Extracto
Los microARN (miRNA) son reguladores de ARN no codificantes cortos que controlan la expresión génica principalmente a través de silenciamiento post-transcripcional. Hemos identificado previamente
miR-205
en una firma para el cáncer de cuello uterino humano utilizando un enfoque de secuenciación profunda. En este estudio, hemos confirmado que
miR-205
expresión era mayor frecuencia en el cáncer de cuello de útero humano que sus muestras de tejidos normales emparejados. Funcionalmente, se demuestra que
miR-205
promueve la proliferación y migración celular en células de cáncer cervical humano. Para comprender mejor las funciones biológicas de los
miR-205
, se realizó un
in vivo
reticulación y Argonaute 2 inmunoprecipitación de complejos de ribonucleoproteínas miARN seguido por el análisis de microarrays (CLIP-Chip) para identificar su potencial ARNm objetivos. La aplicación de CLIP-Chip de ganancia y la pérdida de los experimentos de la función, hemos identificado una serie de transcripciones como posibles objetivos de
miR-205
. Varios objetivos están involucrados funcionalmente en la proliferación celular y la migración. Dos de ellos, CYR61 y CTGF, se validaron adicionalmente por análisis de transferencia de Western y la cuantificación de enriquecimiento de mRNA en los inmunoprecipitados utilizando Ago2 QRT-PCR. Por otra parte, tanto
CYR61
y
CTGF
se regulaban por disminución en tejidos de cáncer de cuello uterino. En resumen, nuestros resultados revelan nuevos roles funcionales y objetivos de
miR-205
en el cáncer de cuello de útero humano, que pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre su papel en la carcinogénesis cervical y su valor potencial para el diagnóstico clínico.
Visto: Xie H, Zhao y, Caramuta S, C Larsson, Lui WO (2012)
miR-205
Expresión promueve la proliferación celular y la migración de las células del cáncer de cuello del útero humano. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10.1371 /journal.pone.0046990
Editor: Tim Cheung Siu, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 13 Abril, 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 3 Octubre 2012
Copyright: © Xie et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación (523-2009-3517, 521-2010-3518); Fundación de la Åke Olsson hematológica Investigación; la Fundación de Cáncer de Suecia; Fundación de la Åke Wiberg; Fondo Jubileo V Gustavo Rey; Sociedad del Cáncer en Estocolmo; la Fundación Axel y Donación de Signe Lagerman; Instituto Karolinska de Estocolmo y el Consejo del Condado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical, el tercer tipo de cáncer más común entre las mujeres en todo el mundo [1], está fuertemente asociado con la infección y la posterior transformación de células del cuello uterino por el virus del papiloma humano específico (VPH) subtipos [2]. El hecho de que el cáncer cervical se desarrolla a partir de formas pre-malignas bien reconocidos, ofrece una oportunidad importante para el diagnóstico precoz y la prevención. Hoy en día, tales cribado primario incluye análisis citológicos e identificación del VPH. Sin embargo, estos exámenes no pueden distinguir de forma fiable las lesiones con potencial invasivo de las lesiones que le regresión espontánea. Por lo tanto, el desarrollo de los marcadores más robustas para progresión de la enfermedad sería valiosos complementos a los actuales métodos de cribado
.
Los microARN (miRNA) son los ARN no codificantes cortos ($ ~ $ 22-nucleótidos) que generalmente controlan la expresión génica en el puesto nivel -transcriptional a través de la degradación del ARNm y /o la represión de traducción [3]. Estas pequeñas moléculas se han demostrado jugar un papel importante en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el desarrollo y progresión del cáncer. Nosotros, y otros, hemos identificado previamente alterados firmas de expresión de los genes miARN en el cáncer cervical humano [4] - [10]. Varios de estos miRNAs consistentemente han informado que están alteradas en el cáncer de cuello de útero (
por ejemplo
.
miR-143
,
miR-145
,
miR-21
y
miR-205
). Algunos también se han caracterizado funcionalmente en células de cáncer cervical humano. Entre ellos,
miR-143
,
miR-145
y
miR-34a
se ha demostrado que inhiben la proliferación celular, y
miR-146a
y
miR-21
para aumentar el crecimiento celular [8], [10], [11].
miR-23b
se ha descubierto recientemente para reprimir la expresión del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) e inducir la migración celular en células de cáncer cervical humano [12]. En conjunto, estas observaciones sugieren que los miRNAs desregulados tienen un papel funcional en el desarrollo del cáncer de cuello uterino y pueden llegar a ser aplicado como herramientas de diagnóstico.
