oral
Extracto
Antecedentes
Beclin 1 y 2 son Beclin proteínas relacionadas con la autofagia que muestran las secuencias de aminoácidos similares y estructuras de dominio. Beclin 1 estableció la primera conexión entre la autofagia y el cáncer. Sin embargo, el papel de Beclin 2 en el cáncer no está claro. Los objetivos de este estudio fueron analizar Beclin 1 y 2 Beclin expresiones en los tejidos de cáncer oral y en líneas celulares, y para evaluar su posible papel en la progresión del cáncer.
Métodos
Hemos investigado Beclin 1 y Beclin 2 expresiones mediante técnicas de inmunohistoquímica en 195 casos de cáncer oral. El valor pronóstico de Beclin 1 y 2 Beclin se analizaron estadísticamente.
in vitro
, la sobreexpresión de las proteínas y la caída beclin se realizaron en una línea celular de cáncer de boca, SAS. Los ensayos de flujo de inmunofluorescencia y la autofagia confirmaron que las proteínas eran beclin de la autofagia. Los impactos de Beclin 1 y 2 Beclin en el crecimiento del tumor y la autofagia se evaluaron mediante la conversión de LC3-I a LC3-II y por los ensayos por clonación, respectivamente.
Resultados
cáncer de los tejidos orales exhiben aberrantes expresiones de Beclin 1 y 2. Los Beclin citoplasmáticos Beclin 1 y 2 Beclin expresiones no estaban relacionados en tejidos de cáncer oral. En los análisis de supervivencia, alta expresión citoplasmática Beclin 1 se asoció con la supervivencia específica de la enfermedad baja, y la expresión negativa Beclin 1 nuclear se asoció con la supervivencia libre de recurrencia era alto. Los pacientes con expresión alta o baja citoplasmática Beclin 2 tenían tasas significativamente más bajas de supervivencia global y enfermedades específicas de supervivencia que aquellos con una expresión moderada. En las células de cáncer oral, la sobreexpresión de cualquiera Beclin 1 o 2 Beclin llevaron a la activación de la autofagia y el aumento de la supervivencia clonogénico; desmontables de Beclin 2 autofagia alterada y aumento de la supervivencia clonogénico.
Conclusiones
Nuestros resultados indican que los patrones distintos de Beclin 1 y 2 Beclin se asociaron con resultados clínicos agresivos. Beclin 1 sobreexpresión, así como Beclin 2 sobreexpresión y agotamiento, contribuido al crecimiento del tumor. Estos hallazgos sugieren proteínas beclin están asociados con la tumorigénesis
Visto:. Liu J-L, Chen F-F, Chang S-F, Chen C-N, pulmón J, Lo C-H, et al. (2015) La expresión de proteínas de la familia beclin se asocia con la progresión tumoral en el cáncer oral. PLoS ONE 10 (10): e0141308. doi: 10.1371 /journal.pone.0141308
Editor: Spencer B. Gibson, Universidad de Manitoba, Canada |
Recibido: 24 Junio, 2014; Aceptado: 7 Octubre 2015; Publicado: 27 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 103-2.320-B-182A-018, NMRPG6D0071) (MOST 104-2320-B -182A-012-, NMRPG6E0041), Chang Gung Memorial hospital de Chiayi Branch (CMRPG6E0071), y Chang Gung Medical Research Center (CMRPD6C0013). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer oral es uno de los cánceres más comunes y un problema creciente en todo el mundo. Las altas tasas de incidencia se producen en el sur y sudeste de Asia, partes de Europa, partes de América Latina, y las regiones del Pacífico [1]. Recientemente, la incidencia de cáncer oral se ha incrementado, especialmente en los países económicamente desarrollados [2]. La gran mayoría de cáncer oral es el carcinoma de células escamosas, que surge de la mucosa escamosa de la superficie oral. A pesar de la fenotipo histológico similares, la base molecular de cáncer oral es muy compleja, que presenta múltiples mutaciones genéticas y epigenéticas [3, 4]. La identificación de nuevos biomarcadores para el cáncer oral podrían ser aplicados en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.
