Extracto
vías de señalización de estrés oxidativo modulada han sido implicados en la carcinogénesis y la resistencia a la terapia. El factor de crecimiento derivado de p75 epitelio del cristalino (LEDGF /p75) es un co-activador de transcripción que promueve la resistencia a la muerte celular inducida por el estrés. Esta proteína se ha implicado en enfermedades inflamatorias y autoinmunes, VIH-SIDA y cáncer. Aunque LEDGF /p75 está emergiendo como una oncoproteína supervivencia estrés, existe escasa información sobre su expresión en tumores humanos. El presente estudio se realizó para evaluar su expresión en un panel integral de los cánceres humanos. la expresión del transcrito fue examinado en la base de datos de microarrays de genes del cáncer Oncomine y en una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa Encuesta panel cáncer TissueScan array (Q-PCR). La expresión de proteínas se evaluó por inmunohistoquímica (IHC) en microarrays de tejido de cáncer (TMA) que contiene 1735 tejidos que representan núcleos individuales o replicar desde 1220 casos individuales (985 tumor y 235 tejidos normales). Se analizaron un total de 21 tipos principales de cáncer. Análisis de la expresión del transcrito LEDGF /p75 en los conjuntos de datos Oncomine reveló la regulación positiva significativa (tumor versus normal) en 15 de los 17 tipos de tumores. La matriz TissueScan cáncer Q-PCR reveló significativamente elevada expresión del transcrito de LEDGF /p75 en el cáncer de próstata, colon, tiroides, y de mama. IHC análisis de TMA reveló aumento de los niveles de proteína significativos LEDGF /p75 en tumores de próstata, colon, tiroides, hígado y útero, con respecto a los tejidos normales correspondientes. transcripción elevada o expresión de la proteína de LEDGF /p75 se observó en varios tipos de tumores. Estos resultados establecen más LEDGF /p75 como una proteína relacionada con el cáncer, y proporcionan un fundamento para los estudios en curso destinados a comprender la importancia clínica de su expresión en los cánceres humanos específicos
Visto:. Un Basu, Rojas H, Banerjee H, Cabrera IB, KY Pérez, De León M, et al. (2012) La expresión de la oncoproteína estrés Respuesta LEDGF /p75 en el cáncer humano: un estudio de 21 tipos de tumores. PLoS ONE 7 (1): e30132. doi: 10.1371 /journal.pone.0030132
Editor: John R. Battista, Universidad del Estado de Louisiana y A & amp; M College, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Junio, 2011; Aceptado: 9 de diciembre de 2011; Publicado: 19 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Basu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una subvención de los Institutos nacionales de Salud (NIH) Centro Nacional de Salud para Minorías y disparidades de Salud [NIH-NCMHD 5P20MD001632 (MDL, CAC)]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
un creciente cuerpo de evidencia apoya la hipótesis central de que un estado aumentado de estrés oxidativo celular (ASCOS) es un factor importante que contribuye a la carcinogénesis [1], [2]. Los posibles factores desencadenantes de ASCOS incluyen estilo de vida y factores relacionados con el medio ambiente tales como la dieta, las infecciones, el consumo de cigarrillos, alcohol y contaminantes [3]. ASCOS causa daño al ADN, proteínas y lípidos, así como la activación de factores de transcripción de estrés, lo que lleva a la activación de la tensión, antioxidante, inflamatoria, y las vías de pro-supervivencia que contribuyen a la transformación maligna, la desregulación del ciclo celular, resistencia a la muerte celular y la terapia, la invasión, la angiogénesis y la metástasis [1], [2].
LEDGF /p75 es una proteína de respuesta al estrés que promueve la supervivencia de las células en presencia de factores de estrés ambientales que inducen ASCOS, como la quimioterapia, la radiación , el calor y la privación de suero [4] - [7]. LEDGF /p75 también se conoce como la transcripción co-activador de p75 [8], PC4 y proteínas que interactúan SFRS1 (PSIP1) [9], y denso autoantígeno moteado fino de 70 kD (DFS70) [10]. Se ha implicado en la inflamación, la autoinmunidad, el VIH-1 de replicación, y el cáncer [10] - [17]. Las propiedades de supervivencia estrés de LEDGF /p75 parecen estar vinculados a su capacidad para unirse a factores de transcripción específicos y facilitar la transactivación de estrés, inflamatoria, antioxidante, y los genes asociados con el cáncer [18] - [23]. LEDGF /p75 (530 aminoácidos) y su variante de empalme alternativa menos caracterizados, LEDGF /p52 (333 aminoácidos), se derivan a partir del gen LEDGF /PSIP1 [8], [9], [24]. LEDGF /p52 corresponde a los aminoácidos N-terminales 1-325 de LEDGF /p75, y contiene un 8 amino-ácido cola intrón derivado adicional [25]. Nuestro grupo informó anteriormente que LEDGF /p75 está regulada positivamente en las células cancerosas en comparación con las células normales, y que LEDGF /p52 se expresa en niveles relativamente bajos en las células cancerosas, induce la apoptosis cuando se expresa ectópica, y antagoniza las funciones de pro-supervivencia de LEDGF /p75 [7], [16], [25].