En este estudio, hemos examinado el papel funcional de los
miR-205
en cáncer de cuello uterino humano. Este miARN fue uno de los miRNAs más significativos utilizados para la predicción de la clase de cáncer de cuello uterino y se sobreexpresa significativamente en las muestras de cáncer de cuello uterino en comparación con sus homólogos normales emparejados [9]. El aumento de expresión de
miR-205
también se ha observado en el adenocarcinoma de endometrio [13], de cabeza y cuello escamosas líneas celulares de carcinoma de células [14], el carcinoma de pulmón de células escamosas [15] y el cáncer de ovario [16]. Por el contrario, la expresión de
miR-205
ha sido reportado en el melanoma [17] y el cáncer de esófago [18], el riñón [19], la vejiga [20], la reducción [21], de mama [22] y de próstata [23].
sobre la base de los estudios anteriores,
miR-205
puede funcionar como un gen supresor de tumores oncogén o en función de los contextos celulares. En consonancia con su doble papel, varios estudios han demostrado su promoción de tumor y las funciones supresoras en diferentes líneas celulares de cáncer. Para ejemplos,
miR-205
se ha demostrado que suprimir la migración celular /invasión a través de la transición epitelio-mesenquimal en ambas células de la próstata y el cáncer de mama humano [23], [24], así como a TARGET
HER3
tirosina quinasa del receptor en células de cáncer de mama [22]. En apoyo de una función oncogénica,
fue encontrado el miR-205
para apuntar
SHIP2 Opiniones de señalización Akt en células de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [14] supervivencia. Dada la complejidad de su funcionamiento, sería de interés para investigar el papel funcional de
miR-205
en el desarrollo del cáncer de cuello uterino.
A continuación se describen las consecuencias funcionales de
miR 205
regulación en células de cáncer cervical humano. En experimentos de ganancia y pérdida de función, se demuestra que
miR-205
regula la proliferación y migración celular en células de cáncer cervical humano. Se identificaron además un conjunto de putativo
miR-205
objetivos utilizando un enfoque bioquímico. Varios de estos objetivos candidatos están asociados funcionalmente con la proliferación celular y la migración. Dos de las posibilidades
miR-205
mRNA objetivos fueron validados en experimentos de cultivo celular. Nuestros resultados proporcionan una ventaja importante para nuevas perspectivas sobre el papel funcional de
miR-205
en el desarrollo del cáncer de cuello de útero humano.
Resultados
miR-205
Expresión en muestras de cáncer de cuello uterino humano
previamente identificado un conjunto de miRNAs que podrían distinguir muestras de cáncer de cuello uterino de sus homólogos normales usando un enfoque basado en la secuenciación de los genes miARN perfiles [9]. En ese clasificador,
miR-205
tenía la puntuación más alta, lo que sugiere una función importante en el desarrollo del cáncer de cuello uterino. Para confirmar el nivel de expresión alterado de
miR-205
en cáncer de cuello uterino, que mide
miR-205
de expresión por cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa (QRT-PCR) en 27 pares emparejados de cáncer de cuello de útero y el tejido normal. De acuerdo con los resultados basados en la secuenciación,
miR-205
se encontró significativamente sobreexpresa en el cáncer de cuello uterino humano en comparación con sus homólogos normales
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1A). En 19 casos (~ 70%) la expresión de
miR-205
se incrementó fuertemente en las muestras tumorales en comparación con sus homólogos normales; mientras que en los 8 restantes, el cáncer y las muestras normales exhiben bajos pero similares niveles de expresión de
miR-205 gratis (Figura 1B).