La autofagia es un proceso catabólico conservadas evolutivamente que implica la degradación de los metabolitos intracelulares innecesarios y orgánulos dañados por las enzimas lisosomales. El proceso implica la formación de autofagosomas, que sobresalgan contenido citoplásmico no deseados y después entregarlos a lisosomas. La función principal de la autofagia es mantener la homeostasis celular, en particular en condiciones de nutrientes privados. Entre los genes relacionados con la autofagia,
beclin 1 | estableció la primera conexión entre la autofagia y el cáncer [5], y considerado como un gen supresor de tumores haploinsufficient [6, 7]. Beclin 1 participa en la nucleación autofagosoma en la etapa temprana de la autofagia. Además, Beclin 1 interactúa con muchos reguladores positivos y negativos que afectan la actividad de autofagia y la tumorigénesis [8-12]. Actúa como un mediador fundamental en la regulación de la autofagia.
Beclin 2
, una vez llamado
BECN1P1
, fue considerado originalmente como un pseudogen. En 2013, He et al expuesto que el gen codifica una proteína que muestra similitudes con altos Beclin 1 en la secuencia de aminoácidos y estructuras de dominio, y el nombre de la nueva proteína Beclin 2 [13]. Se encontró que esta nueva proteína identificada para ser funcionado en la autofagia, la degradación endolysosomal, y el metabolismo. También interactúa con varias parejas de unión de Beclin 1, incluyendo ATG14, AMBRA1, Vps34, y Bcl-2. Estos datos sugieren su papel en la regulación de la autofagia [13].
La asociación de Beclin 2 y el cáncer no se ha abordado, y nunca se ha estudiado la relación entre Beclin 2 y 1 Beclin expresión y los resultados de los pacientes con cáncer . En este estudio, se determinó la expresión de Beclin 1 y 2 Beclin en los tejidos de cáncer oral, y examinamos las asociaciones entre las expresiones de Beclin 1 y 2, Beclin características clínico, y las tasas de supervivencia. También se revisaron los efectos de la alteración de las proteínas beclin sobre la proliferación y la autofagia de células cancerosas.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de tejido
Este estudio retrospectivo fue aprobado por el Institutional Junta de revisión de Martin de Porres hospital St. (la ciudad de Chiayi, Taiwán) y Chang Gung Memorial hospital de Chiayi Branch (Chiayi County, Taiwan). La información del paciente se convierte en anónima y se identificó de-antes del análisis. , muestras de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina de pacientes con cáncer que reciben orales resección quirúrgica se obtuvieron de los archivos del hospital St. Martin De Porres entre enero de 2003 y diciembre de 2008. Todos los casos fueron diagnosticados en primer lugar, confirmado histológicamente carcinoma de células escamosas. Los pacientes que recibieron terapia neoadyuvante preoperatoria o tenían un tamaño de tumor de menos de 5 mm fueron excluidos de este estudio. La información clínica, incluyendo los de edad, el sexo, el tamaño del tumor, los ganglios linfáticos, metástasis, y los datos de seguimiento, se obtuvo de los registros médicos. El estadio del tumor-nódulo-metástasis (TNM) se define de acuerdo a la séptima edición del American Joint Committee on sistema de estadificación del cáncer [14]. La supervivencia global (OS) se define como el tiempo entre la cirugía y la muerte de todas las causas. la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) se define como el tiempo entre la cirugía y la muerte causada por el cáncer oral. La supervivencia libre de recurrencia (RFS) se define como el tiempo entre la cirugía y la primera recurrencia local o sistémica.
Inicialmente se incluyeron un total de 198 casos de cáncer oral. Se excluyeron tres casos que muestran tejido limitado o nulo en las secciones de microarrays de tejidos. El estudio finalmente consistió en 195 casos de tinciones de inmunohistoquímica y análisis estadístico.
El examen patológico
La hematoxilina y eosina diapositivas de cada caso fueron re-evaluados por un patólogo para confirmar el tipo histológico , grado, estado de la necrosis y la invasión linfovascular. El grado histológico fue clasificado como de grado 1 (bien diferenciadas), grado 2 (moderadamente diferenciado), y grado 3 (pobremente diferenciado). Los casos con áreas necróticas que constituyen más de 10% de las áreas tumorales fueron considerados como "extensa necrosis", y los otros casos se registraron como "poca o ninguna necrosis." Invasión linfovascular se definió como la presencia de células cancerosas dentro de los canales linfovascular.
