Extracto
Fondos
La expresión de livin, un miembro de los inhibidores de la familia de proteínas de la apoptosis, se asocia con el desarrollo y progresión del tumor. Los objetivos de este estudio fueron evaluar si afecta de Livin comportamiento biológico oncogénica de las células del cáncer colorrectal, y para documentar la relación entre su expresión y diversos parámetros clínico en el cáncer colorrectal.
Métodos
Hemos investigado el impacto de livin en el comportamiento de las células tumorales mediante el uso de la ARN interferente pequeño y vector pcDNA3.1 en líneas celulares de cáncer colorrectal SW480 y DKO1. La expresión de de Livin fue investigado por RT-PCR e inmunohistoquímica en tejidos de cáncer coloretcal. Las células apoptóticas se visualizaron mediante el ensayo de TUNEL, las células proliferativas y se visualizaron por tinción con Ki-67 anticuerpo.
Resultados
Desmontables de livin suprimió la migración de células tumorales y la invasión de células de cáncer colorrectal. Desmontables de la apoptosis inducida Viviendo por la inducción de expresión de p27 hasta la regulación de la caspasa-3, -7 y PARP actividades y la detención del ciclo celular por la disminución de ciclina D1, ciclina D3, la quinasa dependiente de ciclina 4 y 6, y por. Las cascadas de señalización de MAPK se bloquearon de manera significativa por desmontables de livin. Por el contrario, la sobreexpresión de livin mejorada migración de células tumorales y la invasión, y se inhibe la detención apoptosis y el ciclo celular. El valor medio de índice apoptótico (AI) de los tumores de Livin positivos fue significativamente más baja que la IA de los tumores negativos de Livin. Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre la expresión de Livin y Ki-67 etiquetado índice (KI). Viviendo expresión fue significativamente mayor en el cáncer colorrectal y tejidos ganglionar metastásica en comparación con los tejidos normales de la mucosa colorrectal y los ganglios linfáticos no metastásico y se asoció con el estadio tumoral, invasión linfovascular, la metástasis de los ganglios linfáticos y la supervivencia de los pobres.
Conclusiones
Estos resultados indican que de livin está asociada con la progresión tumoral mediante el aumento de la motilidad de las células tumorales y la inhibición de la apoptosis en el cáncer colorrectal
Visto:. Myung DS, Parque YL, Chung CY, Parque HC, Kim JS, cho SB, et al. (2013) Expresión de Viviendo en el cáncer colorrectal y su relación con el comportamiento de la célula tumoral y pronóstico. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10.1371 /journal.pone.0073262
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Febrero, 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 2 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Myung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca (0720570) de la Nacional de Investigación & amp; Programa de Desarrollo para el Control del Cáncer, Ministerio de Salud & amp; El bienestar, la República de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es una de las principales causas de morbilidad asociada al cáncer y la mortalidad en el mundo. A pesar de la evidencia de que la supervivencia a los 5 años es del 90% cuando el cáncer colorrectal se diagnostica en una etapa temprana, & lt; 40% de los casos se diagnostican cuando el cáncer todavía está localizado [1]. Los rápidos avances en nuestra comprensión de las características moleculares y biológicas del cáncer colorrectal han proporcionado conocimientos útiles en la patogénesis del cáncer colorrectal. Los biomarcadores se han desarrollado para la identificación de las personas que más se beneficiarán de la vigilancia del cáncer y la gestión [2-5]. Identifiying biomarcadores que pueden detectar el cáncer colorrectal temprano o monitorear la progresión del cáncer permita la personalización de la medicina y mejorar las tasas de supervivencia de los pacientes con cáncer de
.
Los mecanismos de acción subyacentes en la progresión del cáncer se están empezando a desentrañar. Los mecanismos moleculares y bioquímicos reportados que pueden contribuir a los cambios fenotípicos en favor de la carcinogénesis, incluyen apoptosis, proliferación de células tumorales mejorada, aumento de la capacidad de invasión, perturbación de la adhesión celular, la promoción de la angiogénesis inhiben, e inhibieron la vigilancia inmune. Estos eventos pueden contribuir al desarrollo y progresión del cáncer [6-8].