(A)
miR-205
expresión fue significativamente mayor en los tumores que las muestras normales (
P
& lt; 0,001; apareado t-test). (B) relativamente más alta expresión de
miR-205
fue encontrado en una mayoría de las muestras tumorales en comparación con sus homólogos normales. (C) de alta expresión de
miR-205 se detectó en
ME-180, células C4I y CaSki, y el nivel de expresión baja o indetectable fue encontrado en HeLa, SW756, SiHa y células C33A. Los datos presentados representan la media de tres experimentos independientes con triplicados. Las barras de error representan desviaciones estándar de la media.
Consecuencias funcionales de
miR-205
Reglamento en células de cáncer cervical humano
Las consecuencias funcionales de la alteración de
miR-205
expresión se investigaron en líneas celulares de cáncer de cuello uterino con niveles altos o bajos de endógenas
miR-205
. Para este propósito
miR-205
se cuantificó en líneas celulares de cáncer cervical humano por QRT-PCR. Entre las líneas celulares analizadas 7,
miR-205
se encontró altamente expresado en EM-180, C4I y CaSki, mientras que la baja expresión /niveles apenas detectables se encontraron en HeLa, SW756, SiHa y C33A (Figura 1C) . A continuación las células transfectadas CaSki con un inhibidor de las células miARN (anti-miR-205), y HeLa y SW756 con una mímica miARN (Pre-miR-205), y se determinó el efecto de
miR-205
silenciamiento o la sobreexpresión en la proliferación celular, la apoptosis y la migración. Como controles negativos, se utilizó un precursor de miARN o inhibidor sin homología de secuencia con las transcripciones humanos.
Hemos observado que la inhibición de
miR-205
expresión en células CaSki condujo a una disminución significativa en la celda crecimiento (~ 15%;
P Hotel & lt; 0,001), mientras que la sobreexpresión de
miR-205
en células HeLa y SW756 resultó en un aumento significativo de la proliferación celular (~ 20% y ~ 11% , respectivamente;
P
& lt; 0,05), en comparación con los respectivos controles negativos (Figura 2A). Tomados en conjunto, tanto en ganancia y la pérdida de los experimentos de la función de los efectos sobre la proliferación celular apoyaron constantemente.
Los efectos sobre la migración celular se demostraron mediante el Transwell y la cicatrización de heridas ensayos de migración. Usando el ensayo Transwell, se demostró que la migración celular fue significativamente mayor de
miR-205
sobreexpresión en ambas líneas celulares HeLa y SW756 (~ 20% y ~ 30%, respectivamente;
P & lt
; 0,05). Sin embargo,
miR-205 en células
supresión CaSki no dio lugar a una disminución significativa de la migración celular (Figura 2B). El ensayo de migración de cicatrización de heridas reveló que
miR-205
sobreexpresión en células HeLa mejorado la capacidad de cerrar la herida en comparación con las células control tratadas y transfectadas simuladas negativas Pre-Mir. Del mismo modo, el cierre de heridas se retardó al silenciamiento de
miR-205
expresión en células CaSki (Figura 2C).
El tratamiento con
miR-205
imitan en HeLa o inhibidor en células CaSki no dieron lugar a ningún cambio significativo de la apoptosis (Figura S1). En experimentos de control de transfección eficaz se demostró mediante alterado significativamente
miR-205
nivel, y se observó una inducción significativa de la apoptosis después del tratamiento camptotecina (Figura S1).
Identificación de
miR-205 los genes diana
Para comprender mejor la función biológica de
miR-205
, hemos identificado
miR-205
objetivos utilizando
in vivo
reticulación y el ARN inmunoprecipitación, junto con microarrays (CLIP-chip). mRNAs obligado a la maquinaria miARN se purificaron por Argonaute 2 inmunoprecipitación (IP Ago2). Los objetivos de mRNA recuperados de muestras tratadas y de control fueron diferencialmente etiquetados con tintes fluorescentes, y luego se hibridan con microarrays de ADN para identificar los ARNm asociados al complejo de ribonucleoproteína microARN (miRNP). Aquí, hemos realizado experimentos CLIP-Chip para ambos
miR-205
sobreexpresión en células HeLa y la inhibición de las células CaSki.