construcción de microarrays de tejidos
construcción de microarrays de tejidos se realizó tal como se describe anteriormente [15]. En resumen, un patólogo analizó la hematoxilina y eosina diapositivas y, a continuación, marcó las áreas representativas para el muestreo en las diapositivas y los correspondientes bloques de tejido. La selección de muestras de núcleo a partir de bloques de tejido incluye dos núcleos de 1,5 mm de diámetro para cada caso de cáncer de los tejidos, y un núcleo de 1,5 mm de diámetro para cada caso de las mucosas orales normales. Los núcleos seleccionados se perforaron y se transfieren a los bloques de parafina-receptores. Consecutivos secciones de 4 micras de espesor fueron producidos, y hematoxilina y eosina tinción se realizó en cada bloque receptor para confirmar la presencia de las zonas seleccionadas.
La inmunohistoquímica
Se realizaron manchas de inmunohistoquímica en el 4 -μm de espesor secciones de los microarrays de tejidos por el sistema de tinción automática Leica Bond-Max (Leica Microsystems, Bondbiotech, Taichung, Taiwan) según las instrucciones del fabricante con modificaciones menores. Las secciones se deparaffinized por Bond Solución desparafinar (Leica Microsystems) y rehidratada clasificado por el alcohol. la recuperación de antígeno inducida por calor se logró por Bond solución de recuperación del epítopo 1 (Leica Microsystems) durante 20 minutos a 100 ° C. Los portaobjetos se incubaron en peróxido de hidrógeno durante 5 minutos para reducir la actividad peroxidasa endógena. Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos monoclonales de ratón contra Beclin 1 (1: 400, policlonal de conejo, Abcam, Cambridge, Reino Unido) y beclin 2 (1: 400, policlonal de conejo, productos biológicos Novus, Littleton, CO, ESTADOS UNIDOS). Un reactivo de post-primaria enlazador IgG se aplicó durante 8 minutos, y los portaobjetos se incubaron con un reactivo de IgG peroxidasa de rábano picante polimérica durante 8 minutos para localizar el anticuerpo primario. tetrahidrocloruro de diaminobencidina (DAB) se utilizó como sustrato para detectar la unión antígeno-anticuerpo. Por último, se aplicó hematoxilina durante 5 minutos para contrateñir los núcleos.
Evaluación de la inmunohistoquímica
La intensidad, porcentaje, y la localización subcelular de la tinción inmunohistoquímica de cada caso se registraron. tejido amigdalino normal se utilizó como control positivo. La tinción omitiendo el anticuerpo primario se realizó como control negativo. Citoplasmática y nuclear expresiones se evaluaron por separado. La intensidad y el porcentaje de células teñidas positivamente en cada núcleo se escanearon en un campo de baja potencia (100 X) y luego se evaluaron en campos de alta potencia (400 X). La intensidad de la tinción se registró como 0, 1, 2, y 3 se refiere a la tinción negativa, débil, moderada y fuerte, respectivamente. El porcentaje de células positivas se registró a partir de 0% a 100%. Los resultados de la tinción fue evaluado utilizando puntuación rápida (Q), que se obtiene multiplicando el porcentaje de células positivas (P) por la intensidad (I) (Q = P × I; máximo = 300) [16]. Dos patólogos evaluaron de forma independiente los resultados de la tinción inmunohistoquímica y sin conocimiento de los datos clínico-patológicas. Los resultados contradictorios se resolvieron mediante un microscopio multicabezal.
selección del punto de corte para inmunohistoquímica
Para las expresiones citoplasmáticos de Beclin 1 y 2 Beclin, los puntos de corte óptimos de las puntuaciones de Q se determinaron por X-Tile software 3.6.1, tal como se describe anteriormente [17]. El programa calcula los valores de chi-cuadrado en todas las divisiones posibles en base a la prueba de log-rank para las estimaciones de Kaplan-Meier. Para la expresión citoplasmática de Beclin 1, un punto óptimo con el valor más alto fue determinado. El punto de corte de las puntuaciones más altas Q con los valores de chi-cuadrado fueron 55, 110, y 25 para el sistema operativo, el DSS, y RFS, respectivamente. Se seleccionaron 63 como punto de corte Q para Beclin 1 de expresión citoplasmática. Para la expresión citoplasmática de Beclin 2, los valores de chi-cuadrado determinado por 2 puntos de corte óptimos fueron mayores que los determinados por 1 punto óptimo. De este modo se seleccionaron 2 puntos de corte para clasificar su expresión en 3 grupos: bajo, moderado y alto. Los puntos de corte de la puntuación Q con los más altos valores de chi-cuadrado (35, 125), (35, 145), y (25, 85) para el sistema operativo, el DSS, y RFS, respectivamente. Seleccionamos (32, 118) como punto de corte Q anota para Beclin 2 expresión citoplasmática.