La apoptosis desempeña un papel importante en muchos eventos biológicos, incluyendo la morfogénesis, la renovación celular y la eliminación de células dañinas. Una perturbación en la apoptosis puede conferir una ventaja de supervivencia en las células malignas que albergan las alteraciones genéticas y promover así la progresión del cáncer [9,10]. El acontecimiento central en la apoptosis es la activación proteolítica de una clase de proteasas de cisteína-aspartil específica, las caspasas. Iniciador caspasas caspasas efectoras escinden que a su vez degradan varios sustratos proteicos intracelulares y por lo tanto inducen las características morfológicos característicos de la apoptosis [11]. Estas actividades de caspasa son inhibidas por los inhibidores de las proteínas de la familia de la apoptosis (IAPs). Hasta ahora, ocho IAP humanos se han identificado, incluyendo c-IAP1, c-IAP2, NAIP, XIAP, ILP-2, BRUCE, survivina y de Livin [12]. De Livin fue identificada recientemente a ser un gen anti-apoptótica novela. Viviendo es reclutado para complejos de señalización de los receptores de la muerte, donde inhibe la activación de las caspasas responsables de la apoptosis y protege las células de diversos estímulos pro-apoptóticos. De Livin está asociado con la inducción de fenotipos oncogénicos, incluyendo la invasión, la motilidad, la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis en líneas celulares de cáncer humano [13-16]. Además, la expresión de Livin en la gran mayoría de los cánceres humanos se mejora y se correlacionó con el desarrollo y progresión del cáncer [17-22]. El silenciamiento del gen de Livin utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA) disminuye el volumen del tumor mediante la inducción de la apoptosis en un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon [23]. Por lo tanto, de Livin se considera una posible diana terapéutica para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Los objetivos de este estudio fueron evaluar si afecta de Livin comportamiento biológico oncogénica de las células de cáncer colorrectal humano, para evaluar de Livin expresión en tejidos de cáncer colorrectal humano, y para examinar la correlación de Viviendo con la apoptosis, la proliferación de las células tumorales y las características clínico-patológicas incluyendo la supervivencia.
Materiales y Métodos
declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por el Institutional Review Junta del hospital de la Universidad Nacional de Hwasun Chonnam (Jeonnam, Corea). Un escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada participante antes de la adquisición de tejidos. Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito de su información que se almacena en la base de datos del hospital y se utiliza para la investigación.
Pacientes y muestras de tejidos
Veinte cáncer colorrectal tejidos y tejidos de colon normales emparejados se recogieron mediante biopsia endoscópica para las preparaciones de ARN y proteínas en el hospital de la Universidad Nacional de Hwasun Chonnam. Se obtuvieron muestras fijadas en formalina e incluido en parafina de tejidos de 161 pacientes elegidos al azar que habían sido sometidos a cirugía para el cáncer colorrectal en el Hospital de la Universidad Nacional de Chonnam Hwasun entre enero de 2004 y diciembre de 2004 para inmunohistoquímica. Ningún paciente había recibido radioterapia o quimioterapia preoperatoria. informes patológicos y las historias clínicas en el momento de la cirugía fueron revisados en los registros médicos. bloques de tejido fueron seleccionados por la visualización de diapositivas patológicas originales y la elección de bloques que muestran la unión entre el epitelio de colon normal y la región del tumor. Los tumores se llevaron a cabo de acuerdo con el American Joint Committee on sistema de estadificación del cáncer [24]. La supervivencia se mide desde el momento de la cirugía hasta el seguimiento, el 31 de diciembre de 2010.
Cultivo de células y transfección siRNA
Las líneas celulares de cáncer colorrectal SW480 y DKO1 humanos se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.) y se cultivaron en DMEM (Hyclone, Préstamo, UT, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) en un incubador humidificado a 37 ℃ con un CO 5%
2 atmósfera. Viviendo y revueltos siRNA fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y Qiagen (Valencia, CA, EE.UU.), respectivamente. Viviendo ADNc se subclonó en el vector pcDNA3.1 (Invitogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). construcción de Livin fue verificada por secuenciación. El gen específico fueron transfectadas utilizando Lipofectamine
TM RNAiMAX y Lipofectamine
TM 2000 (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante y después se incubaron durante 48 h. Además, las células transfectadas con el vector pcDNA3.1 fueron tratados de manera selectiva con 5-fluorouracilo (5-FU) (10μg /ml, Choong-Wae, Chung-Nam, Corea) durante 48 h.
