Extracto
Antecedentes
p63 es un miembro de la familia p53 que se ha implicado en el mantenimiento de los compartimentos de células madre epiteliales. Estudios anteriores demostraron que p63 está regulado por disminución en el cáncer vesical infiltrante, pero la relación entre la expresión de p63 y la supervivencia no está claro.
Metodología /Principales conclusiones
Se utilizó PCR en tiempo real para caracterizar expresión p63 y varios genes implicados en la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) en líneas celulares de cáncer de vejiga humanos (n = 15) y los tumores primarios (n = 101). Se correlacionaron la expresión de marcadores de tumores en estadio, enfermedad-específica (DSS), y la supervivencia global (SG). La expresión de E-cadherina y p63 correlaciona directamente uno con el otro e inversamente con la expresión de la mesenquimales marcadores Zeb-1, Zeb-2, y vimentina. los cánceres de vejiga no músculo-invasivo (Ta y T1) expresaron uniformemente altos niveles de E-cadherina y p63 y los bajos niveles de los marcadores mesenquimales. Curiosamente, un subconjunto de músculo invasivo (T2-T4) tumores mantiene altos niveles de E-cadherina y la expresión de p63. Como se esperaba, hubo una correlación fuertemente significativa entre la expresión marcador de EMT y la invasión del músculo (p & lt; 0,0001). Sin embargo, la SG fue menor en los pacientes con tumores del músculo invasivo que retuvieron p63 (p = 0,007).
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos confirman que los marcadores moleculares de EMT son elevados en el músculo invasivo los cánceres de vejiga, pero, curiosamente, la retención de la p63 marcador "epitelial" en los tumores del músculo invasiva se asocia con un peor resultado
Visto:. Choi W, Shah JB, Tran H, R Svatek, marqués L, Lee IL, et al. (2012) Expresión de p63 define un subconjunto letal de cáncer vesical infiltrante. PLoS ONE 7 (1): e30206. doi: 10.1371 /journal.pone.0030206
Editor: Wafik S. El-Deiry, Instituto de Cáncer de Penn State Hershey, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2011; Aceptado: December 12, 2011; Publicado: 10 Enero, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Cancer Center Proyectos financiados (CA016672) y el MD Anderson SPORE en cáncer genitourinario (CA091846). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los cánceres de vejiga se desarrollan a lo largo de dos "vías" que produce tumores con características muy diferentes clínicos [1]. Uno lleva a la formación de tumores papilares con altas tasas de recurrencia que rara vez metastatizan o causan la muerte, mientras que el otro conduce a la aparición de tumores no papilar, musculares invasiva, de los cuales un subconjunto progresa rápidamente y es fatal. En la actualidad, es imposible identificar prospectivamente los tumores del músculo invasivo letales; Sin embargo, la evidencia acumulada sugiere que la característica reprogramación molecular de un proceso de desarrollo conocido como epitelio-mesenquimal transición (EMT) está involucrado. cánceres del músculo invasivo se caracterizan por la regulación a la baja de E-cadherina y p63, dos marcadores "epiteliales", expresados de manera uniforme en el urotelio normal y en los cánceres no músculo invasores [2] - [5]. Estos cambios se acompañan de la regulación positiva de mesenquimales marcadores Zeb-1, Zeb-2, vimentina, y MMP9, lo que lleva a un aumento de la invasión y migración. Un papel para EMT en la conducción de la progresión del cáncer de vejiga y metástasis es consistente con una gran cantidad de evidencia emergente en otros tumores sólidos, en particular cáncer de mama [6] - [8]. Además, la expresión forzada de los reguladores de EMT puede causar cambios que recuerdan a los observados en las células madre de cáncer [8] - [10]. Dado que las células madre del cáncer generalmente parecen ser resistentes a la quimioterapia convencional, la relación entre la EMT y "troncalidad" proporciona apoyo adicional para la idea de que la EMT contribuye a la letalidad.
inició el presente estudio para probar directamente la hipótesis de que marcadores de EMT podían identificar el subgrupo de tumores del músculo invasivo que exhiben un comportamiento clínico agresivo. En líneas celulares de cáncer de vejiga humano, se observó una correlación directa entre la E-cadherina y la expresión p63, y una correlación inversa entre estos marcadores y Zeb-1, Zeb-2, y vimentina, lo que indica que se agrupan en único "epitelial" y "mesenquimales "subconjuntos. Nuestros datos confirman que los marcadores mesenquimales (ZEB-1, Zeb-2, MMP, y vimentina) se expresan casi exclusivamente por los tumores del músculo invasivo [11], [12], el subconjunto de cáncer de vejiga con un peor resultado. Curiosamente, nuestros datos también demuestran que dentro de este subconjunto con invasión muscular, tumores de retención de p63 (que parece ser un marcador "epitelial"), pantalla de supervivencia significativamente peor que aquellos tumores musculares invasiva que muestran un fenotipo más típico "mesenquimales". Se discuten posibles explicaciones para la relación entre p63 y un peor pronóstico de supervivencia.