Para verificar la eficiencia de Ago2 IP, que cuantifica los niveles de expresión de
miR-21
y
miR-30a-5p
mediante QRT-PCR. Estos miRNAs se utilizaron como controles internos para evaluar el enriquecimiento de miRNAs después de CLIP debido a sus informes anteriores altos niveles de expresión tanto en células HeLa y CaSki [5], [8]. Se observó un enriquecimiento significativo de ambos
miR-21 gratis (& gt; 100 veces,
P Hotel & lt; 0,01) y
miR-30a-5p gratis (& gt; 10 -fold,
P
. & lt; 0,01) en el anti-Ago2 IP en comparación con IgG anti-IP o controles de entrada (Figura S2)
en nuestro análisis CLIP-chip, se excluyeron uno de los microarrays de replicación de los
miR-205 experimentos de sobreexpresión
debido a las señales de hibridación pobres. Después de la filtración de las señales de fondo, se realizó la agrupación jerárquica sin supervisión de los cinco microarrays basados en sus patrones de expresión de ARNm. Nos centramos en los seis grupos (incluyendo transcripciones 270/252 genes anotados) en el que los patrones de expresión muestran enriquecimiento en
miR-205
sobreexpresión y el agotamiento en
miR-205
experimentos de supresión (Figura S3 y en la Tabla S1). Se realizó la anotación funcional de los objetivos CLIP-chip usando el programa GENECODIS. Varios grupos funcionales fueron significativamente enriquecido (
P
& lt; 0,05), incluyendo el ciclo celular, la reproducción viral, la reparación del ADN, la apoptosis, la proliferación y la migración celular (Tabla 1). Una lista detallada de las anotaciones funcionales se da en la Tabla S2. Entre los objetivos de candidatos 75 que figuran en la Tabla 1, 71 también fueron predichas como
miR-205
objetivos en al menos un programa de predicción (Tabla S3), y cuatro blancos (
BOD1
,
SEPT2
,
AAGAB
y
DCAF13
) no fueron predichas por cualquiera de los programas utilizados en este estudio.
Entre los genes candidatos objetivo, encontramos
CYR61
y
CTGF
se asocia tanto con la proliferación y migración celular (Tabla 1), y es consistente con nuestros consecuencias funcionales observados en este estudio. Para comprender mejor la relación entre la expresión
miR-205
y
CYR61
o
CTGF
, se determinó la expresión de
CYR61
y
CTGF Hoteles en 28 pares de cáncer de cuello uterino y de los tejidos normales usando QRT-PCR emparejado. Nuestros resultados revelaron significativamente menor expresión de ambos
CYR61
y
CTGF Hoteles en muestras de cáncer cervical humano en comparación con sus homólogos normales (
P = 0,002
y
P
& lt; 0,001, respectivamente; Figura 3A-C). Curiosamente, los patrones de expresión de estos dos genes seleccionados se correlacionaron inversamente con el
miR-205
expresión (
CYR61
,
Corr
= -0,241,
P
= 0,091;
CTGF
,
Corr
= -0,304,
P = 0,032
; Figura 3D). Los patrones de expresión observados inversas, junto con el predicho
miR-205
sitios de unión (Tabla S3, S4 Figura), proporcionan una prueba más de
CYR61
y
CTGF
como
miR-205
objetivos.
proliferación (a) celular se evaluó en líneas celulares de cáncer cervical humano transfectadas con un
miR-205
mímica (Pre-miR-205), inhibidor (anti-miR-205) o el control negativo correspondiente (Control anti-MIR MIR Neg o de control anticipativo, Neg) usando WST-1 ensayo. crecimiento celular relativa se normalizó a sus respectivas células de control tratadas. (B) Gráficos que muestran la migración celular relativa en tanto
miR-205
inhibición y experimentos de sobreexpresión según lo evaluado por el ensayo de migración Transwell. (C) Imágenes representativas de la migración celular evaluada por el ensayo de curación de la herida. heridas de Scratch se realizaron en cultivos monocapa confluentes después de 48 h de la transfección. Imágenes de la reparación de heridas fueron tomadas a los 0, 18 y 24 h después de la herida (panel izquierdo). El porcentaje de cierre de la herida se normalizó por área de la herida a 0 h (panel derecho). Los datos presentados representan la media de tres experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar de la media. Todas las comparaciones se evaluaron mediante la prueba t. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001;
ns = no significativo
.