Varias líneas de evidencia apoyan la reciente aparición de LEDGF /p75 como una oncoproteína en el cáncer humano. Por ejemplo, LEDGF /p75 es un objetivo de translocaciones cromosómicas en leucemias, dando lugar a proteínas de fusión Nup98 LEDGF /con una mayor actividad [23], [26] - [29]. se encontró que su expresión de ARNm que se upregulated en blastos de pacientes con leucemia mielogénica aguda resistentes a la quimioterapia, y su sobreexpresión ectópica protegida células de leucemia contra la muerte celular inducida por fármacos [30]. LEDGF /p75 ata el linaje leucemia (MLL) de transcripción complejo de factor menin-mezclado a la cromatina para activar la leucemia [23]. Nuestro grupo informó anteriormente que LEDGF /p75 es un autoantígeno en el cáncer de próstata (CaP), con la expresión de proteínas elevado en los tejidos tumorales de próstata [16]. También se observó que su sobreexpresión ectópica promueve la supervivencia celular contra la muerte inducida por el estrés en las células tumorales de hígado HepG2 [7], y atenúa la muerte celular inducida por docetaxel lisosomal en células de CaP [31]. Daugaard et al. [17] informó de la expresión del transcrito LEDGF /p75 elevada en los cánceres de mama y de vejiga humanos, y que su sobreexpresión ectópica en células de cáncer de mama protegidas contra la muerte celular inducida por fármacos lisosomal y el aumento del potencial tumorigénico de las células cancerosas en modelos murinos. Recientemente, se demostró que las gonadotropinas elevadas para mejorar LEDGF /p75 dependiente de la activación de la expresión de VEGF-C, aumentando la linfangiogénesis y la angiogénesis de tumores de ovario [32].
Aunque se informó de la expresión del transcrito de LEDGF /p75 que se upregulated en la leucemia, mama y cánceres de vejiga [17], [30], el análisis inmunohistoquímico (IHC) la expresión de la proteína en los tejidos tumorales humanos se ha realizado sólo por CaP [16]. El papel emergente de LEDGF /p75 como la supervivencia de estrés oncoproteína nos ha llevado a cabo un análisis completo de su ARNm y la expresión de proteínas en 21 de las principales tipos de tumores humanos, utilizando las bases de datos de genes de cáncer de microarrays, matriz TissueScan cáncer Q-PCR y análisis de IHC de tejido microarrays (TMA). Este estudio proporciona evidencia de que LEDGF /p75 está regulada positivamente de forma selectiva en los cánceres humanos.
Materiales y Métodos
Análisis de Bioinformática del cáncer Oncomine microarrays de genes de base de datos
Para la comparación de la expresión de ARNm LEDGF entre el tumor y los tejidos normales, se seleccionaron los conjuntos de datos de la base de datos (Oncomine Compendia Biosciences, Ann Arbor, MI, EE.UU.; www.oncomine.org). Estos conjuntos de datos, que contienen los microarrays de genes de cáncer y tejidos normales adyacentes y /o normales libres de enfermedades correspondientes, proporcionaron datos factor de cambio de la expresión génica (tumorales vs normal), con valores p calculados mediante pruebas t. Cabe mencionar que los conjuntos de datos examinados no eran específicos para LEDGF /p75 pero proporcionan los datos de expresión de genes para el gen /PSIP1 LEDGF, lo que da lugar tanto a las variantes de empalme p75 y p52. Un total de 81 conjuntos de datos se examinaron para la expresión del transcrito LEDGF /PSIP1 para los siguientes tipos de cáncer: la vejiga (2 conjuntos de datos), mama (9 conjuntos de datos), el cuello uterino (2 conjuntos de datos), el colon y el recto (3 conjuntos de datos), el esófago (3 conjuntos de datos), riñón (6 conjuntos de datos), de cabeza y cuello (8 conjuntos de datos), el hígado (2 conjuntos de datos), pulmón (9 conjuntos de datos), linfoma (3 conjuntos de datos), ovario (6 conjuntos de datos), páncreas (6 conjuntos de datos), próstata (13 conjuntos de datos), glándula salival (1 conjunto de datos), piel (5 conjuntos de datos), estómago (2 conjuntos de datos) y el útero (1 conjunto de datos). No hay datos de microarrays estaba disponible para la expresión del transcrito LEDGF /PSIP1 en el cáncer de la vesícula biliar, el intestino delgado, y la tiroides.