Resultados
Expresión de marcadores de EMT en expresión génica de datos publicados
Primero examinamos la expresión de marcadores de EMT en dos perfiles de expresión génica de datos a disposición del público [13], [14]. En tanto, la agrupación jerárquica sin supervisión distingue superficial de la enfermedad músculo-invasivo [13], [14]. Los tumores superficiales expresan mayores niveles de marcador de E-cadherina "epitelial" que los tumores músculo-invasivo; Por el contrario, los tumores del músculo invasivo expresan mayores niveles de marcadores "mesenquimales" (Figura 1A-B)
A & amp.; B: Todos los genes marcadores de EMT con diferencias significativas en la expresión (P & lt; 0,001) en 2 conjuntos de datos disponibles públicamente independientes. Un cDNA microarray en la empresa con 10368 sondas se utilizó en A [13]. La plataforma HU-133A Affymetrix se utilizó en B [14].
Las relaciones entre los marcadores de EMT en líneas celulares de cáncer de vejiga humana
A continuación mide la expresión de marcadores de EMT en el 15 de la vejiga líneas celulares de cáncer por cuantitativa en tiempo real PCR. Los resultados sugieren la existencia de 2 subconjuntos dicotómicas de tumores, uno que muestra un patrón de "epitelio" se caracteriza por la expresión de E-cadherina y p63; la otra caracterizado por la expresión de marcadores "mesenquimales" ZEB-1, ZEB-2, y vimentina (Figura 2A-B). La cuantificación de los dos ARNm de p63 (Figura 2B) y la proteína (datos no mostrados) los niveles demostraron que se expresa exclusivamente por las, líneas celulares de E-cadherina-positivo "epiteliales", y que la expresión de las isoformas Delta N-p63 superaron expresión de la TA isoformas -p63 en varios órdenes de magnitud (Figura 2B). Contrariamente a nuestras expectativas, niveles de MMP2 y MMP9 no estaban íntimamente asociados con la EMT en nuestras líneas celulares (Figura 2C); sin embargo, el pequeño número de líneas de células para las que las MMPs fueron elevados impactos de la importancia de esta observación. Es importante destacar que estudios anteriores llegaron a la conclusión de que las células de cáncer de vejiga "mesenquimales" son como un grupo altamente invasiva y resistente a la radiación y EGFR dirigida la terapia [11], [12], [15] - [17], lo que sugiere que podrían poseer características biológicas desfavorables .
(A) mRNA expresión de e-cadherina, Zeb-1, 2-Zeb y vimentina se midió por cuantitativos PCR en tiempo real. Se observó una correlación inversa entre la E-cadherina y Zeb-1 /Zeb2 a través de las líneas celulares. (B) la expresión del ARNm de p63 total TAp63 y Delta N-p63 isoformas se midieron mediante cebadores específicos de isoformas. (C) la expresión de ARNm relativa de MMP2 y MMP9 en células de cáncer de vejiga. Los datos mostrados son la media ± SEM de las muestras por triplicado.