relativamente menor expresión de
CYR61 gratis (A) y
CTGF gratis (B) se encontró en la mayoría de las muestras tumorales en comparación con sus homólogos normales (n = 28). (C) La expresión de
CYR61
y
CTGF
fue significativamente menor en los tumores que las muestras normales (
P = 0,002
y
P & lt
; 0,001, respectivamente; emparejado t-test). (D) Correlación inversa entre el nivel de expresión de
miR-205
y
CYR61 gratis (superior) o
CTGF gratis (inferior). La relación de expresión fue evaluada por análisis de correlación de Pearson.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Validación de
CYR61
y
CTGF
como
miR-205
genes diana
Para determinar si
CYR61
y
CTGF
podría ser blanco de
miR-205
en células de cáncer cervical humano, se aplicó dos diferentes enfoques. En primer lugar, se evaluaron los niveles de expresión de proteínas de CYR61 y CTGF tanto en
miR-205 y
-overexpressing células de cáncer cervical -agotadas utilizando análisis de transferencia Western. Como se muestra en la Figura 4 (A y B),
miR-205
sobre-expresión en células HeLa resultó en una disminución significativa en la expresión de proteínas CYR61 (~ 30%,
P
= 0,045) . La inhibición de la endógena de
miR-205
expresión en células CaSki aumentó significativamente el nivel de proteína CYR61 (~ 15%,
P = 0,016
). Para CTGF, se observó una ligera disminución o aumento (pero no estadísticamente significativa) la expresión de proteínas en células de
miR-205-overexpressing
o -agotadas, respectivamente. Una explicación plausible es que CTGF puede ser regulada por múltiples miRNAs o factores, y la modulación de
miR-205
expresión por sí sola no era suficiente para producir cambios significativos en el nivel de expresión de la proteína CTGF
.
(A) Western blot representativo que muestra los niveles de expresión de proteínas de CYR61 y CTGF en células transfectadas con un
miR-205
mímica,
miR-205
inhibidor, o los correspondientes controles de transfección scramble y simulacros. (B) la expresión de proteínas CYR61 fue reprimida de forma significativa en
miR-205-overexpressing
(tratados con pre-miR-205) y células significativamente mayor en
miR-205
-depleting (tratados con anti -miR-205) de las células en comparación con sus respectivos controles negativos. expresión de la proteína CTGF fue ligeramente reprimido en células HeLa tratadas con Pre-miR-205, y aumentó ligeramente en las células CaSki tratados con anti-miR-205, pero el efecto no fue estadísticamente significativa. Los datos presentados representan la media de al menos cuatro experimentos independientes. QRT-PCR análisis de
CYR61
(C) y
CTGF gratis (D) de ARNm en los ARN-Ago2 inmunoprecipitado de
miR-205-overexpressing
o -agotadas células como en comparación con el control maqueta de la transfección. nivel de expresión relativa de ARNm individuales se normalizó a
miR-21
expresión (como control endógeno para Ago2 RNA IP). cambio veces se calcula dividiendo los valores de expresión normalizada de muestras immunoprecipiated-Ago2 por los valores de la expresión normalizada de sus respectivas muestras de entrada. Los datos presentados representan la media de al menos tres experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar de la media. Todas las comparaciones fueron evaluados utilizando
t-test
. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001;
ns = no significativo
.