Sólo una minoría de los casos mostraron expresión nuclear de Beclin 1 o Beclin 2. Por lo tanto, los casos con más de 10% de las áreas tinción nuclear fueron clasificados como positivos; los otros fueron clasificadas como negativas.
Los cultivos de células y reactivos
La línea escamosas oral humana de células de carcinoma de células SAS, establecida a partir de un carcinoma de células escamosas pobremente diferenciado de la lengua, se cultivó en 10% FBS suplementado DMEM. Los plásmidos que expresan la bandera de etiquetado Beclin 1 y 2 Beclin se obtuvieron de Addgene y un regalo del laboratorio de Levine, respectivamente. Para generar un vector lentiviral que expresa Beclin 2, el fragmento de PCR de la bandera de etiquetado
beclin 2
fue clonado en pLX301 vector lentiviral (Addgene). Los lentivirus se generaron por cotransfección de células HEK293 con plásmidos pLX301-Beclin 2, pCMVDR8.2 y pMD.G por lipofectamina 2000. Los lentivirus liberados al medio de cultivo se recogieron a las 48 hy 72 h después de la transfección. SAS células que sobreexpresan de forma estable Beclin 2 se establecieron mediante la infección de lentivirus expresar Beclin
2 Opiniones y puromicina selección. Bafilomycin, un inhibidor de la autofagia prevención de fusión entre autofagosomas y lisosomas, fue la compra de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.).
siRNA desmontables
pequeños ARN de doble cadena de interferencia (siRNA) contra el
ATG5
y
beclin 2
eran compra de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) y Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.), respectivamente. SAS células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se transfectaron con 100 pmol de siRNA por RNAiMax (Invitrogen) en el día siguiente.
El análisis por inmunotransferencia
Las células se lisaron en PBS que contenía 1% de Triton X -100 y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich). Los lisados se centrifugaron a 12,000x g a 4 ° C durante 15 min. Las proteínas en el lisado se separaron por SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno y detectado por inmunotransferencia. Anti-Flag y anti-Atg
5
fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. Anti-LC3 se obtuvo de NanoTool (Teningen, Alemania). Anti-Beclin 1 y anti-Beclin 2 fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología y Novus Productos Biológicos, respectivamente. Anti-p62 fue adquirido de Abcam.
inmunofluorescencia tinción
Las células fueron fijadas en 4% de paraformaldehído, y se procesa para la tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos primarios contra la anti-Flag (M2) y la incubación con por fluorescencia anticuerpo secundario marcado (Invitrogen). Por último, se observaron las células y las imágenes fueron capturadas bajo microscopio de fluorescencia Leica SP5.
ensayo clonogénico
SAS células transfectadas con plásmidos o siRNA se sembraron a alrededor de 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos y cultivaron durante 10 días. Las células se lavaron con PBS y se tiñeron con 1% de cristal violeta en metanol durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavar el tinte, se contaron las colonias.
El análisis estadístico
Las pruebas de chi-cuadrado se utilizaron para evaluar la asociación de la expresión de las proteínas beclin y características clínico-patológicas. Las correlaciones de las puntuaciones de Q se evaluaron mediante pruebas de correlación de Spearman, y los coeficientes rho de Spearman fueron ilustrados como mapa de calor. Las curvas para OS, DSS, y RFS se extrajeron utilizando el método de Kaplan-Meier, y las diferencias en las tasas de supervivencia se compararon mediante el log-rank pruebas. Los modelos de regresión proporcional de Cox univariante y multivariante fueron utilizados para estimar las razones de riesgo y los intervalos de confianza del 95% para los resultados de los pacientes. Todos los
P
valores fueron de 2 caras. Un
P valor
menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los números de colonias en ensayos por clonación han estado representados proporciones de errores de control de +/- estándar. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 19.0 (SPSS, Inc., Armonk, Nueva York, EE.UU.) y Excel 2013 (Microsoft Excel, Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.) para Windows.