expresión de marcadores de EMT en un nuevo conjunto de tumores vesicales
A continuación, mide la expresión de genes marcadores de EMT por RT-PCR en la vejiga primaria cánceres (n = 101, Tabla 1). En consonancia con los datos públicos (Figura 1) y otros informes [11], [12], en tiempo real los datos de la PCR reveló que los tumores superficiales expresaron mayores niveles de marcadores epiteliales E-cadherina y p63, mientras que los tumores musculares invasiva expresaron niveles más altos de mesenquimales marcadores (vimentina, ZEB1, Zeb2, MMP2, MMP9) (Figura 3 A y B). Como se muestra en la figura 3, los tumores superficiales como un grupo expresaron de forma más consistente E-cadherina y p63 [3], [4], [18] - [23] que tenía tumores de músculo invasivo (valor de p & lt; 0,0001, Figura S1A) . Al igual que en nuestra línea celular de datos, Delta N-p63 fue la principal isoforma de p63 presente en el tejido del tumor primario (Figura 3C). Por el contrario, los tumores del músculo invasivo expresaron con mayor frecuencia los marcadores mesenquimales (ZEB-1, Zeb-2, vimentina) que los tumores superficiales (los tres valores p & lt; 0,0001, Figura S1B). Como habíamos observado en líneas celulares, la expresión de E-cadherina se asoció directamente con la expresión de p63 (coeficiente de correlación rho de Spearman = 0,32, p = 0,0028) e inversamente con la expresión de Zeb-1 (rho = -0,37, p & lt; 0,0001) , Zeb-2 (rho = -0,48, p & lt; 0,0001), y vimentina (rho = -0,49, p & lt; 0,0001). Por otro lado, a pesar de la MMP-2 y MMP9 también se expresaron en niveles elevados en los tumores del músculo invasivo en comparación con los tumores superficiales (ambos valores de p & lt; 0,0001, Figura S1C), no observamos como una fuerte correlación entre la expresión de MMP-2 y MMP9 y la expresión de p63, ya sea en el conjunto global de los tumores (rho de Spearman = correlación de -0.17, p = 0,08, entre p63 y MMP9, y rho = -0,24; p = 0,01 entre p63 y la MMP-2), o en el subgrupo de pacientes musculares invasiva (rho = -0,15, p = 0,21, entre p63 y MMP9, y rho = -0,23, p = 0,065 entre p63 y MMP2). Sin embargo, una fuerte correlación inversa entre la E-cadherina y MMP9 y MMP2 se sigue manteniendo (rho = -0,46, p & lt; 0,001 con MMP9, rho = -0,38; p & lt; 0,001 con la MMP-2) en el grupo global, y las mismas asociaciones se observaron en pacientes musculares invasiva (rho = -0,45, p & lt; 0,001 con MMP9; rho = -0,39, p = 0,002 con MMP2).
(a) Expresión de marcadores de EMT núcleo relacionados E-cadherina (e-cadherina, p63, Zeb-1, y Zeb-2) en 101 tumores vesicales primarios se evaluó por cuantitativa en tiempo real PCR. (B) Expresión de MMP-2, MMP9, y vimentina. (C) Expresión de TAp63 y Delta N-p63 en un subconjunto representativo de las muestras. Todas las muestras en cada figura se muestran en el mismo orden.
Superior p63 y MMP9 se asocian con OS adversos en pacientes con enfermedad músculo-invasivo
Finalmente, se correlacionaron la expresión de marcadores de EMT como se mide por RT-PCR con la supervivencia. Dado que, como grupo, los pacientes con tumores superficiales sobreviven más tiempo que aquellos con tumores músculo-invasivo, la expresión de un fenotipo de EMT que se caracteriza por pérdida de E-cadherina y p63 se asocia con un mal pronóstico, en gran parte como resultado de la capacidad para estratificar pacientes entre la enfermedad superficial y el músculo invasiva (datos no mostrados). Sin embargo, cuando limita al subconjunto músculo invasivo de tumores, se encontró que la retención de la expresión de p63 se asoció con resultado adverso (Figura 4A-B). Se obtuvo 1,60 utilizando el análisis de regresión de los árboles, el punto de corte para la elevación de p63 & gt. En concreto, elevado p63 se asoció con una mediana de SG significativamente peor de 8 meses (intervalo de confianza del 95% de los 4, 140 meses), mientras que los pacientes con niveles más bajos de p63 tuvieron una mejora de la SG mediana de 27 meses (IC del 95%, de 17, 85 meses, log-rank p = 0,007). Los análisis de los resultados para los resultados DSS fueron similares a las para el resultado OS. p63 elevada fue asociada con un DSS mediana de 8 meses con un intervalo de confianza del 95% de (19, 140) meses, mientras que los pacientes con niveles más bajos de p63 tenían una mejor DSS mediana de 41 meses (IC del 95%: 19, 140 + meses , log-rank p-valor = 0,004). Incluso en este grupo muscular invasiva, el mantenimiento de p63 se correlacionó directamente con la expresión de marcadores epiteliales (rho E-cadherina = 0,34, p = 0,006), e inversamente con marcadores mesenquimales (vimentina: rho = -0,35, p = 0,0047; zeb -1: rho = -0,36; p = 0,003; y Zeb-2: rho = -0,39, p = 0,0014; respectivamente). Curiosamente, la retención de p63 en pacientes clasificados con tumores T1 también se asoció con resultados claramente desfavorables para la supervivencia. Los pacientes con enfermedad T1 con mayores niveles de p63 tuvieron una supervivencia media de 58 meses, mientras que no hubo muertes relacionadas con la enfermedad en pacientes con niveles más bajos de p63 en este subgrupo (datos no mostrados).