En el segundo enfoque, cuantificamos
CYR61
y
ARNm CTGF
ARNm en Ago2 inmunoprecipitadas en tanto
miR-205
overexpressing y agotadas las células utilizando QRT-PCR, y en comparación con sus niveles de controles transfectadas de manera simulada. Este experimento se basa en la suposición de que miRNAs y sus objetivos de mRNA están asociados físicamente con el complejo de proteína que contiene Ago2. Por lo tanto, esperábamos enriquecimiento de mRNAs objetivo en
miR-205
sobre-expresión de las células, o el agotamiento de los objetivos en las células con
miR-205
inhibición. De hecho, se observó enriquecimiento significativos de
CYR61 gratis (
P = 0,050
) y
CTGF gratis (
P = 0,007)
ARNm en células HeLa con sobreexpresión de
miR-205
, y agotamientos de ambas transcripciones en células CaSki con
miR-205
inhibición (
P Hotel & lt; 0,001 para ambos objetivos; Figura 4C y 4D) . Estos resultados sugieren que tanto la
CYR61
y
CTGF ¿Cuáles son los objetivos de
miR-205
en células de cáncer cervical humano.
Discusión
Observaciones de aumento o disminución de la expresión de
miR-205
en diferentes tipos de tumores sugieren que
miR-205
pueden tener diferentes funciones en el desarrollo del cáncer, dependiendo del tipo de célula en cuestión. En consonancia con esta idea, estudios previos han demostrado su función de supresión tumoral en las células de cáncer de mama y de próstata [22] - [24], y su función de promoción de tumores de cabeza y células de carcinoma de células escamosas del cuello [14]. En este trabajo, se investigó aún más sus consecuencias funcionales y objetivos en células de cáncer cervical humano.
miR-205
regula la proliferación y migración celular en células de cáncer cervical humano
Aquí , en primer lugar confirmó por QRT-PCR que
miR-205
se sobreexpresa significativamente en las muestras de cáncer de cuello uterino en comparación con sus homólogos normales. El resultado está de acuerdo con nuestros resultados [9] basados secuenciación anterior, y con los datos de microarrays reportados por Wang et al. [8]. Dado el aumento de la expresión observada de
miR-205 Hoteles en tejidos de cáncer cervical, que investigarse más a las consecuencias funcionales de
miR-205
regulación en células de cáncer cervical humano. En ambos
miR-205
células (HeLa y SW756) overexpressing, se observaron efectos significativos sobre la proliferación celular y la migración. Tras
miR-205
inhibición en las células CaSki, la proliferación se redujo significativamente, sin embargo, el efecto sobre la migración celular fue sólo revela en la herida ensayo de curación pero no en el ensayo de migración Transwell. Una posible razón de esta discrepancia es que la migración celular depende de diferentes factores en los ensayos respectivos. La migración de las células que se produce durante la curación de heridas depende de la interacción célula-matriz. Sin embargo, en el ensayo Transwell, las células se preparan primero en única suspensión de células, que interrumpir las interacciones célula-célula y célula-matriz. Además, la migración de células en el ensayo Transwell puede depender del gradiente quimiotáctico, que no está disponible en el ensayo de curación de la herida.
también se han reportado efectos sobre la proliferación celular y la migración similares a los observados aquí en cáncer de cuello uterino humano en otros tipos de células. Por ejemplo,
miR-205
sobreexpresión llevó a un aumento de la proliferación de células mamarias de ratón en células progenitoras epiteliales [25] y la migración de células de queratinocitos humanos [26]. Por el contrario, el aumento de expresión de
se encontró miR-205
para suprimir la proliferación celular en células de melanoma [17] y el cáncer de mama [27], así como la migración de células en una variedad de líneas celulares de cáncer, incluyendo SK- LU-1 pequeñas de cáncer de pulmón de células [28], el glioblastoma U87 [28] y el cáncer renal A498 [19]. Tomados en conjunto, estos resultados apoyan aún más la doble función de
miR-205
como un supresor de tumores o un oncogén.