Resultados
aberrante beclin 1 y 2 beclin expresiones en tejidos de cáncer orales
Para evaluar beclin 1 y 2 beclin expresiones y su localización subcelular, se realizó inmunohistoquímica en 195 casos de cáncer de los tejidos orales y las mucosas orales normales. Beclin 1 y 2 beclin expresiones se encuentran principalmente en el citoplasma, y de vez en cuando en los núcleos. Las mucosas orales normales mostraron débil a moderada expresión citoplasmática y nuclear de expresión focal de Beclin 1 y 2 Beclin (figura 1A y 1E). Los tejidos de cáncer oral mostraron expresiones citoplasmáticos variables de Beclin 1 y 2 Beclin, que van desde la pérdida total de difundir la expresión fuerte (figura 1B-1D y 1F-1H). Las puntuaciones medias de Q Beclin citoplasmática 1 y 2 Beclin fueron 67.46 ± 55.19 y 75.26 ± 62.16, respectivamente. Los puntos de corte para Beclin 1 y 2 Beclin se describe en Materiales y métodos. Para Beclin citoplasmática 1, 111 casos (56.92%) fueron clasificados como de baja expresión, y 84 casos (43,08%) fueron clasificados como de alta expresión. Para citoplasmática Beclin 2, 65 pacientes (33,33%) fueron clasificados como de baja expresión; 83 pacientes (42.56%) fueron clasificados como una expresión moderada; 47 pacientes (24.10%) fueron clasificados como de alta expresión. Sólo un pequeño subconjunto de los tejidos de cáncer oral expresa tinción nuclear de Beclin 1 (33/195, 16,92%) y Beclin 2 (29/195, 14,87%) (Figura 1C, 1D y 1I).
(A ) débil a moderada expresión citoplasmática y nuclear de Beclin 1 en la mucosa oral normal escamosas. (B) Bajo la expresión citoplasmática de Beclin 1 en un tejido de cáncer oral. (C) de alta citoplasmática y nuclear de la expresión positiva de Beclin 1 en un tejido de cáncer oral. (D) bajo la expresión nuclear citoplasmática y positiva de Beclin 1 en un tejido de cáncer oral. (E) débil a moderada expresión citoplasmática de Beclin 2 en la mucosa oral normal escamosas. (F) bajo la expresión citoplasmática de Beclin 2 en un tejido de cáncer oral. (G) Moderado expresión citoplasmática de Beclin 2 en un tejido de cáncer oral. (H) de alta expresión citoplasmática de Beclin 2 en un tejido de cáncer oral. (I) citoplasmática moderada y la expresión positiva nuclear de Beclin 2 en un tejido de cáncer oral.
Asociaciones de Beclin 1 y 2 Beclin expresiones con las características clínico-patológicas y el marcador autophagosomal en tejidos de cáncer oral
Se comparó beclin 1 y 2 beclin expresiones con la edad, el sexo, el tamaño del tumor, los ganglios linfáticos, metástasis, estadio, grado, invasión linfovascular, y necrosis (Tabla 1). Beclin 1 de expresión no estaba relacionado con las características clínico-patológicas. Bajo la expresión citoplasmática de Beclin 2 se asoció con un mayor grado histológico (un factor de mal pronóstico) en comparación con las expresiones moderadas y altas. expresión nuclear positiva de Beclin 2 se conecta a factores de mal pronóstico, incluyendo metástasis en los ganglios linfáticos y la invasión linfovascular.
Las expresiones nucleares y citoplásmicos de Beclin 1 mostraron una correlación débil (rho de Spearman = 0,287,
P Hotel & lt; 0,001). Las expresiones nucleares y citoplásmicos de Beclin 2 también se correlacionaron débilmente (rho de Spearman = 0,212,
P
= 0,003). La expresión citoplasmática de Beclin 1 y 2 no se relacionó Beclin (rho de Spearman = -0,072,
P = 0,318
). Las relaciones de las proteínas beclin y el marcador autophagosomal, LC3B, también se evaluaron. Los autofagosomas representados por LC3B punctae fueron evaluados en nuestro estudio anterior [18]. Sólo citoplasmática Beclin 1 correlacionada con el nivel de LC3B punctae (rho de Spearman = 0,305,
P Hotel & lt; 0,001) (Fig. 2)
Escala de colores para el coeficiente rho de Spearman se da en la parte baja derecha, con lo que representa una correlación negativa verde y rojo positivo. *
P Hotel & lt; 0.05.