"Panel de Estudio del Cáncer TissueScan 'Human Q-PCR matriz
Se utilizó el matriz Q-PCR humana 'TissueScan cáncer Encuesta de panel 96-I' (CSRT-101, OriGene Technologies Inc., Rockville, MD, EE.UU.) para el análisis de la casa de la expresión de ARNm de LEDGF /p75 en 96 tejidos que cubren 8 principales cánceres humanos ( de mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, próstata y tiroides). Esta matriz consistía en ADN complementario de primera hebra (ADNc) a partir de 9 casos individuales de cada tipo de cáncer y 3 casos de correspondiente tejidos adyacentes normales. El fabricante proporciona información limitada paciente clínico-patológica (edad, sexo, estadio tumoral, el estadio pTNM), sin identificación del paciente.
Q-PCR se realizó en placas de 96 pocillos de PCR array (OriGene) utilizando el termociclador MyiQ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) con cebadores específicos para la variante de LEDGF /p75 de empalme (adelante 5'-TGCTTTTCCAGACATGGTTGT-3 'y 5'-reverse CCCACAAACAGTGAAAAGACAG-3'), y iQ SYBR Green Supermix (Bio- Rad). Brevemente, se añadieron 30 l de mezcla de PCR, que incluía 15 l de 2 × mezcla maestra, 13 l de agua bidestilada, y 1 l de cada uno de los cebadores directo e inverso (10 pmol /l), a cada uno de los 96 pocillos de las placas de matriz de la PCR. amplificación por PCR se llevó a cabo a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. la expresión de ARNm se normalizó el uso de la expresión del gen de mantenimiento de beta-actina humana, cuya cebadores (adelante 5'-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3 'y revertir 5'-AGGTCCAGACGCAGGAT GGCATG-3') fueron proporcionados en el kit matriz TissueScan cáncer Q-PCR en una concentración de 10 pmol /l. Para el análisis de datos, se utilizó el método ΔΔCt. Plegables cambios se calcularon como la diferencia en la expresión génica entre los tumores y los correspondientes controles adyacentes normales.
ARN Desmontables interferencia mediada de /p75
células PC-3 de cáncer de próstata LEDGF se adquirieron de American Type Culture Collection y se cultivaron según lo recomendado por el proveedor en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 a 37 ° C. caída transitoria de LEDGF /p75 en las células PC-3 se llevó a cabo utilizando el método de Amaxa Nucleofection (Amaxa, Lonza) como se describe anteriormente [21]. LEDGF siRNA /p75 (siLEDGF /p75) y la revueltos dúplex de siRNA (SISD, control negativo) fueron sintetizados por las tecnologías integradas de ADN (IDT). La secuencia /p75 siLEDGF correspondía a los nucleótidos 1340-1360 (5'-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ') con respecto al primer nucleótido del codón de inicio de la /p75 marco de lectura abierto LEDGF [21]. Esta secuencia corresponde a una región en el C-terminal de LEDGF /p75 no compartida por LEDGF /p52. La secuencia para SISD era 5'-GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 '[21]
Los anticuerpos y Immunoblotting
Se utilizaron los siguientes anticuerpos:. Anticuerpos monoclonales de ratón anti-β-actina (Sigma-Aldrich), y anti-LEDGF (1:1000, BD Biosciences); policlonales de conejo anti-LEDGF /p75 (1:1000, Novus Biologicals); anti-LEDGF /p75 (1:1000, Bethyl); y peroxidasa de rábano picante (HRP) marcado con anticuerpos IgG secundarios (Zymed). También se utilizó un anticuerpo LEDGF /p75-específico policlonal de conejo que se desarrolló en el W. M. Keck Centro de Enfermedades Autoinmunes del Instituto de Investigación Scripps (La Jolla, CA, EE.UU.). Este anticuerpo de conejo, designado originalmente anti-DFS /LEDGFp75#5087 de anticuerpos (en adelante, Scripps-Ab5087), se elevó contra un recombinante, la proteína truncada DFS70 generado a partir de un clon de ADNc parcial, pDFS6.1, que codifica el C-terminal región de LEDGF /p75 [10]. Para identificar un anticuerpo que es específico sólo para la variante de empalme LEDGF /p75, se analizó la reactividad de los anticuerpos LEDGF comerciales y no comerciales mencionadas por inmunotransferencia utilizando lisados celulares de PC-3 células con SISD y siLEDGF /p75.