Todo p- los valores proporcionados son a 2 caras, utilizando la prueba de log-rank. R: p63 elevada se asocia con resultados adversos en pacientes con cáncer invasivo del músculo (mediana de SG 8 meses, 95% intervalo de confianza 4, 140 meses), como comparar a una menor expresión de p63 (mediana de SG de 27 meses; IC del 17 al 95% , 85 meses) log-rank p = 0,007. B: Aumento de p63 se asoció con el DSS adversos en pacientes con cáncer invasivo del músculo (DSS mediana de 8 meses; IC del 95%: 19, 140), mientras que los pacientes con niveles más bajos de p63 tuvieron una mejoría de DSS mediana de 41 meses (IC del 95%: 19 , más de 140 meses, log-rank p = 0,004). C: Elevado MMP9 se asoció con resultado adverso (mediana de SG de 10,2 meses, el 95% i4.9 IC, 26,6) en comparación con MMP9 inferior (mediana de SG de 35,4 meses; IC del 95%: 19,3, 107,9, p = 0,003). D: Elevado MMP9 se asoció con DSS adversa (mediana de 10,3 meses; IC del 95%: 4,9, más de 140) en comparación con MMP9 inferior (DSS mediana de & gt; 140, 95% CI: 19.3, más de 140 meses, p = 0,01). E (OS) y F (DSS): El uso de un modelo multivariado de regresión de Cox, p63 y MMP9 eran predictores independientes de los resultados adversos en la enfermedad músculo-invasiva. Los pacientes fueron asignados 1 punto cada uno, ya sea para p63 elevada o MMP9 (0 = ninguno elevado, a 1 = sea elevado, a 2 = ambos elevada). Se observó peor supervivencia cuando se elevan los dos marcadores, y lo mejor cuando ninguno fue elevado (mediana de SG en 0, 1, o 2: & gt; = 69, 10 meses y 8 meses, con un sistema operativo de 5 años o 55%, 8 % y 0%, respectivamente).
En un estudio previo se demostró que una proporción baja de e-cadherina /MMP9 también se asoció con un resultado adverso supervivencia. Por lo tanto, también se evaluó la relación entre la expresión de MMP9 y OS en esta cohorte (Figura 4 C y D). En consonancia con los datos anteriores, la expresión de alto nivel de MMP9 se asoció con OS más corto (mediana de SG 10.2 meses, IC 95% 4,9, 26,6) en comparación con los tumores que expresan cantidades menores de MMP9 (OS mediana 35,4 meses, IC del 95% 19,3, 107,9, p = 0,003, Figura 4C). Asimismo, el DSS mediana era más corto con alto nivel de expresión de MMP9 (mediana DSS 10,3 meses, IC 95% 4,9, más de 140 meses) y en comparación con las que expresan cantidades menores de MMP9 (DSS mediana & gt; 140, IC del 95% 19,3, 140+ meses, p = 0,01, Figura 4D).
también confirmó la asociación entre p63 elevada y una baja supervivencia en el cáncer urotelial con invasión muscular utilizando un conjunto de datos de expresión de genes independientes (GEO número de Acceso GSE13507 [24]) utilizando el análisis de regresión de árboles, se obtuvo el punto de corte para la elevación p63. p63 elevada se asoció con una significativamente peor OS y DSS (log-rank p = 0,012 y 0,002, respectivamente, la figura S2). intentos adicionales de confirmación de tejidos mediante inmunohistoquímica en un microarray de tejido de cáncer vesical infiltrante no fueron concluyentes, en gran parte como resultado de la falta de especificidad del anticuerpo 4A4 disponible comercialmente para Delta N-p63, un hallazgo también confirmada por un grupo externo [25].