Invertir transcription- reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)
el ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) y transcrito de forma inversa con los reactivos de transcripción MMLV (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. amplificación por PCR de ADNc se realizó utilizando cebadores específicos de genes y Go Taq
® ADN polimerasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Se utilizaron los siguientes cebadores específicos; Viviendo 5'-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3 '/5' ACGGCACAAAGACGATGGAC-3 '; GAPDH 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '/5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '.
Western Blot
Los lisados celulares se prepararon utilizando M-PER
® reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Thermo, Rockford, IL, EE.UU.) con Halt
TM fosfatasa inhibidor y Halt
TM cóctel inhibidor de la proteasa (Thermo). Las proteínas totales se electrotransfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), y las proteínas específicas fueron borrados con el anticuerpo primario. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anticuerpos contra de Livin, el cromosoma X de unión a IAP (XIAP), survivina y β-tubulina se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra la quinasa extracelular regulada por señales (ERK), fosfo-ERK, p38, y fosfo-p38, c-Jun NH
2-terminal quinasa (JNK), fosfato JNK, fosfo-Akt, Akt, fosfo-p65 , se escindió de la caspasa (3, 7 y 9), poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), la quinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4), CDK6, ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, p21, p27, p57, p15, p16 y el segundo activador de las mitocondrias de caspasas derivado /IAP proteína de unión directa con baja pi (SMAC /DIABLO) fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.). Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron por el sustrato de HRP sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (Millipore) y el 4000 LAS-analizador de imágenes luminiscentes (Fujifilm, Tokio, Japón).
se calculó
invasión de la célula de ensayo
capacidad invasora por el número de células que pasa a través de cámaras de filtro Transwell (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU.) con 8 micras poros. filtros Transwell se recubrieron con 1% de gelatina durante la noche y se secaron a temperatura ambiente (RT). Las células se sembraron sobre las células viables de 2 x 10
5 en 0.2% de medio de BSA en la cámara superior. fibronectina plasmática humana (Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU.) se añadió como un medio de BSA quimioatrayente a 0,2% en la cámara inferior. Después de un 24 h de incubación, las células invadidas en la superficie inferior de la Transwell se tiñeron con solución de Diff-Quik (Sysmex, Kobe, Japón) y se contaron en cinco campos seleccionados bajo un microscopio de luz. Los datos se expresan como media ± desviación estándar del número de células /campo en tres experimentos individuales.
La migración de células de ensayo
El ensayo de migración celular se realizó utilizando Cultura: inserta (2 x 0,22 cm
2; ibidi, Regensburg, Alemania). Para crear un hueco de la herida, las células fueron sembradas en la cultura-insertos, que se retira suavemente después de una incubación de 24 h utilizando pinzas estériles. El progreso de cierre de la herida fue fotografiada con un microscopio invertido. La distancia entre huecos se normalizó a 1 cm después de la captura de tres sitios al azar.
La viabilidad celular
La viabilidad celular se determinó con el EZ-CyTox (sales de tetrazolio, WST-1) ensayo de viabilidad celular kit (Daeil Lab Inc., Seúl, Corea). Después de aplicar el reactivo WST-1 a 37 ℃, la viabilidad celular se midió utilizando un lector de microplacas (Infinito M200, Tecan, Austria GmbH, Viena, Austria) con el software de análisis de datos Magellan V6 (Tecan). Pocillos por triplicado se utilizaron para cada experimento y todos los experimentos se realizaron al menos por triplicado.