inmunotransferencia se llevó a cabo esencialmente como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las proteínas totales de células PC3 con SISD y siLEDGF /p75 fueron separadas por SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, Invitrogen), seguido de transferencia a difluoruro de polivinilo (PVDF) membranas (Millipore). Las membranas se bloquearon con una solución de 5% de leche seca en tampón TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 140 mM, 0,1% de Tween 20) durante 1 h y se sondaron con anticuerpos primarios. Después de varios lavados con TBS-T, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios durante 30 minutos y después se lavaron de nuevo con TBS-T. Las bandas de proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia (Amersham).
Análisis inmunohistoquímico de micromatrices de tejido de cáncer
micromatrices de tejido de cáncer Humanos (TMA), disponible comercialmente de Investigación de Enfermedades Intercambio Nacional (ISRND, Filadelfia, PA , EE.UU.), imgenex Corp. (San Diego, CA, EE.UU.) y US Biomax Inc. (Rockville, MD, EE.UU.), se utilizaron para el análisis IHC de LEDGF /p75. Varios TMA diferentes se utilizan para aumentar el número de tipos de tejidos tumorales y tamaño de la muestra (Tabla 1). En resumen, hemos adquirido de ISRND integral pan-cáncer TMA que contiene núcleos duplicadas de 642 casos únicos (522 tejidos tumorales de 20 tipos de tumores grandes y 120 especímenes adyacentes normales y /o normales libres de la enfermedad) en un conjunto de 5 diapositivas (TS-1, TS -2, TS-3, TS-4 y TMA5). Cada uno de cáncer de pan-TMA-IMH 326, 327 y IMH-IMH-328 (imgenex Corp), contenía 59 muestras de diferentes tipos de tumores, mientras que las TMA-IMH 336, 337 y IMH-IMH-338 (imgenex Corp.) contenía el 59 correspondientes tejidos adyacentes normales emparejados.
también utilizamos TMA IMH-303 (imgenex Corp.), que contiene 40 tejidos con CaP y 9 tejidos adyacentes normales emparejados. Ocho TMA adicional de US Biomax se utilizaron, cada uno con múltiples muestras de tejido de un solo tipo de tumor (de mama, colon, riñón, pulmón, hígado, páncreas, próstata, tiroides), así como correspondiente libre de enfermedad control normal y /o normal adyacente tejidos. Los fabricantes de estos TMA proporcionan información limitada básica clinicopatológica (edad, sexo, estadio tumoral en algunos casos) corresponde a los núcleos de tejido, sin identificación del paciente. No había información disponible en la raza o el origen étnico del paciente, el tratamiento neoadyuvante, técnica quirúrgica, año de la cirugía, las instituciones que recogen los tejidos, el número de instituciones, el seguimiento de rutinas, y las técnicas de manipulación de los tejidos. El paciente limitada seguimiento de datos asociados con el TMA impidió cualquier análisis de supervivencia de Kaplan-Meier.
TMA se tiñeron utilizando un i6000 biogénica de auto-Stainer (BioGenex Corporation, Fremont, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [16] , [33]. En pocas palabras, embebidos en parafina secciones de tejido en los TMA diapositivas se deparaffinized y los portaobjetos se sumergieron en Citra-Plus solución de recuperación de antígeno (BioGenex Corp.). La recuperación del antígeno se llevó a cabo en el microondas los portaobjetos durante 2 minutos a una potencia del 100%, seguido por 10 min a potencia 20%. Los portaobjetos se enfriaron a continuación, en la solución de recuperación de antígeno durante 20 minutos. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno al 3% en 10% de metanol, y Power Block © reactivo de bloqueo universal (Biogenex Corp.) se usó para bloquear la unión de proteína no específica.