CYR61
y
CTGF como
nuevos objetivos de
miR-205
Debido a su complejidad funcional, se aplicó un enfoque bioquímico (CLIP-chip) para identificar el
miR-205-
objetivo interacciones
in vivo
. Con este enfoque, hemos identificado un conjunto de
miR-205
objetivos de ambos experimentos ganancia y la pérdida de función. Entre ellos, varios son funcionalmente relacionadas con la proliferación celular y la migración; lo cual es coherente con las consecuencias funcionales observados en este estudio. Dos de los genes diana,
CYR61
y
CTGF
, fueron validados en proteínas y /o los niveles de ARN. Sin embargo, su sitio de interacción precisa (s) debe ser determinada además por ensayos de reportero de luciferasa. En este estudio, no se realizó la inhibición CYR61 y CTGF en células de cáncer de cuello uterino, es posible que otro objetivo (s) directa contribuye a la
miR-205
mediada efectos sobre la proliferación celular y la migración. Sin embargo, estos genes tenían expresión significativamente menor en las muestras de cáncer de cuello uterino que sus contrapartes normales, lo que sugiere que pueden desempeñar un papel importante en la carcinogénesis cervical.
Proteínas
Cyr61 y CTGF son miembros de la cisteína ricos de crecimiento tisular /61 conjuntivo /factor de nefroblastoma (CCN) de la familia de reguladores de crecimiento. Estas proteínas juegan papeles diversos en muchos procesos celulares, incluyendo el desarrollo, la proliferación celular, la adhesión, la migración, la angiogénesis y la tumorigénesis [29]. CCNs se expresan de manera aberrante en una amplia gama de tipos de tumores [29]. Curiosamente, tanto CYR61 y CTGF pueden funcionar como supresores de tumores u oncogenes en función del contexto celular (ver ejemplos más abajo); que es similar a la doble función de
miR-205
.
En concordancia con nuestras observaciones, la desregulación de CYR61 y CTGF también se ha demostrado en otros estudios. Por ejemplo,
CYR61
expresión es el regulado en el cáncer de cuello de útero [30], el cáncer de pulmón [31] - [33], cáncer de endometrio [34] y el carcinoma hepatocelular [35]; sin embargo, su regulación ha sido reportado en múltiples tipos de tumores, incluyendo osteosarcoma [36], glioma [37], [38], y el cáncer de mama [39], [40]. Similar a CYR61, los estudios anteriores han puesto de manifiesto los patrones de expresión de CTGF en conflicto en diferentes tipos de tumores. Por ejemplo, disminución de la expresión de CTGF se ha informado en el cáncer de pulmón [31], cáncer de mama [40], tumor de Wilm [41] y el cáncer de ovario [42]; mientras que el aumento de expresión se encontró en el cáncer papilar de tiroides [43], el cáncer colorrectal [44], de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [45], [46] y el glioblastoma [47].
Curiosamente,
MIR -205
, CYR61 y CTGF están involucrados en los procesos funcionales comunes y vías. Similar a las consecuencias funcionales de
miR-205
observados en este estudio, CYR61 se ha demostrado para suprimir el crecimiento celular en el cáncer de pulmón [32] y el cáncer hepatocelular [35]. Por otro lado, el silenciamiento de CYR61 suprime la proliferación celular y la migración en glioma [37] y las células de cáncer de páncreas [48]. La pérdida de
miR-205
expresión conduce a la inducción de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [23], [24], mientras que el silenciamiento de la expresión CYR61 inhibe la EMT [48]. El agotamiento de los
miR-205
y expresión CYR61 inhibe la señalización Akt en los queratinocitos, células de carcinoma de células escamosas orales [14] y células de glioma [37]. Como CYR61 y
miR-205
, CTGF también se ha demostrado que desempeñan ambas funciones oncogénicas y supresor en una amplia gama de tipos de células del cáncer [45], [47], [49] - [51], y también está implicado en tanto EMT [52], [53] y de la vía Akt [54] - [56]. A pesar de los numerosos estudios mencionados anteriormente, las funciones de CYR61 y CTGF en el cáncer cervical humano siguen sin estar claros. Será de interés para determinar el papel funcional de estos factores en el cáncer de cuello uterino y de evaluar sus interacciones con
miR-205
en diferentes tipos de cáncer.