análisis de citometría de flujo
se tripsinizaron las células transfectadas, se recogieron en PBS, y se resuspendieron en 1 x tampón de unión (BD Biosciences , San Diego, CA, EE.UU.). Las suspensiones celulares se incubaron en APC Anexina V y 7-amino-actinomicina D (BD Biosciences) a TA. Para el análisis del ciclo celular, las células se incubaron en 10 mg /ml ribonucleasa A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y 50 g /ml de yoduro de propidio (PI) a TA en la oscuridad. La población de células de Anexina-V-positiva y la fase del ciclo celular se analizaron mediante un teléfono BD búsqueda
® versión 3.3 de instrumentos (Becton Dickinson, San José, CA, EE.UU.) y el software WinMDI versión 2.9 (The Scripps Research Institute, San Diego, CA, EE.UU.).
la inmunohistoquímica
se deparaffinized secciones de tejido en parafina de pacientes, se rehidratan y se recuperan con tampón de recuperación. Los tejidos se tratan con una solución de peroxidasa de bloqueo (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) para bloquear la actividad peroxidasa endógena y se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-humano de Livin en solución diluyente primario (Invitrogen) durante la noche a 4 ° C. Después de lavar en TBST, los tejidos se tiñeron utilizando Dako, real
TM Envision sistema de detección de HRP /DAB (Dako). tejidos teñidos fueron vistos y fotografiados bajo un microscopio óptico.
Evaluación de la expresión de Livin
Immunostained especímenes fueron evaluados independientemente por dos observadores sin conocimiento de los datos clínico-patológicos. Si hay una discrepancia, se llegó a un consenso después de una evaluación adicional. La intensidad de las células cancerosas positivas se clasificó en una escala de cuatro: 0, sin tinción de las células cancerosas; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, la tinción fuerte. El porcentaje de células de cáncer de color también se clasificó en una escala de cuatro: 0, ninguno; 1, & lt; 10%; 2, 10-50%; 3, & gt; 50%. La valoración de la intensidad se multiplica por la calificación ciento mancha para obtener una puntuación global. La puntuación global media de los 161 tumores analizados fue de 4,0. Por lo tanto, la puntuación media global de 4,0 fue elegido como el punto de corte para discriminar de Livin estado de expresión. Las muestras con una puntuación & gt;. 4 fueron considerados como positivos, y los que tienen una puntuación ≤ 4 fueron considerados como expresión negativa
Evaluación de la proliferación de células tumorales
La proliferación de las células tumorales se visualizaron por tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-Ki-67 (MIB-1; diluido 1: 150; Dakopatts, Glostrup, Dinamarca). distinta nuclear Ki-67 inmunoreactividad se considera positivo. El índice de etiquetado Ki-67 (KI) se presenta como el número de núcleos Ki-67-positivas /1000 núcleos de las células del tumor. KI se ha utilizado para estimar la capacidad proliferativa de las células tumorales.
Terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada por el trifosfato de desoxiuridina fin de etiquetado (dUTP) nick (TUNEL) ensayo de
células y cuerpos apoptóticos estaban detectado mediante el DeadEnd
TM colorimétrico TUNEL System (Promega, Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las secciones de tejido se dewaxed e hidratada través de una serie graduada de alcohol. entonces permeabilización se realizó en una solución de proteinasa K durante 15 min. Etiquetado se realizó mediante la adición de la enzima TdT mezcla de reacción a las secciones de tejido en los portaobjetos durante 60 min en una cámara humidificada 37 ℃. Las células marcadas fueron desarrolladas utilizando HRP estreptavidina y sustrato de la enzima 3,3-diaminobencidina. Un método cuantitativo para el cálculo de las células apoptóticas fue utilizado por dos patólogos independientes. Todas las secciones se examinaron bajo campos de alta potencia (magnificación de 40 x 10). Los campos fueron seleccionados en la zona más alta marcada para cada caso. El índice apoptótico (AI) se expresó como el número de núcleos positivos, incluyendo cuerpos apoptóticos entre 1000 núcleos de las células del tumor.