TMA diapositivas se incubaron durante la noche con Scripps-Ab5087 anticuerpo anti-LEDGF /p75 [16], seguido de 3 lavados en PBS. Los portaobjetos se incubaron después con Multi-link © anticuerpo secundario biotinilado (Biogenex Corp.) durante 20 minutos, seguido de incubación con estreptavidina-peroxidasa acoplada supersensible Label © (Biogenex Corp.) durante 20 min. La inmunotinción se detectó mediante la activación de la peroxidasa de 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) cromógeno (Biocare médica, Concord, CA, EE.UU.). TMA se counterstained ligeramente con hematoxilina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y se monta con Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Para el control negativo se omitió el anticuerpo primario y sustituido con suero de conejo pre-inmune. Las secciones de tejido fueron examinados bajo un microscopio Olympus BX50, y las imágenes fueron adquiridas con una cámara digital del punto RT3 ™ (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI, EE.UU.). Inmunote~nido TMA se anotó ciegamente para LEDGF inmunorreactividad /p75 por un patólogo certificado por la junta. Se utilizó un sistema de puntuación de 4 niveles (0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderada, 3 = fuerte) para evaluar la intensidad de la tinción. Se consideró que los tejidos con puntuaciones de 0-1 a tener baja intensidad de tinción, mientras que no se consideran tejidos con puntuaciones de 2-3 para tener una alta intensidad de tinción. Las muestras de tejido que mostraron baja calidad fueron excluidos de los análisis. Estos estudios se realizaron en proceso de aprobación por la Junta de Revisión Institucional.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba t del estudiante para evaluar la importancia del cambio en la expresión del ARNm entre el tumor y normal de control adyacente muestras de la matriz TissueScan cáncer de Q-PCR. El análisis estadístico de los datos IHC y su relación con los resultados clínicos de los pacientes se realizó utilizando el paquete de software SAS (versión 9.2; SAS Institute). Para facilitar el análisis estadístico, las muestras de tejido se agruparon en dos categorías basadas en sus puntuaciones. tinción "Bajo" se determinó como agrupados puntuaciones de intensidad de tinción de 0 y 1, mientras que la tinción de "alto" se había acumulado puntuaciones de 2 y 3. La diferencia en los niveles de expresión de la proteína LEDGF /p75 entre los tumores y tejidos normales fueron analizados utilizando la prueba exacta de Fisher.
para el control de los falsos positivos, que pueden surgir en múltiples hipótesis-prueba-estudios, se calculó también la tasa de falso descubrimiento (FDR) p-valores ajustados. FDR es una cuantificación de error de uso común en las comparaciones múltiples. Controla la proporción esperada de hipótesis nulas incorrectamente rechazados. En otras palabras, FDR controla la fracción de detecciones positivas que son falsas. Las asociaciones entre los niveles de expresión de LEDGF /p75 y parámetros clínico se determinaron mediante la prueba exacta de Fisher (por edad y sexo) y el análisis de correlación tau de Kendall (para el estadio del tumor). Los valores de probabilidad
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Reproducibilidad de los núcleos replicadas se evaluó mediante la prueba de Cochran-Mantel-Haenszel que puso a prueba de homogeneidad entre las repeticiones.
Resultados
transcripción LEDGF /p75 está regulada positivamente en varios tipos de cáncer humano
análisis in silico de expresión LEDGF /mRNA PSIP1 en tejidos de cáncer se llevó a cabo utilizando conjuntos de datos de microarrays gen del cáncer de la base de datos que, en comparación Oncomine tejidos de cáncer a tejidos normales (ya sea libre de enfermedad normal y /o normal adyacente). Como se resume en la Tabla 2, se observó una diferencia estadísticamente significativa (
P Hotel & lt; 0,05) la regulación positiva de la transcripción LEDGF /PSIP1 en algunos de los microarrays de datos disponibles de los cánceres de mama, cuello de útero, colon, esófago, riñón, cabeza y cuello, hígado, pulmón, linfoma, ovario, páncreas, próstata, glándula salivar, piel y estómago. El pliegue-aumento fue mayor que 2 en los cánceres de mama, de cuello uterino, cabeza y cuello, riñón, piel y estómago (Tabla 2). El aumento fue modesto (entre 1 y 2) en colorrectal, de esófago, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, y cáncer de las glándulas salivales. No hay cambios en la expresión /transcripción PSIP1 LEDGF se detectaron en la vejiga (5 conjuntos de datos) y de útero (1 conjunto de datos) tipos de cáncer. Ninguno de los 17 tipos de cáncer mencionadas anteriormente mostró downregulation significativa de LEDGF transcripción /PSIP1 en cualquier conjunto de datos. No hay datos disponibles comparando tumoral vs expresión normal de transcripción LEDGF /PSIP1 en la vesícula biliar, el intestino delgado, y los cánceres de tiroides.