p63 y MMP9 son predictores independientes de OS de prueba
Un modelo de regresión de Cox se utilizó para evaluar simultáneamente el efecto de la expresión de dos o más marcadores de EMT por RT-PCR y estadio de la enfermedad en el sistema operativo. No es de extrañar que la etapa de la enfermedad fue un predictor estadísticamente significativo de la SG (CRI = 2,15 invasiva vs superficial, p = 0,05). Curiosamente, tanto p63 continua y MMP9 fueron predictores independientes de sistema operativo (p63: HR = 1,69 para la p63, p = 0,004, MMP9 log: HR = 1,25, p = 0,013), además de estadio de la enfermedad entre los 101 pacientes. Otras expresiones marcador no se asociaron con el resultado del sistema operativo en el modelo multivariado. A pesar de incluir otras características del tumor, incluyendo la presencia /ausencia de histología escamosa, estadio de la enfermedad, y la edad al momento del diagnóstico en el modelo de regresión multivariante, tanto p63 y el registro de MMP9 se mantuvieron como predictores independientes de sistema operativo (p63: HR = 1,54, p = 0,017 ; log-MMP9: HR = 1,26, p = 0,011). Ambos p63 y la transformación logarítmica de MMP9 también fueron predictores independientes de DSS (p63: HR = 2,04 para la p63, p = 0,0006, registro MMP9: HR = 1,31, p = 0,006), además de estadio de la enfermedad entre los 101 pacientes. Incluida la presencia /ausencia de histología escamosa, estadio de la enfermedad, y la edad al momento del diagnóstico en el modelo de regresión multivariante, tanto p63 y el registro de MMP9 se mantuvieron como predictores independientes de DSS (p63: HR = 1,63, p = 0,022; log-MMP9: HR = 1,35, p = 0,003). Cuando nos limita el análisis de nuestra marcador multivariado para los tumores del músculo invasivo (n = 67, a partir de las 101 muestras utilizadas en la RT-PCR), la misma tendencia, pero aumentó ligeramente las proporciones de riesgo para el sistema operativo con se observó tanto p63 y MMP9 (p63: HR = 2,17, p = 0,0003; log-MMP9: HR = 1,31, p = 0,007), lo que sugiere que tanto p63 y MMP9 son predictores independientes de la supervivencia adversos en la enfermedad músculo-invasiva. La misma tendencia se observó también con ligero aumento de las proporciones de riesgo para el DSS (p63: HR = 2,40, p = 0,0018; log-MMP9: HR = 1,37, p = 0,003) en comparación con el sistema operativo. Asignación de los pacientes 1 punto cada uno, ya sea para una elevada expresión de p63 o MMP9 (0 = ninguno elevada, 1 = sea elevada, 2 = ambos elevada), la supervivencia estratificada con la peor supervivencia cuando ambos fueron elevados (Figura 4E y F), y la mejor la supervivencia cuando ninguno fue elevado (mediana de SG en 0, 1, o 2: & gt; = 69, 10 meses y 8 meses, con una SG a 5 años del 55%, 8% y 0%, respectivamente). de riesgos proporcionales de supuestos para cada factor de riesgo es satisfecha en el modelo de regresión, ya sea para 67 pacientes músculo-invasivo, o 101 pacientes con cáncer de vejiga primario.
Discusión
Los estudios anteriores llegaron a la conclusión de que la pérdida de p63 es asociada con una menor supervivencia en pacientes con cáncer de vejiga [3], [20]. En contraste, nuestros resultados sugieren que el mantenimiento de la expresión de p63 se asocia con resultados adversos en pacientes con cáncer de vejiga invasivo del músculo. En la superficie nuestros resultados parecen contradecir estos otros estudios. Sin embargo, sospechamos que esta aparente discrepancia se debe en parte a la inclusión de cánceres superficiales que muestran uniformemente buenas características de supervivencia en los análisis anteriores en contraposición a nuestro enfoque actual sobre su impacto en la enfermedad músculo-invasiva. Como grupo, los cánceres de vejiga más superficiales tienen una excelente supervivencia a largo plazo (cerca de 100%), y los altos niveles uniformemente expresas de E-cadherina y p63. Por otra parte, la pérdida de p63 está restringida a un subconjunto de los tumores de músculo invasivo, y la enfermedad muscular invasiva se asocia típicamente con peores resultados clínicos en comparación con el cáncer superficial, no invasiva. Por lo tanto, la inclusión de tumores superficiales que muestran uniformemente un fenotipo "epitelial" podría diluir a cabo un efecto adverso de un fenotipo "epitelial" en la cohorte de músculo invasivo. Además, el anticuerpo comercial (4A4), que es más comúnmente utilizado para medir p63 en secciones de tejido no puede distinguir los dos principales isoformas p63 (TA y Delta n), por lo que la relación entre la expresión de Delta N p63 y un peor pronóstico en el cáncer vesical infiltrante podía no debe reconocerse en los estudios basados en IHC anteriores que empleaban este reactivo [4], [20]. Hemos tratado de confirmar nuestros resultados basados en ARNm utilizando el 4A4 en microarrays de tejidos y los resultados no fueron concluyentes (datos no mostrados). En consonancia con esta conclusión, si bien nuestro manuscrito estaba siendo preparado para el grupo de presentación Cordón-Cardo generó un anticuerpo anti-p63 que es específico para las isoformas Delta n y lo utilizó en una cohorte independiente de los tumores del músculo invasivo para demostrar que los niveles de proteína Delta N p63 también identificar un subconjunto de cánceres letales, mientras que sus resultados con el anticuerpo 4A4 fueron concluyentes [25]. En última instancia, serán necesarios estudios prospectivos para evaluar rigurosamente la importancia clínica de estos hallazgos.