El análisis estadístico
Los datos de al menos tres experimentos independientes se utilizaron para comparar entre los grupos . Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Estudiante de
t-test
se utilizó para determinar la significación estadística para las comparaciones intergrupales. La χ
2-test y la prueba exacta de Fisher, en su caso, se utilizaron para comparar la expresión de Livin con diferentes parámetros clínico. Las relaciones entre la expresión de Livin y el KI o AI se evaluaron mediante de Student
t-test
. Las tasas de supervivencia actuarial de los pacientes con expresión de Livin positivo o negativo fueron evaluados de acuerdo con el método de Kaplan-Meier, y se pusieron a prueba las diferencias con una prueba de log-rank. El paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS /PC + 15.0, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis. Un valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
El impacto de Livin en la invasión, la migración y proliferación de células de cáncer colorrectal humano
Para investigar la función de Livin en el comportamiento biológico de oncogénico células de cáncer colorrectal, de livin siRNA o pcDNA3.1-de livin se utilizan para controlar la expresión de genes de livin endógena en líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW480 y DKO1. De Livin la expresión génica en todas las células ensayadas, mostraron una disminución específica en el ARNm y los niveles de proteína mediante transfección de ARNsi de Livin y un aumento específico por transfección de pcDNA3.1-viviendo. El número de células invasoras SW480 y DKO1 transfectadas con siRNA de Livin fueron 30,2 ± 3,1 y 55,3 ± 11,0, mientras que el 51,8 ± 9,5 y 115,3 ± 10,3 células fueron observadas para las células transfectadas con siRNA-revueltos. Las células se midieron en seis aleatorias 0,5 × 0,5 mm
2 campos microscópicos utilizando 10 mg /ml de fibronectina como un quimioatrayente. La diferencia entre los dos tipos de células fue significativa (p = 0,015 y p & lt; 0,001, respectivamente). En contraste, el número de células invasoras fue significativamente mayor en pcDNA3.1-de Livin transfectaron células SW480 y DKO1 comparación con las células vacío-pcDNA3.1 transfectadas (p = 0,024 y p = 0,012, respectivamente) (Figura 1A). La brecha de la herida artificial en placas de células siRNA transfectadas revueltos se convirtió en significativamente más estrecha que la de las células transfectadas con siRNA de Livin a las 48 h en SW480 y a las 24 h en células DKO1 (p = 0,012 y p = 0,016, respectivamente). La brecha de la herida artificial en pcDNA3.1-de Livin transfectaron células SW480 se hicieron significativamente más estrecha que la de las células vacío-pcDNA3.1 transfectadas a las 24 y 48 h (p = 0,034 y p = 0,008, respectivamente) (Figura 1B). El ensayo de proliferación celular se realizó a los 2, 3, 4, y 5 días después de la transfección de ARNsi de Livin o pcDNA3.1-de Livin para acceder al potencial de Livin en la proliferación celular. Las células en crecimiento, como se determina por absorbancia, disminuyeron significativamente en las células SW480 transfectadas con siRNA de Livin en comparación con las células siRNA transfectadas revueltos a los 3, 4 y 5 días (p = 0,005, & lt; 0,001, y 0,022, respectivamente), pero no No se observó diferencia significativa en las células DKO1. Además, en todas las células ensayadas, no había diferencia significativa de la proliferación celular entre pcDNA3.1-de Livin y células transfectadas vacío-pcDNA3.1 (Figura 1C).
(A) El impacto de Livin en invasión de células de cáncer colorrectal. Se realizó el ensayo de invasión usando el siRNA o células transfectadas pcDNA3.1. células invasoras teñidas se contaron y se representan como un gráfico entre los grupos. El número de células LS-transfectadas que invadió fue significativamente menor que la de las células transfectadas con SS. El número de células invasoras fue significativamente mayor en las células transfectadas con LV en comparación con células EV-transfectadas (media ± error estándar [SE], n = 6, * p & lt; 0,05). (B) El impacto de Livin en la migración de células de cáncer colorrectal. El ensayo de cicatrización de la herida utilizando siRNA o células transfectadas con pcDNA3.1-se llevó a cabo y los gráficos de la migración celular se muestran como las distancias relativas de curación. La migración celular fue significativamente alterado en las células SW480 y DKO1 LS-transfectadas y aumentó en células SW480 transfectadas-LV (media ± SE, n = 3; * p & lt; 0,05). (C) El impacto de la livin sobre la proliferación de células de cáncer colorrectal. La absorbancia indica la proliferación de células viables disminuyó en los SW480 células LS-transfectadas pero no había ninguna diferencia significativa de la proliferación celular entre LV y las células transfectadas EV (media ± SE, n = 3; * p & lt; 0,05). SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Vacío-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-livin.
