítulo de síntesis (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Quantitative PCR en tiempo real se llevó a cabo mediante el uso de SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, EE.UU.) para THOP1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de THOP1 ARN mensajero (ARNm) se normalizaron al nivel de expresión β-actina humana y calcularon utilizando la 2
- método (△△ CT). Se utilizaron cebadores como los siguientes: sentido: Los cebadores para la β-actina fueron: 5'-GCATCCACGAAACTACCT-3 '(hacia delante) y 5'-GAAAGGGTGTAACGCAAC-3' (hacia atrás). THOP1 cebadores fueron: 5'-CAT GGC CAA CAG CAG CCA GA-3 '(hacia delante) y 5'-CGC ACG CTT CAG CTC CAG AA-3' (inverso)
SDS-PAGE y Western Blot.
Las proteínas fueron extraídas con tampón de lisis RIPA. Igual cantidad (20 g) de proteína se sometieron a análisis SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpos primarios. Anticuerpo contra THOP1 fue adquirido de Abcam (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU., dilución 1:1000). Anti-β-actina de anticuerpos fue adquirido de Sigma (Sigma, St. Louis, EE.UU.). Las bandas de proteínas se detectaron utilizando el método de quimioluminiscencia (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). La densidad de banda óptica se cuantificó (Imager de Alfa Corporation, San Leandro).
Seguimiento
A todos los pacientes dados de alta fueron seguidos en el ambulatorio cada 3 a 6 meses. La evaluación de seguimiento de los pacientes consistió en el examen físico, análisis de sangre, tomografía computarizada, ecografía, radiografía de tórax, y fibrobroncoscopia si es necesario. La ubicación y el momento de la recaída del tumor se registraron. El seguimiento se completó en todos los pacientes hasta diciembre de 2013, y el período medio de seguimiento fue de 48 meses (rango: 15~96 meses).
Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos fue realizado por SPSS 17.0 sistema. Se realizó la prueba de chi-cuadrado para examinar la asociación de THOP1 y diversos factores clínico-patológicos. El tiempo de seguimiento fue censurado si el paciente se perdió durante el seguimiento. Las curvas de supervivencia se extrajeron utilizando el método de Kaplan-Meier y se compararon mediante la prueba de log-rank. Se utilizó un análisis de regresión multivariante de Cox para identificar los factores pronósticos independientes. Todos los datos son la media ± desviación estándar (SD) a partir de ensayos independientes. Otros análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student.
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
> 1.. La expresión de THOP1 en CPNM y su correlación con factores clínico-
Se detectó la expresión de la proteína THOP1 en 120 muestras de NSCLC y 53 tejidos pulmonares normales mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 1, inmunohistoquímica con anticuerpos THOP1 mostraron una reacción positiva en el citoplasma de células de NSCLC. De acuerdo con nuestros criterios anteriormente definidos, la expresión de alto THOP1 se encontró en 49 (40,8%) de las muestras de tumor de 120 y bajo THOP1 expresión se encontró en 71 (59,2%) de las muestras de tumor de 120. Además, como controles negativos, la inmunotinción sin anticuerpos primarios no dio lugar a la tinción. Como se muestra en la Fig. 2, THOP1 fue altamente expresado en el citoplasma de las células del epitelio bronquial normal y los neumocitos. La expresión de alto THOP1 se encontró en 31 (58,5%) de los 53 tejidos pulmonares normales y bajo THOP1 expresión se encontró en 22 (41,5%) de los 53 tejidos pulmonares normales. La expresión de THOP1 fue significativamente mayor en los tejidos pulmonares normales que en las muestras de NSCLC (prueba de chi-cuadrado,
P = 0,032
).
Varios intensidades de THOP1 expresión de la proteína en el adenocarcinoma, expresión negativa (A), con débil (B), moderada (C), y la expresión (D) fuerte. Diversas intensidades de expresión de la proteína THOP1 en el cáncer de células escamosas, expresión negativa (E), con débil (F), moderada (G), y fuerte (H) la expresión.