La expresión del transcrito de LEDGF /p75 fue evaluado experimentalmente en ocho tipos de tumores sólidos (mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, próstata y tiroides) utilizando la matriz TissueScan cáncer de Q-PCR, que contenía las muestras de tejido de cáncer de 12 casos individuales donantes (n = 9 para cada tipo de cáncer, n = 3 para que corresponde tejidos normales). Se utilizaron cebadores específicos para LEDGF /p75 en estos experimentos. Como se muestra en la Figura 1, una diferencia estadísticamente significativa (
P
& lt; 0,05) se observó la regulación positiva de LEDGF transcripción /p75 en la próstata (2,38 veces,
P
= 0,002), la tiroides (1,85 veces ,
P = 0,031
), mama (2,26 veces,
P = 0,037
) y colon (2,04 veces,
P = 0,047)
cánceres. Aunque el nivel de transcripción LEDGF /p75 fue elevada (& gt; 1,02 veces) en otros tipos de cáncer (con la excepción del cáncer de hígado) las veces los cambios no fueron estadísticamente significativos. Los tumores de hígado mostraron una ligera regulación a la baja (-1.24 veces) en la expresión del transcrito LEDGF /p75, pero la disminución fue estadísticamente insignificante.
Los datos fueron analizados utilizando el método ΔΔCt con valores normalizados de ß-actina niveles. El eje y representa el pliegue de la inducción del nivel de ARNm LEDGF /p75 en ocho tipos de cáncer (n = 9) en comparación con los tejidos adyacentes normales emparejan (n = 3) de la matriz. Las barras de error muestra el rango de error estándar. *
P Hotel & lt; 0,05.
valores P se determinaron con la prueba t de Student.
Selección de LEDGF /p75-anticuerpo específico para IHC
Con el fin de identificar un anticuerpo que es específico para LEDGF /p75 y que podrían ser utilizados por IHC para evaluar los niveles de expresión de esta proteína en el cáncer de TMA, se evaluó por inmunotransferencia de la especificidad de los anticuerpos anti-LEDGF actualmente disponibles. Tres anticuerpos comercialmente disponibles anti-LEDGF (Bethyl, BD y Novus) y un anticuerpo no comercial (Scripps-Ab5087) contra LEDGF se probaron mediante inmunotransferencia en células PC-3 con y sin caída transitoria de la proteína (Figura 2). PC-3 células transfectadas con SISD sirvieron como control. Immunoblotting análisis indicó que todos los 3 anticuerpos comerciales a LEDGF reaccionaron con ambos p75 y p52 variantes. Sin embargo, el anticuerpo Scripps-Ab5087 detectó sólo LEDGF /p75 y por lo tanto se seleccionó para estudios de IHC.
Las células fueron transfectadas con siLEDGF /p75 para inducir la caída transitoria de LEDGF /p75. PC-3 células transfectadas con ARN interferente pequeño revueltos dúplex (SISD) sirvió como control correspondiente. análisis de inmunotransferencia probó la reactividad específica de todos los anticuerpos contra LEDGF /PSIP1. Todos los pares blot (SISD y siLEDGF /p75) para cada anticuerpo se derivan de la misma transferencia.
Proteína LEDGF /p75 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer humano
Se realizó IHC análisis de la expresión /proteína p75 LEDGF en los tejidos tumorales usando un panel amplio de TMA que contiene un total de 2330 núcleos de tejido, incluyendo 1754 tumores núcleos de tejido de más de 35 tipos principales de cáncer humano y la correspondiente 576 no tumoral (normal y inflamatoria no canceroso núcleos de tejido) (Tabla 1). Hemos excluido de nuestro análisis estadístico esos tipos de tumores que tenían & lt; 5 núcleos de tejido tumoral o /y no tenía tejidos no tumorales correspondientes. Los núcleos de tejido inflamatorio no tumorales también fueron excluidos porque no todos los tipos de tumores tenían los tejidos inflamatorios correspondientes. Algunos núcleos de tejido no se pudo calificar debido a la mala calidad del tejido. Al final, 21 tipos de tumores se incluyeron en el análisis estadístico (Tabla 3). Estos comprendían un total de 1735 tejidos que representa solo o replicar núcleos de 1220 casos de donantes individuales, con 985 casos y 235 casos de tumores no tumorales.