El impacto de Livin en la apoptosis en células de cáncer colorrectal humano
Se realizó el análisis de citometría de flujo para evaluar el impacto de Livin en la apoptosis. La tasa de apoptosis celular inducida por transfección de ARNsi de Livin aumentado de manera significativa, en comparación con la inducida por transfección de siRNA revueltos (6,9
vs.
19,6%) en las células SW480 de Livin pero desmontables tenido una influencia mínima sobre la apoptosis (11.3
vs.
16,7%) en DKO1 células (Figura 2A). 5-FU es bien conocido para inducir la apoptosis y afectar el ciclo celular de las células cancerosas. La sobreexpresión de Viviendo por transfección de pcDNA3.1-de Livin inhibió la apoptosis de las células SW480 en respuesta a 5-FU, pero la sobreexpresión de livin tenido una influencia mínima sobre la apoptosis en las células DKO1 (Figura 2A). Además, investigó las actividades de caspasa específico para determinar la activación de las caspasas durante la caída y la sobreexpresión de livin. caspasas-3 escindidas y expresiones -7 y PARP fueron hasta reguladas en las células SW480 y DKO1 después de Livin desmontables y hacia abajo-regulada después de la sobreexpresión de livin (Figura 2B). Como se muestra en la Figura 2C, el nivel de proteína survivina se redujo debido a la caída de Livin en las células SW480 y DKO1, pero los niveles de proteína XIAP y SMAC /Diablo no se altera en respuesta a la caída de Livin. Además, el Survivin, XIAP y SMAC /Diablo niveles de proteína no se alteró después de la sobreexpresión de livin
.
(A) La proporción de células apoptóticas inducidas por transfección de LS fue mayor que la inducida por transfección de SS (6,9 frente a 19,6%) en las células SW480, pero de livin caída tuvo una influencia mínima sobre la apoptosis (11,3 vs. 16,7%) en las células DKO1. La sobreexpresión de Viviendo por transfección de LV inhibió la apoptosis de las células SW480 en respuesta a 5-FU, pero la sobreexpresión de livin tenido una influencia mínima sobre la apoptosis en las células DKO1 (B) Expresión de la caspasa-3 troceados, -7, -9, y PARP proteínas. La caspasa-3, -7 y PARP expresión se incrementó en las células SW480 y después DKO1 ¡Livin desmontables, y disminuyó después de la sobreexpresión de livin (C) La expresión de proteínas reguladoras de la apoptosis. nivel de proteína survivina disminuyó tras caída de Livin en las células SW480 y DKO1, pero los niveles de proteína XIAP y SMAC /DIABLO no se vio alterada en respuesta a la caída de Livin. Además, los niveles de proteína survivina, XIAP y SMAC /DIABLO, no se alteró después de la sobreexpresión de livin. PARP; Poli (ADP-ribosa) polimerasa, XIAP; IAP, SMAC /DIABLO unión del cromosoma X; segundo activador de las mitocondrias de caspasas derivado /directa de proteínas con bajo pI, SS unión a IAP; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Vacío-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-livin, 5-FU; 5-fluorouracilo, 7-AAD; 7-amino-actinomicina D.