Las relaciones entre THOP1 expresión de proteínas y factores clínico-patológicas se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado, y nuestros datos mostraron que la expresión más baja THOP1 se correlacionó significativamente con la positiva metástasis en ganglios linfáticos (
P = 0,048
). No hubo significación estadística en las relaciones entre THOP1 expresión y otras variables clínico-patológicas (
P Hotel & gt; 0,05, Tabla 1).
Para investigar la expresión de genes en THOP1 NSCLC, hemos utilizado cuantitativa real -Tiempo PCR para medir la expresión de los niveles de ARNm de THOP1 en 16 pares de tumores primarios y los tejidos normales correspondientes. En comparación con sus tejidos normales correspondientes, las muestras de NSCLC habían disminuido THOP1 la expresión de ARNm (Figura 3A). En consonancia, el Western Blot análisis mostró que 12 de 16 muestras de NSCLC habían disminuido THOP1 la expresión de proteínas en comparación con sus correspondientes tejidos normales (Figura 3B).
A. La expresión de mRNA THOP1 en los tejidos de NSCLC fue menor que en los tejidos pulmonares normales (
P
& lt; 0,01). El análisis de transferencia Western sugirió que B. muestras de NSCLC habían disminuido THOP1 expresión de la proteína en comparación con los tejidos normales correspondientes. N: tejido pulmonar normal, T:. Muestras de NSCLC
2. análisis de supervivencia univariante y multivariante de supervivencia libre de enfermedad a 5 años
recidiva tumoral desarrollado dentro del periodo de seguimiento de 82 (68,3%) de los 120 pacientes: la recurrencia local en 18 pacientes, metástasis a distancia en 52 pacientes y tanto la recurrencia local y metástasis a distancia en 12 pacientes. El análisis univariante (log-rank test) demostró que la baja expresión THOP1 (25,4% frente a 40,8%,
P = 0,038
, Figura 4A) predijo de manera significativa disminución de la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años. Por otra parte, los resultados del análisis de regresión de Cox multivariado mostró que la baja expresión THOP1 conservó su importancia como factor pronóstico independiente para la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años desfavorable (
P = 0,046
, Tabla 2).
3. análisis de supervivencia univariante y multivariante de 5 años la supervivencia global
De los 120 pacientes, 73 (60,8%) casos murió de causas relacionadas con el cáncer dentro de los 5 años después de la operación, la supervivencia global a los 5 años fue del 39,2%. El análisis univariante (log-rank test) demostró que la baja expresión THOP1 (29,6% frente a 53,1%,
P = 0,017
, Figura 4B), metástasis en los ganglios linfáticos positivos (29,0% frente a 50,0%,
P
= 0,025, Figura 4C) y la fase avanzada TNM (30,1% frente a 53,2%,
P = 0,009
, Figura 4D) predijo significativamente peor supervivencia global a los 5 años (Tabla 3). Los resultados del análisis de regresión de Cox multivariado mostraron que el efecto positivo pronóstico significativo de metástasis en los ganglios linfáticos (
P = 0,653
, Tabla 3) y el estadio TNM avanzada (
P = 0,218
, Tabla 3) observado en el análisis univariado desaparecieron, y sólo bajo THOP1 expresión conservó su importancia como factor pronóstico independiente de la supervivencia global desfavorable (
P = 0,021
, Tabla 3).
Discusión
a pesar de ser considerado para jugar un papel en el sistema neuroendocrino [14], THOP1 ha convertido en un foco reciente en la investigación tumor. estudios de fraccionamiento celular han demostrado que THOP1 está presente en las fracciones subcelulares de partículas del tejido nervioso central [15] y secretada a partir de líneas celulares característicos, tales como el glioma de rata C6 [16] y el ratón AtT-20 [17]. Por otra parte, la expresión de alto THOP1 mRNA en tejido normal correspondiente de carcinoma hepatocelular (HCC) se correlaciona con una mejor supervivencia global [11]. Sin embargo, pocos estudios han detectado la expresión de la proteína en los tejidos tumorales THOP1 y su relación con el pronóstico del tumor.