El trabajo realizado en los últimos 5 años se ha renovado el interés en el papel de la EMT en la progresión del cáncer y la metástasis. Un influyente estudio demostró que las variantes metastásicas isogénicas de una línea celular de cáncer de mama murino sobreexpresa la E-cadherina represor, Twist, y que se requiere la expresión de la torcedura elevado de metástasis [7]. El trabajo posterior demostró que la expresión de torsión forzada en las células epiteliales mamarias normales desencadena la EMT y la expresión simultánea upregulated de marcadores de células madre de cáncer de mama [26]. Estudios paralelos de otros han reforzado la idea de que la EMT impulsa la progresión tumoral, metástasis, resistencia a los medicamentos, y un "tallo-como" fenotipo [10], [27]. Con respecto a los cánceres de vejiga, estudios recientes implicados EMT en la progresión de la enfermedad, la invasión /migración, y la resistencia a la radiación y la terapia [11] dirigidos, [12], [15] - [17]. Con estas observaciones en mente, esperábamos que la medición de la expresión de marcadores de EMT identificaría el subconjunto más letal de los cánceres de vejiga músculo-invasivo. Nuestros resultados confirman que los marcadores de EMT fueron elevados en cánceres musculares invasiva. Sorprendentemente, sin embargo, el aumento de la expresión de p63 se asocia con resultados adversos tanto en el músculo-invasivo y en los tumores T1.
Varios estudios recientes han demostrado que la EMT y el fenotipo es regulada por micro ARN (miR "tallo-como" 205 y miR-200 de la familia) [28] - [31]. miR-205 y la familia miR-200 pueden mantener el fenotipo epitelial mediante la supresión de la expresión de factores mesenquimales de transcripción (ZEB-1 y Sip1) y la introducción de miR-205 y miR-200 en células mesenquimales puede revertir la morfología celular mesenquimal a una fenotipo epitelial [30]. Curiosamente, hemos descubierto recientemente que ΔNp63 promueve directamente la expresión miR205 (M. Tran, manuscrito en preparación), que proporciona una explicación de la estrecha correlación entre la expresión de marcadores epiteliales ΔNp63 y en líneas celulares de cáncer de vejiga y tumores primarios.
también estamos investigando los efectos de ΔNp63 en biología celular del cáncer de vejiga con el fin de comprender mejor por qué su expresión se correlaciona con la supervivencia del paciente pobres. Aunque estructuralmente similar a p53, p63 es filogenéticamente más antiguo que su primo y pantallas mucho más alto de conservación entre las especies [32], [33]. Además, a pesar de que p53 y p63 interactúan con similares motivos de secuencia de ADN, la mayoría de las isoformas de p63 no transactivan genes diana p53 sino que pueden funcionar como negativos dominantes que suprimen dependiente de p53 de transactivación [33]. P63 se expresa a altos niveles en las capas basales contienen los compartimentos de células madre normales en diversos tejidos epiteliales, incluyendo el urotelio. ablación dirigida de la expresión p63 altera la diferenciación normal de la vejiga en el ratón, lo que lleva a la pérdida de la capa basal /suprabasal con la retención selectiva de las células llamados "paraguas" [34]. Estas observaciones han llevado a muchos investigadores a proponer que p63 es esencial para el mantenimiento de auto-renovación y /o supervivencia de las células madre normales [35]. Por lo tanto, la expresión de p63 en la enfermedad de músculo invasivo puede estar asociada tanto con fenotipo epitelial y "stemness" [36] - [38]. Sin embargo, las células dentro del urotelio normales expresan TAp63 (no ΔNp63), que se espera que tenga efectos muy diferentes en la biología celular. Sorprendentemente, nuestros estudios preliminares indican que desmontables estable de ΔNp63 en células de cáncer de vejiga provoca una fuerte inhibición de la proliferación, los efectos que se asocian con downreguliation de c-Myc mRNA y expresión de proteínas (L. Marquis et al, manuscrito en revisión), Por lo tanto, Actualmente favorecer la idea de que la significación de ΔNp63 como un marcador de pronóstico negativo se relaciona con sus efectos sobre la proliferación de células tumorales. Se requieren estudios adicionales sobre el mecanismo para definir las relaciones entre el fenotipo de EMT, "troncalidad", la proliferación, la sensibilidad a los fármacos, y la metástasis en modelos preclínicos y tumores primarios.