El impacto de Livin en la detención del ciclo celular en células de cáncer colorrectal humano
Se realizó el análisis de citometría de flujo para detectar si Viviendo podría cambiar la distribución del ciclo celular. De Livin caída resultó en la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 de las células SW480 y la fase S de las células DKO1 (Figura 3A). tratamiento inducida por 5-FU detención del ciclo celular en la fase de subG1 SW480 y la fase G0 /G1 de las células DKO1. La sobreexpresión de livin inhibido la detención del ciclo celular inducida por 5-FU en las células SW480 y tenía una influencia mínima en las células DKO1 (Figura 3A). A continuación, se evaluaron los efectos de Livin en varios inhibidores de CDK (CDKIs) implicados en la detención del ciclo celular en células de cáncer colorrectal humano. Como se muestra en la Figura 3B, el nivel de proteína p27 aumentó significativamente por caída de Livin, y la disminución por la sobreexpresión de las células SW480 de Livin en y DKO1. Sin embargo, los niveles de p21, p57, p15 y la proteína p16 no se alteraron en respuesta al derribo y la sobreexpresión de livin. Ciclinas y CDK están regulados negativamente por CDKIs. Por lo tanto, hemos examinado el efecto de Livin en los niveles expresados de ciclina D1, ciclina D3, ciclina B1, CDK4, y CDK6. Como se muestra en la Figura 3C, la ciclina D1, ciclina D3, CDK4 y CDK6 los niveles de proteína se redujo significativamente por caída de Livin, y el aumento de la ciclina D1 y CDK4 por la sobreexpresión de las células SW480 de Livin en y DKO1.
( a) de livin knockdown dado lugar a la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 de las células SW480 y la fase S de las células DKO1. tratamiento inducida por 5-FU detención del ciclo celular en la fase de subG1 SW480 y la fase G0 /G1 de las células DKO1. La sobreexpresión de livin inhibido la detención del ciclo celular inducida por 5-FU en las células SW480 y tenía una influencia mínima en las células DKO1. Se muestra un experimento representativo de los tres experimentos independientes. (B) La expresión de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) inhibidor de proteínas. El nivel de proteína p27 se incrementó significativamente por caída de Livin o disminuir por la sobreexpresión de Viviendo en las células SW480 y DKO1. Sin embargo, los niveles de p21, p57, p15 y la proteína p16 no se alteraron en respuesta al derribo o sobreexpresión de livin. (C) Expresión de las ciclinas y las proteínas quinasa dependientes de ciclina (CDKs). Ciclina D1, ciclina D3, CDK4 y CDK6 los niveles de proteína se redujo significativamente por la caída de Livin y el aumento de la ciclina D1 y CDK4 por la sobreexpresión de Viviendo en las células SW480 y DKO1. SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Vacío-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-livin.
El impacto de Livin en vías de señalización intracelulares implicadas en la apoptosis y la detención del ciclo celular en células de cáncer colorrectal humano
Se estudió el efecto de la estimulación de Livin On vías de señalización intracelular que conducen a la apoptosis y la detención del ciclo celular en las células SW480 y DKO1 para explorar los posibles mecanismos implicados en la apoptosis y la detención del ciclo celular. Los niveles de fosforilación de ERK1 /2, JNK y p38 se redujeron reguladas en knockdowned de Livin SW480 y células DKO1 (Figura 4). Pero Akt y fosforilación de p65 niveles se mantuvieron sin cambios por caída de Livin. Además, ERK1 /2, JNK, p38, los niveles de fosforilación de Akt y p65 se mantuvo sin cambios por la sobreexpresión de livin.
Los niveles de fosforilación de ERK1 /2, JNK y p38 disminuyó siguientes caída de Livin de las células SW480 y DKO1. Pero Akt y p65 los niveles de fosforilación no mostraron cambios tras caída de Livin. Además, ERK1 /2, JNK, p38, los niveles de Akt y fosforilación de p65 no fueron cambiadas por la sobreexpresión de livin. SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Vacío-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-livin.