En resumen, nos informan de efectos funcionales de fenotipos tumorales y nuevos objetivos de
miR-205
en células de cáncer cervical humano. Se demuestra que
miR-205
juega un papel oncogénico en el cáncer cervical humano mediante la promoción de la proliferación celular y la migración. Por otra parte, hemos identificado un conjunto de la novela
miR-205
objetivos utilizando una combinación de enfoque bioquímico y microarrays. Entre ellos,
CYR61
y
CTGF
se verificó adicionalmente a proteínas y /o los niveles de ARN. Es importante destacar que estos dos genes se downregulated en muestras de cáncer cervical humano. Nuestros hallazgos sugieren que los
miR-205
y sus objetivos (
por ejemplo
Cyr61 y CTGF) pueden desempeñar un papel importante en la patogénesis del cáncer de cuello de útero, y que
miR-205
(y sus objetivos) pueden proporcionar a los posibles valores de diagnóstico de patología cervical.
Materiales y Métodos
muestras de tejido y Ética Declaración
Treinta pares de tumor cervical congelaron rápidamente y emparejados tejidos normales de las regiones adyacentes de 30 pacientes fueron proporcionados por el Grupo de Oncología Ginecológica Banco de tejidos (Columbus, Ohio). Tumor y muestras de tejido normal se habían verificado en forma de tumor o no tumor mediante examen histopatológico de hematoxilina y eosina secciones de parafina teñidos. Veintinueve pares de las muestras se incluyeron en nuestra anterior RNA pequeño de perfiles por la tecnología de secuenciación profunda [9]. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Instituto Karolinska. No fue necesaria ninguna consentimiento informado por escrito, porque todos los materiales clínicos fueron desprovistos de identificación. La junta comité de ética del Instituto Karolinska renuncia específicamente la necesidad de consentimiento
líneas celulares de cáncer de cuello uterino
Se utilizaron siete líneas celulares de cáncer cervical humano:. CaSki, HeLa, SW756, ME-180, SiHa, C4I y C33A. CaSki y ME-180 células fueron establecidas originalmente de sitios de metástasis de cáncer de cuello de útero, y las otras líneas celulares se derivan de tumores cervicales primarias [57] - [61]. Estas líneas fueron amablemente proporcionados por el Dr. Keng-Ling Wallin (Hospital de la Universidad Karolinska, Suecia), y que habían sido adquiridos de American Type Tissue Culture (ATCC). CaSki y las células ME-180 se cultivaron en RPMI 1640, mientras que HeLa, SW756, SiHa, C4I y las células C33A se cultivaron en medio DMEM. Todas las células se complementaron con 10% de FBS y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un incubador humidificado.
TaqMan cuantitativa transcripción reversa -PCR (QRT-PCR)
Expresión de miRNAs maduros y mRNAs se cuantificó mediante qRT-PCR usando un sistema de PCR en tiempo real Fast-Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems). El ARN se extrajo usando el kit de aislamiento mirVana miRNA (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX), la aplicación de pequeñas enriquecimiento ARN a partir de muestras de tejido y el aislamiento de ARN total a partir de líneas celulares. las concentraciones de ARN se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).
Para madura miARN, cDNA se sintetizó a partir de 25 ng de ARN pequeño ARN enriquecido para muestras de tejido, 120 ng de ARN total para líneas celulares o 15 ng de ARN-Ago2 inmunoprecipitaron utilizando Taqman MicroARN transcripción reversa Kit (Applied Biosystems). Prediseñados TaqMan microARN ensayos para
miR-205 gratis (ID 000509),
miR-21 gratis (ID 000397) y
miR-30a-5p gratis (ID 000417) fueron adquiridos de Applied Biosystems. Todas las reacciones se realizaron por triplicado en tres ocasiones independientes, y los niveles relativos de expresión se normalizaron a la media geométrica de
RNU6B
(ID 001093) y
RNU43
(ID 001095), y se informaron como 2
-ΔCT.
para la cuantificación del mRNA, cDNA fue sintetizado a partir de 200 ng de ARN gran fracción (
es decir
fracción de ARN se mantuvo después de la pequeña enriquecimiento ARN) de las muestras de tejido o 50 ng Ago2-inmunoprecipitada ARN utilizando alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Applied Biosystems).