Conclusiones
superficial (no músculo- ) tumores invasivos expresar niveles más altos de los marcadores epiteliales e-cadherina y p63, mientras que los tumores músculo-invasivo tienen una mayor expresión de marcadores mesenquimales ZEB1, ZEB2, vimentina, MMP2 y MMP9. Sin embargo, hay un subconjunto de cáncer de músculo invasivo que tiene un pronóstico adverso en el entorno de la expresión de p63 elevada. Esta elevación en p63 está asociada con la expresión de retenida de E-cadherina y la disminución de los niveles de marcadores mesenquimales incluyendo vimentina, ZEB1 y Zeb2, lo que sugiere que el acoplamiento entre la expresión de p63 y el fenotipo "epitelial" permanece presente en un subconjunto de cánceres de músculo invasivo. MMP9 expresión parece ser independiente de p63 en la predicción de resultados adversos, lo que sugiere la regulación por mecanismos independientes. Los mecanismos moleculares que impulsan la invasión muscular en tumores que exhiben un fenotipo "epitelial" y el papel de la EMT en la capacidad de respuesta de la quimioterapia y la metástasis necesitan ser más explorado en futuros estudios.
Materiales y Métodos
Uso expresión de genes públicos conjuntos de datos que determinamos si la disminución de la expresión de la "epitelial" marcador de e-cadherina y el aumento de la expresión de varios marcadores "mesenquimales" (los represores e-cadherina Zeb-1, Zeb-2, y Twist, la matriz metaloproteasas MMP-2 y MMP9 , fibronectina y vimentina) se asoció con la progresión a músculo-invasión. A continuación, utiliza un panel de líneas celulares de cáncer de la vejiga para determinar si la expresión de "epitelial" y marcadores "mesenquimales" eran mutuamente excluyentes presentan distinta "epitelial" y "fenotipos mesenquimales". Usando cuantitativa en tiempo real PCR hemos probado si la relación entre la EMT y las enfermedades músculo-invasivo estaba presente en una nueva cohorte de pacientes con cáncer de vejiga y la expresión de marcadores de EMT correlacionada con la supervivencia.
Análisis de marcadores de EMT en Gene Pública Conjuntos de datos de perfiles de expresión
Dos públicas de genes humanos cáncer de vejiga expresión de datos se utilizaron para analizar los marcadores de EMT. Los datos de Blavari et al y Carbayo et al fueron descargados de la Expresión Génica Omnius (número GEO adhesión GSE-1827 [13]) y el Diario de Oncología Clínica [14], respectivamente. BRB ArrayTools versión 4.2, desarrollado por el NCI [39] se utilizó para analizar los datos [13], [14]. Para seleccionar los genes expresados diferencialmente entre los dos subgrupos diferentes (tumores superficiales y músculo-invasivo), se utilizó una herramienta de comparación de clases dentro de BRB ArrayTools para calcular la significación de las observaciones (es decir:
P Hotel & lt; 0,001 calculado a partir de dos muestras t-test con una tasa de falso descubrimiento (FDR) inferior a 0,1). Para observar los patrones de expresión de genes de EMT, el valor de cada gen, se ajustó a una media de cero, se utilizó para la agrupación con el Cluster y TreeView [40].