Los resultados del análisis de IHC de las puntuaciones combinadas para LEDGF /expresión de la proteína p75 (es decir, alta = rESULTADOS 2-3 vs bajos puntajes = 0-1) en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales se muestran en la Tabla 3. No hubo sobreexpresión significativa de la proteína /p75 LEDGF en la próstata, colon, tiroides, hígado, y uterinas tumores (
P
& lt; 0,05) (Tabla 3 y Figura 3). los niveles de expresión elevados en los tumores de mama se acercaron a la significación estadística (
P = 0,087
). Cuando se corrige para la aparición de falsos positivos, sólo el de próstata, se encontró que la tiroides y tumores en el hígado para exponer la sobreexpresión significativa de proteínas LEDGF /p75 (FDR ajustado
P Restaurant & lt; 0,05).
microarrays de tejidos fueron teñidas con anticuerpos contra LEDGF /p75, y los núcleos individuales se obtuvieron a ciegas utilizando la siguiente escala: 0 = sin tinción, 1 = bajo, 2 = tinción de tinción moderada, 3 = fuerte tinción. tejidos anotados se agruparon en dos grupos: baja de tinción (puntuaciones 0 y 1, barras oscuras) y alta (puntuaciones de tinción 2 y 3, barras claras). El porcentaje de muestras en las dos categorías de tinción se trazó para los tejidos tumorales en comparación a la normalidad (incluyendo adyacentes normales y normales sin enfermedad) tejidos. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01.
valores P se determinaron con la prueba exacta de Fisher.
El porcentaje de los tejidos tumorales con altos puntajes (2-3) expresión LEDGF /proteína p75 fue del 70,5% en la tiroides, el 68% en el hígado, 38,3% en la próstata, 30,2% en uterino, y 25% en los cánceres de colon, en comparación con 12.5%, 31.3%, 0%, 0% y 6,3%, respectivamente, en sus tejidos normales correspondientes (Tabla 3) . Había cuatro tipos de cáncer (de mama, cuello de útero, ovario y glándula salival) en el que la frecuencia de los tumores que muestran la expresión de proteínas /p75 LEDGF alta era de 20% o mayor, y los tejidos normales correspondientes mostraron poca o ninguna expresión de la proteína. Sin embargo, cuando comparamos las diferencias en la expresión de LEDGF /p75 (alta vs baja expresión) entre el tumor y los tejidos normales, la
Los valores P
no alcanzó significación. Curiosamente, cuando se compararon las diferencias entre los tejidos tumorales y normales con respecto a la expresión de LEDGF /p75 (puntuaciones 1-3) vs ninguna expresión (puntuación 0), los valores de
P Opiniones de mama y cáncer de cuello uterino de significación alcanzado (
P
& lt; 0,05; datos no mostrados). La comparación de los núcleos de replicados no mostró diferencias significativas (
P
= 0,6226) entre las repeticiones, lo que sugiere una alta reproducibilidad entre los núcleos replicados.
Figura 4A muestra núcleos de tejido tumoral representativos inmunoteñidas con Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /anticuerpo p75. Las imágenes representativas de IHC corresponden a la próstata, colon y núcleos de tejido de tumor de tiroides con bajos puntajes (0-1) y alta intensidad (las puntuaciones 2-3) tinción. Como se mencionó anteriormente, estos tres tipos de tumores muestran upregulation significativa tanto de transcripción (TissueScan cáncer de matriz Q-PCR) y la proteína (IHC). La figura 4B muestra imágenes representativas de IHC de tejidos de próstata y de colon normal libre de enfermedad (de donantes no cancerosas), así como las muestras de próstata y tumores de colon con sus tejidos adyacentes emparejados. El cáncer de tiroides TMA no se correspondía con los tejidos adyacentes para tumores tiroideos específicos. Hemos observado que los tejidos "normales" adyacentes a los tejidos de la próstata y de tumor de colon tenían moderada tinción LEDGF /p75, en comparación con la intensidad de la tinción relativamente baja de los tejidos normales libres de la enfermedad. Otra observación interesante fue que LEDGFp75 inmunotinción se distribuye tanto en el núcleo y el citoplasma en la mayoría de los tejidos tumorales examinadas.
A. Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica (baja intensidad, las puntuaciones 0-1; de alta intensidad, las puntuaciones 2-3) para LEDGF /p75 en los tumores de próstata, colon y tiroides (escala de barra 40 micras; Aumento = 200 ×). B. imágenes representativas de LEDGF /p75 inmunotinción de tejidos de próstata y de colon normal no la enfermedad, y en los tejidos tumorales y sus tejidos adyacentes emparejados (escala de barra 40 micras; ampliación = 400 ×). TMA se tiñeron utilizando el anticuerpo de conejo específico LEDGF /p75 Scripps-Ab5087, como se indica en Materiales y Métodos. ajustes de la cámara idénticos fueron utilizados en la adquisición y procesamiento de imágenes para un determinado tipo de tejido.
Las características clinicopatológicas disponibles de pacientes con tipos tumorales que presentan sobreexpresión significativa LEDGF /p75 se resumen en la Tabla 4. El número de muestras de tejido de cáncer de colon y de próstata se diferencia de los conjuntos en discusiones sobre edad y sexo debido a los datos que faltan en el TMA disponibles en el mercado. Los datos sobre la edad faltaba para 4 núcleos en el cáncer de próstata TMA mientras que los datos sobre el sexo faltaba para 2 núcleos en el cáncer de colon TMA. La correlación entre estas características y la expresión de proteínas LEDGF /p75 reveló que la sobreexpresión de esta proteína en los tumores del hígado y de la tiroides se asoció significativamente con la edad más joven (
P Hotel & lt; 0,05) (Tabla 4). Las edades medias de los pacientes representados en el TMA eran 62 años para el cáncer de colon, de 53 años para el cáncer de hígado, 66 años para el cáncer de próstata, 48 años para el cáncer de tiroides y 70 años para el cáncer uterino. Ninguno de los cinco tipos de tumores mostró correlación significativa entre el aumento de expresión LEDGF /p75, el sexo o el aumento de la etapa del tumor TNM. Los pacientes limitada datos de seguimiento relacionados con el TMA impedido correlacionar la expresión LEDGF /p75 con los resultados de supervivencia de los pacientes.
El análisis multi-plataforma de expresión LEDGF /p75 en varios tipos de tumores humanos se ha resumido en Tabla 5. La transcripción de proteínas y expresiones para cada tipo de tumor se comparan a través de las diferentes plataformas utilizadas:. in silico, Q-PCR y IHC
Discusión
se realizó el presente estudio como parte de nuestros esfuerzos en curso para entender el significado biológico y clínico de expresión LEDGF /p75 en el cáncer humano. Nuestros resultados indican upregulation significativa tanto de LEDGF /transcripción p75 y la proteína en la próstata, de colon, y tumores de tiroides, inferida por el análisis de la expresión del transcrito en la base de datos de microarrays gen del cáncer de Oncomine (cuando los datos disponibles) y la matriz TissueScan cáncer de Q-PCR, y el análisis de la expresión de proteínas por IHC en TMA. La regulación al alza observada de LEDGF /p75 en los tumores de próstata es consistente con nuestros informes anteriores de que esta proteína es la diana de autoanticuerpos en algunos pacientes con CaP, está aumentada en ambas líneas celulares y tejidos con CaP, y promueve la quimio-resistencia en líneas celulares de CaP cuando se sobreexpresa ectópica [16], [31].
significativa regulación de la transcripción LEDGF /PSIP1 también se observó en algunos conjuntos de datos Oncomine para los cánceres de mama, cuello de útero, esófago, riñón, cabeza y cuello, hígado, pulmón, linfoma, ovario, páncreas, glándula salivar, piel y estómago. Sin embargo, sólo 4 de los 8 tipos de tumores (próstata, de colon, de mama y de tiroides) exhibieron significativa regulación de la transcripción LEDGF /p75 en la matriz TissueScan cáncer Q-PCR. Aunque otros tipos de tumores (riñón, pulmón, y ovario) exhibieron & gt; 1,02 veces LEDGF /p75 elevación transcripción en esta matriz, la regulación por incremento no fue estadísticamente significativa. Estas diferencias entre la base de datos Oncomine y la matriz de cáncer TissueScan Q-PCR podrían atribuirse al pequeño tamaño de la muestra en el segundo, variaciones metodológico /plataforma, el análisis de LEDGF /PSIP1 vs LEDGF /p75, y el uso de conjuntos de datos de tumor no relacionados. [17].