distintos patrones de expresión de proteínas beclin se asocian con mal pronóstico
Las curvas de Kaplan-Meier de OS acumulada, se muestran las probabilidades DSS, y RFS para Beclin 1 y 2 Beclin en la Figura 3. los pacientes con alta citoplasmática Beclin 1 de expresión mostraron baja DSS (
P
= 0,008), y los que tienen 1 Beclin expresión nuclear negativo mostraron altos RFS (
P = 0,036
). Los pacientes con expresión alta o baja citoplasmática Beclin 2 tenían OS significativamente más bajos y las tasas de DSS en comparación con los pacientes con moderada expresión citoplasmática Beclin 2. Las probabilidades de supervivencia entre los pacientes con manifestaciones frente al citoplasma de baja y alta no fueron estadísticamente significativas. El Beclin 2 expresión nuclear era no asociado con el estado de supervivencia.
Los resultados de supervivencia univariado y multivariado de regresión utilizando los métodos de riesgos proporcionales de Cox se muestran en las Tablas 2, 3 y 4. La alta citoplasmática Beclin 1 y negativo de Beclin nuclear 1 se asociaron con un mal DSS y RFS bajo univariante y multivariante, respectivamente. Además, citoplasmática Beclin 2 de expresión es un factor pronóstico independiente para el sistema operativo y DSS. citoplásmicos Beclin 2 expresiones bajas y altas se asociaron con resultados clínicos agresivos.
De cualquier Beclin 1 o 2 Beclin sobreexpresión induce la autofagia y promueve el crecimiento de células de cáncer oral,
para investigar los efectos de Beclin 1 y 2 Beclin sobreexpresión en cáncer oral, se utilizaron células SAS transfectadas con plásmido que expresa la bandera de etiquetado Beclin 1 y 2 Beclin, respectivamente. La sobreexpresión de Beclin 1 o 2 Beclin llevó a aumentar de la conversión de LC3-I a LC3-II en condiciones normales. Sin embargo, este fenómeno fue inevident bajo condiciones de inanición (Fig 4A). La relación de LC3-II /LC3-I y nivel de p62 se incrementó tanto en las células que sobreexpresan Beclin 1 o 2 Beclin comparación con el control después del tratamiento bafilomicina de inanición (S1 figura). Estos resultados confirman el papel de Beclin 2 en la vía de la autofagia.
células (A) SAS se transfectaron con el plásmido control, plásmidos que expresan la bandera de etiquetado Beclin 1 (B1) o Beclin 2 (B2). A las 24 h después de la transfección, las células se trataron con solución salina equilibrada de Earle (EBSS) durante 1 h inanición. El lisado se prepararon y analizaron por inmunotransferencia usando los anticuerpos indicados. La intensidad de LC3-I y LC3-II se midió usando ImageJ y la relación de LC3-II /LC3-I se muestran a continuación. células (B) HEK293 que expresan de forma estable GFP-LC3 se transfectaron con el plásmido que expresa la bandera de etiquetado Beclin 1 o 2 Beclin y se cultivaron en medio normal, ya sea de cultivo (DMEM) o condición inanición (EBSS) como se indica. Las células se fijaron a las 48 h después de la transfección. la tinción de inmunofluorescencia indirecta se realizó usando anticuerpos anti-Flag M2. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) tinción reveló el núcleo. La región cuadro se agranda (a). células (C) SAS fueron transfectadas con el control o la bandera de etiquetado Beclin 1 y 2 Beclin durante 24 h. Las células transfectadas se volvieron a sembrar en 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 14 días, las colonias se visualizaron utilizando 1% de cristal violeta en metanol. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces de forma independiente.