Las líneas celulares
Las líneas celulares se obtuvieron a partir el MD Anderson vejiga SPORE Banco de Tejidos, y sus identidades validado por la huella de ADN utilizando AmpFlSTR® Identifiler® amplificación (Applied Biosystems, Foster City, CA) o AmpF
l
STR® Profiler amplificación por PCR (Applied Biosystems), realizado por el MD Anderson Caracterizado Línea celular Core, o nosotros mismos, respectivamente. Estas huellas digitales están disponibles en el sitio web de MD Anderson de la vejiga de esporas. Las líneas celulares se cultivaron en MEM de Eagle Modificado suplementado con 10% de suero bovino fetal, vitaminas, piruvato de sodio, L-glutamina, penicilina, estreptomicina y aminoácidos no esenciales a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora.
muestras de seres humanos
datos de los resultados clínicos y muestras de pacientes para PCR en tiempo real se obtuvieron de 101 pacientes de la base de datos de investigación cánceres genitourinarios MD Anderson. tejidos frescos congelados fueron obtenidos de nuestro Core SPORE del tejido. Las muestras se recogieron usando macrodissection centrándose en las áreas con la concentración de tumor al menos 80%. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado con anterioridad que permite su colección de tejidos y los datos clínicos en nuestra base de datos de investigación genitourinario. Se obtuvo un protocolo adicional aprobado por el IRB para el análisis específicos descritos en este documento. Todas las muestras de tejido fueron revisados por un patólogo. Los pacientes fueron clasificados como músculo invasivo para el crecimiento tumoral en la capa muscular propia; de lo contrario, se clasificaron como superficial (no músculo invasivo). Total RNA de muestras humanas fueron aisladas utilizando mirVana ™ miARN Kit de aislamiento (Ambion, Inc).
basados en tiempo real TaqMan PCR análisis de la transcriptasa reversa
marcadores de EMT se analizaron mediante PCR en tiempo real (ABI PRISM 7500; Applied Biosystems). Se utilizó el método CT comparativa [41] para determinar la expresión génica relativa para cada gen diana; la ciclofilina A del gen era el control interno utilizado para normalizar la cantidad de ARN amplificable (números de ensayo Identificación: E-cadherina; Hs00170423_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, ZEB2; Hs00207691_m1, vimentina; Hs00185584_m1, MMP2; Hs00234422_m1, MMP9; Hs00957562_m1 y ciclofilina A; Hs99999904_m1). Los cebadores y sondas fluorescentes para p63 isoformas fueron diseñados por Primer Express 3.0 (Applied Biosystems) con las siguientes secuencias: TAp63 cebador directo 5'-TGCAGGACTCGGACCTGAGT-3 ', cebador inverso 5' TGTTCAGGAGCCCCAGGTT-3 ', 5'-sondas ACCCCATGTGGCCAC-3 '; Delta N-p63 cebador directo 5'-3-GGAAAACAATGCCCAGACTCA, sondas 5'-TTTAGTGAGCCACAGTACAC-3 '', el cebador 5'-3 TGTTCAGGAGCCCCAGGTT inversa '. Los cebadores y sondas para las isoformas de p63 se validaron utilizando métodos de la curva estándar (datos no mostrados).
Métodos Estadísticos
Los análisis estadísticos se basan en información de 101 pacientes. Los objetivos primarios fueron examinar las correlaciones entre la expresión del marcador y el estadio de la enfermedad, y para evaluar la asociación entre la expresión del marcador y la supervivencia global (SG) y la supervivencia específica de la enfermedad (DSS). estadio de la enfermedad se estratificó como superficial (Ta o T1) o músculo-invasivo (& gt; = T2). Expresión valores fueron comparados entre el cáncer superficial de vejiga y el músculo invasivo mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Las correlaciones entre la expresión de marcadores se cuantificaron utilizando coeficientes rho de Spearman. La estimación de Kaplan-Meier de la distribución de supervivencia fue representada por la expresión de biomarcadores investigado caracterizado como alto y bajo (por ejemplo, p63, MMP9), en el que el punto de corte para definir alto y bajo se obtuvo a partir de análisis de regresión de los árboles [42]. Se utilizó la prueba de log-rank para comparar las distribuciones de supervivencia entre los grupos. El modelo de riesgos proporcionales fue utilizado para evaluar los efectos de múltiples marcadores y el estadio tumoral de DSS y OS. Se realizó una transformación logarítmica de los valores de expresión MMP9 debido a la asimetría de los datos. Todos los p-valores presentados son a 2 caras.
Apoyo a la Información
Figura S1.