Viviendo expresión en el cáncer colorrectal humano y los tejidos linfáticos metastásicos
nodo
Para confirmar los resultados de los estudios de línea celular de cáncer colorrectal, se evaluó la expresión de Livin en el ARN y los niveles de proteína por RT-PCR, transferencia de Western e inmunohistoquímica en tejidos de cáncer colorrectal humano, emparejados mucosa colorrectal normal y metastásicos y no metastásicos tejidos de ganglios linfáticos de pacientes mismos tomadas de biopsia colonoscópica y especímenes quirúrgicos. En las muestras de biopsia de colonoscopia, que confirmó la sobre regulación de la expresión de Livin en tejidos de cáncer en comparación a la de la mucosa normal emparejado en los niveles de ARN y proteínas (p = 0,035 yp = 0,020, respectivamente) (Figura 5 A, B). En las secciones de tejido en parafina, la proteína de Livin hizo no, o sólo débilmente a inmunotinción en condiciones normales de la mucosa colorrectal (Figura 6A). La inmunotinción de la proteína de Livin se identificó predominantemente en los núcleos de las células cancerosas, pero no era detectable en el estroma tumoral (Figura 6A). La inmunotinción de tejidos de Livin en los ganglios linfáticos metastásicos fue significativamente más fuerte que en los tejidos de los ganglios linfáticos no metastásico (Figura 6B). La puntuación global para la inmunotinción de Livin en los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos fue significativamente más alta que en los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos (
P
& lt; 0,001) (Figura 6C)
(A) de Livin la expresión de ARNm. (B) de livin expresión de la proteína. La expresión de livin es aumentada en tejidos de cáncer en comparación con la mucosa normal emparejado en los niveles de ARNm y proteínas en las muestras de biopsia colonoscópicos frescas. Cada barra representa la media ± SE de 20 casos. * P & lt; 0,05 en comparación con mucosa colorrectal normal. T; tejido de cáncer colorrectal, N; emparejado mucosa colorrectal normal.
(A) La proteína de Livin se inmunotiñó predominantemente en los núcleos de las células cancerosas, pero no o sólo débilmente immunostained en la mucosa colorrectal normal (× 100). (B) La inmunotinción de tejidos de Livin en los ganglios linfáticos metastáticos fue significativamente más fuerte que en los tejidos de ganglios linfáticos no metastásicos (× 100). (C) La puntuación global para la inmunotinción de Livin en los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos fue significativamente más alta que en los tejidos de ganglios linfáticos no metastásicos (* P & lt; 0,001). T; tejido de cáncer colorrectal, N; emparejado mucosa colorrectal normal NL; no metastásico de tejido de los ganglios linfáticos, ML; tejido del ganglio linfático metastásico.
Las correlaciones entre la expresión de Livin y la proliferación de células tumorales y la apoptosis en el cáncer colorrectal humano
Ki-67 inmunoreactividad se encuentra predominantemente en los núcleos de las células cancerosas (Figura 7A ). El KI para 161 tumores varió desde 21,9 hasta 85,6, con una media de 52,8 ± KI 15.1. No se observó ninguna diferencia significativa entre la expresión de Livin y KI (p = 0,504) (Tabla 1). criterios morfológicos estándar para células apoptóticas usando el ensayo de TUNEL son la presencia de cuentas o cromatina encogido y cuerpos apoptóticos con un halo claro (Figura 7B). La IA de los 161 tumores fue desde 0,6 hasta 30,0 con un AI media de 8,8 ± 5,6. El valor medio de la IA de Livin-positivos tumores fue de 6,4 ± 3,7, que fue significativamente más baja que la IA de los tumores (p = 0,009) (Tabla 1).
(A) La inmunotinción de Ki-67-negativo de Livin . La inmunotinción de Ki-67 muestra una fuerte positividad nuclear en las células cancerosas, pero es raramente positivo en la mucosa colorrectal normal (× 200). (B) Detección de células apoptóticas (flecha) por tinción de TUNEL. Las células apoptóticas con características clásicas de la condensación del ADN se demuestra que tienen un halo que consiste en pyknotic núcleo y el citoplasma encogido (cabeza de flecha) en tejidos de cáncer colorrectal, pero la tinción de TUNEL no es positivo en la mucosa colorrectal normal (× 400). TUNEL, la terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada por el trifosfato de desoxiuridina fin de etiquetado (dUTP) nick. T; tejido de cáncer colorrectal, N; emparejado mucosa colorrectal normal.
Índices
Total (n = 161)
de Livin expresión
valor p
Negativa (n = 86)
positivo (n = 75) guía empresas KI (media ± DE) de 52,8 ± ± 15.151.1 14.754.3 ± 15.60.504AI (media ± DE) 8,8 ± ± 5.611.3 6.46.4 ± 1 3.70.009Table . Las correlaciones entre la expresión de livin y la proliferación de células tumorales y la apoptosis en el cáncer colorrectal
KI, Ki-67 etiquetado índice.; AI, el índice de apoptosis;