Para evaluar la localización subcelular de las proteínas beclin, las células HEK293 se transfectaron con el plásmido que expresa la bandera de etiquetado Beclin 1 y 2 Beclin, respectivamente. En condiciones normales, el número de puntos lagrimales GFP-LC3 era baja, y Beclin 1 y Beclin 2 se localiza principalmente en el citoplasma (Fig 4B, panel izquierdo). Después de la inducción de la autofagia por el hambre de nutrientes y el tratamiento bafilomicina, las células mostraron una mayor punctae LC3; Beclin 1 y 2 mostraron beclin colocalización parcial con LC3 punctae (Figura 4B, panel derecho). Además, se observó que LC3 punctae se ampliaron en Beclin 2 células en comparación con el control y Beclin 1 células que sobreexpresan sobreexpresan. Además, las células ya sea con Beclin 1 o 2 Beclin sobreexpresión llevaron a una mayor capacidad de supervivencia clonogénico compara con las células control transfectadas (Fig 4C). Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de Beclin 1 o 2 Beclin activa autofagia y promueve el crecimiento de células de cáncer, y los efectos de la sobreexpresión de Beclin 1 y Beclin 2 eran independientes unos de otros.
Beclin 2 agotamiento perjudica la autofagia y promueve orales crecimiento de células cancerosas
Para inspeccionar el efecto de beclin 2 agotamiento y su relación con la autofagia en el cáncer oral, transfectadas siRNAs dirigidos ya sea
beclin 2
o
ATG5 Hoteles en células SAS . Debido a que el nivel endógeno Beclin 2 era baja en las células SAS, la eficiencia de
beclin 2
desmontables de siRNA se determinó primero en las células expresadas de manera estable la bandera de etiquetado Beclin 2. Las células que expresan establemente Beclin 2 mostraron mayor proporción de LC3- II /LC3-I (Fig 5A, panel izquierdo). Después de la transfección de siRNA dirigidos a
beclin 2
o
ATG5
, expresión de Beclin 2 o ATG5 se redujo significativamente, y las proporciones de LC3-II /LC3-I se redujeron al mismo tiempo (figura 5A, a la derecha panel). Aunque la endógeno Beclin 2 fue incapaz de detectar después de la transfección de siRNA dirigidos
beclin 2
, la Beclin 1 y los niveles de ATG5 no se vieron afectados, y la relación de LC3-II /LC3-I se redujeron (figura 5B). Estos datos implican que Beclin 2 agotamiento causa un deterioro autofagia. Las células con cualquiera Beclin 2 o ATG5 agotamiento mostraron capacidad de supervivencia clonogénico comparación con las células tratadas con ARNsi de control (figura 5C). Estos hallazgos sugieren Beclin 2 agotamiento afecta parte de la actividad de la autofagia, y promueve el crecimiento de células de cáncer.
Las células o células SAS (A) de forma estable que expresan la bandera de etiquetado Beclin 2 o (B) células SAS transfectadas con ARNsi de control ( scr), ATG5 siRNA (siAtg5) o Berlín 2 siRNA (Sib2). lisado de células se prepararon después de 48 h de la transfección y se analizaron por inmunotransferencia usando los anticuerpos indicados. las células (C) SAS fueron transfectadas con ARNsi de control (SCR), ATG5 siRNA (siAtg5) o Berlin 2 siRNA (SIB2) durante 24 h. Las células transfectadas se volvieron a sembrar en 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 14 días, las colonias se visualizaron utilizando 1% de cristal violeta en metanol. Los experimentos se llevaron a cabo tres veces de forma independiente.
Discusión
La familia ha Beclin 2 miembros identificados, beclin 1 y beclin 2. El papel pronóstico de Beclin 1 ha sido ampliamente estudiado en diversos tipos de cánceres humanos, y los resultados de los pacientes determinados por citoplasmática Beclin 1 expresión pueden ser específicos para el tipo de cáncer. Por ejemplo, una baja expresión de Beclin 1 asocia con un mal pronóstico en el cáncer de mama [19, 20], el cáncer de ovario [21], el cáncer de pulmón [22], el carcinoma hepatocelular [23], colangiocarcinoma [24], el cáncer de páncreas [25], cáncer de la hipofaringe [26], cáncer de laringe [27], cáncer de esófago [28], cáncer duodenal [29], cáncer gástrico [30], linfomas [31-33], etc. La expresión alta de Beclin 1 conectado a la agresividad del tumor en la nasofaringe carcinoma [34], cáncer de endometrio [35], y el cáncer de colon [36]. Las investigaciones de Beclin 1 en tejidos de cáncer oral mostraron que la alta expresión se relaciona con factores de mal pronóstico y /o los resultados clínicos agresivos [37, 38]. Nuestro estudio fue consistente con investigaciones previas, y nos reveló además que la sobreexpresión de Beclin 1 en el crecimiento tumoral inducido por SAS en el ensayo clonogénico, lo que demuestra su papel de la progresión tumoral en el cáncer oral.