En el presente estudio, se determinó la expresión de THOP1 en CPNM y los tejidos normales correspondientes, y luego analizaron las relaciones entre THOP1 expresión y otras variables clínico-patológicas en NSCLC. Los resultados de nuestro estudio mostraron que THOP1 fue universalmente expresada en NSCLC y los tejidos normales correspondientes, y la expresión de THOP1 en los tejidos normales del CPNM fue significativamente elevado en los dos niveles de mRNA y proteína. Además, una menor expresión THOP1 en el CPNM se correlacionó significativamente con la positiva metástasis en ganglios linfáticos. El análisis de Kaplan-Meier en este estudio mostró que la expresión de bajo THOP1 predijo significativamente disminuido 5 años de supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global. Además, positivo metástasis de los ganglios linfáticos y el estadio TNM avanzada predijo significativamente menor supervivencia global a 5 años. Para eliminar el impacto de factores mixtos correlacionaron con un pronóstico en el análisis estadístico, se realizó el análisis multivariado de regresión de Cox para determinar los factores pronósticos independientes. El análisis multivariado mostró que sólo THOP1 mantuvo su valor pronóstico como factor pronóstico independiente de mal libre de enfermedad y la supervivencia global. Nuestro análisis de supervivencia demostró que la expresión de la proteína THOP1 podría ser un marcador de diagnóstico útil para los pacientes con NSCLC. Como se indicó anteriormente, nuestros resultados implícita de que la proteína THOP1 puede tener un efecto antitumoral en la carcinogénesis y la progresión del tumor de NSCLC.
estudio anterior sugirió que THOP1 era capaz de hidrolizar varios tipos de péptidos bioactivos tales como la bradiquinina (BK) [ ,,,0],18]. BK es un importante mediador responsable de la angiogénesis asociada a tumores y el crecimiento del tumor [19], [20], [21]. Además, BK estuvo implicado en la carcinogénesis y la progresión del cáncer mediante el aumento de la expresión de la integrina α2β1 a través de la vía de señalización del receptor de BK [22]. Por otra parte, como un antagonista de factor de BK, THOP1 podría inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral promovido por BK [12]. La angiogénesis patológica es un evento relativamente temprano en la carcinogénesis y el aumento de la angiogénesis tumoral se correlaciona con la invasión tumoral, metástasis y mal pronóstico [23], [24]. Por lo tanto, la disminución de la expresión de THOP1 en NSCLC puede ser responsable del desarrollo de cáncer, tumores malignos y pobres tasa de supervivencia debido a su reducción en la función anti-BK. Se ha hecho
progreso emocionante en el empleo de THOP1 para la inmunoterapia en el cáncer. Se informó de que THOP1 secretada por las células tumorales era un candidato muy probable para la activación extracelular de CPI-0004Na que era un profármaco de doxorubicina y el índice terapéutico mejorado de CPI-0004Na comparación con la doxorrubicina libre se confirmó en tres modelos de xenoinjerto de tumor de de próstata, de mama, y cáncer de pulmón [10], [25]. Otro estudio sobre los linfocitos T citotóxicos (CTL) sugirió THOP1 podría reforzar la defensa inmune contra patógenos intracelulares y el cáncer, contribuyendo a la guarnición C-terminal de los epítopos de CTL [26]. Por lo tanto, THOP1 puede tener potencial clínico para ser empleado como un agente más útil de la terapia antitumoral en pacientes con NSCLC.
En conclusión, nuestro análisis retrospectivo proporcionado pruebas de que la expresión de THOP1 fue significativamente mayor en los tejidos pulmonares normales que en las muestras de NSCLC, y baja expresión THOP1 se correlacionó significativamente con la metástasis en los ganglios linfáticos positivos en el CPNM. Además, la expresión de proteínas de alta THOP1 exhibió propiedades antitumorales y mostró influencia positiva en la supervivencia libre de enfermedad y global. Por lo tanto, THOP1 puede tener potencial clínico para ser empleadas como un biomarcador prometedor para identificar a los individuos con un mejor pronóstico y un agente antitumoral novedoso para el tratamiento de pacientes con NSCLC.