En este estudio, se evaluó la primera expresión y papel pronóstico de Beclin 2 en el cáncer humano. Nos reveló que los pacientes con cáncer oral con alta o baja expresión de Beclin 2 mostraron peor pronóstico que aquellos con una expresión moderada. La expresión de Beclin 2 era independiente de la etapa del cáncer (Tabla 1). Ya sea alta o baja Beclin 2 de expresión en tejidos de cáncer sugiere una disfunción en la autofagia y el metabolismo. Beclin 2 análisis funcionales mostraron más bien su agotamiento o sobreexpresión promueven el crecimiento tumoral en las células de cáncer oral, SAS. Estos resultados implican Beclin 2 está asociada con la tumorigénesis en el cáncer oral. La manipulación de la expresión génica de
1 | beclin no afectó a la proteína Beclin 2, y viceversa. Las expresiones citoplásmica de las proteínas también 2 no estaban relacionados en tejidos de cáncer oral (figura 2). Los resultados sugieren el mecanismo molecular implicado en la tumorigénesis oral de estas 2 proteínas es independiente.
autofagia se ha implicado tanto en la supresión de tumores y la progresión tumoral. La autofagia inhibe la transformación maligna de las células normales mediante el mantenimiento de la homeostasis celular, el metabolismo normal y la estabilidad genómica [39]. En tumores establecidos, la autofagia menudo promueve el crecimiento de células tumorales por el mantenimiento de metabolismo en condición de estrés [40, 41]. Sin embargo, la influencia real de la autofagia en la tumorigénesis puede ser dependiente del contexto. La autofagia puede regular el crecimiento celular de manera diferente según los tipos de tejidos y configuraciones genéticas específicas [42, 43]. Las asociaciones entre las proteínas y la autofagia beclin han sido bien documentados. proteínas beclin interactúan con los componentes de la clase III complejos phosphoinositide 3-quinasa, que se requiere para la iniciación de la autofagia [13, 44]. Beclin 1 está implicado en la formación de phagophore (el precursor de la autophagosome) a principios del paso de la autofagia, y se colocalized con LC3 punctae [45, 46]. Nuestros datos demuestran por primera vez la colocalización de Beclin 2 y LC3, confirmando que Beclin 2 está implicada en la autofagia. Aunque hemos encontrado que las manipulaciones de Beclin 1 o 2 Beclin nivel hicieron conducir a un cambio en la autofagia, sus efectos sobre el crecimiento tumoral puede no del todo directamente debido a la autofagia. Beclin 1 fue inicialmente se encontró que tienen la función supresora de tumores [5]. Paradójicamente, la alta expresión de Beclin 1 se asoció con la progresión tumoral en algunos tipos de cáncer, como se describe anterior [34-38]. pérdida alélica de la formación de tumores inhibido
beclin 1 Hoteles en ciertos genotipos de los ratones [47, 48]. Beclin 1 no sólo interacciona con los reguladores positivos y negativos de la autofagia, pero también participa en varios procesos no autofágicas [49]. Los impactos de Beclin 1 en la progresión tumoral pueden ser al menos parcialmente independiente de la autofagia. Por otra parte, nuestro estudio estableció por primera vez la conexión de Beclin 2 y la progresión tumoral. Las relaciones de Beclin 2 y la tumorigénesis pueden ser más complejos. La progresión del tumor causada por Beclin 2 sobreexpresión y el agotamiento puede ser debido a diferentes mecanismos. Nuestros datos y la literatura anterior encontró que desmontables de Beclin 2 deteriorada, pero no abolió por completo la autofagia [13]. El crecimiento del tumor causado por Beclin 2 agotamiento puede ser evocado por la autofagia y /o mecanismos de autofagia-independiente. Beclin 2 comparte varios socios que interactúan de beclin 1, y, además, requiere de la degradación de los receptores regulados por GASP1 acoplados a proteínas G (GPCR) [13]. Muchos GPCRs se sobreexpresa en los cánceres y contribuyen a la proliferación de las células del cáncer [50].