Extracto
Antecedentes y Objetivo
Durante el desarrollo de la próstata, mesenquimal interacciones -epithelial regulan el crecimiento y la diferenciación de órganos. En la próstata adulta, las interacciones estroma-epitelial son importantes para la homeostasis del tejido y también juegan un papel importante en el cáncer de próstata. En este estudio hemos identificado las moléculas que muestran un patrón de expresión mesenquimales en la próstata en desarrollo, y uno de éstos demostraron una reducción de la expresión en el estroma del cáncer de próstata.
Metodología y resultados principales
Cinco moléculas candidatas identificadas por la transcripción de perfiles de mesénquima de próstata desarrollo fueron seleccionados utilizando un wholemount en pantalla hibridación in situ y estudiado decorina (DCN), Semaphorin6D (Sema6D), SPARC /osteonectina (SPARC), Sprouty1 (Spry-1) y Tsukushi (Tsku). La expresión en tejidos de rata se evaluó usando wholemount hibridación in situ (día postnatal (P) 0.5) e inmunohistoquímica (día embrionario (E) E17.5, E19.5; P0.5; P6; 28 & amp; adulto). Cuatro candidatos (Decorin, SPARC, Spry-1, Tsukushi) se immunolocalised en la próstata fetal humano (semanas 14, 16, 19) y la expresión de la decorina se evaluó en un microarray de tejido de cáncer de próstata humano. En ratas embrionarias y perinatales Decorin, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 y Tsukushi se expresaron con diferentes patrones de distribución en todo el mesénquima en E17.5, E19.5, P0.5 y P6.5. En P28 y adultos próstatas había o una disminución en la expresión (Semaphorin6D) o un interruptor para epiteliales expresión de SPARC, y Spry-1, mientras que la decorina y Tsukushi eran específicos de mesénquima /estroma en todas las edades. La expresión de decorina, SPARC, Spry-1 y Tsukushi en próstatas fetales humanos se asemejaba a la de la rata. Decorina mostró mesenquimales del estroma y la expresión específica en todas las edades y se examinó en el cáncer de próstata, en donde la expresión del estroma se redujo significativamente en comparación con la próstata no maligno.
Conclusión y significado
Se describe la expresión espacio-temporal de decorina, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 y Tsukushi en el desarrollo de la próstata y observar los patrones de expresión mesenquimales similares en ratas y humanos. Además, decorina mostró una expresión reducida en el estroma del cáncer de próstata en comparación con el estroma de próstata no maligno
Visto:. Un Henke, Grace OC, Ashley GR, Stewart GD, Riddick ACP, Yeun H, et al. (2012) Expresión del estroma de la decorina, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1 y Tsukushi en Desarrollo de próstata y disminución de los niveles de decorina en el cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (8): e42516. doi: 10.1371 /journal.pone.0042516
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Agosto, 2011; Aceptado: 9 Julio 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Henke et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación médica (WBSe 1276.00.003.00004.01) y la caridad del cáncer de próstata (http://www.prostate-cancer.org.uk/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
mesenquimales-epitelial interacciones, mediadas a través de la señalización célula-célula, juegan un papel crucial en la especificación de los órganos de mamíferos tales como la próstata, riñón, pulmón y glándula mamaria y también en la homeostasis del tejido de los tejidos adultos. Mesénquima es el precursor embrionario del estroma adulta. En los machos se diferencia de los de próstata y crece a partir del seno urogenital y está regulada por andrógenos testiculares. En las mujeres, el seno urogenital se desarrolla en el útero y la vagina, aunque se formará una próstata si se administran andrógenos exógenos. efectos de andrógenos están mediados a través del receptor de andrógenos (AR) y los estudios en modelos de roedores han demostrado que AR se expresa inicialmente en el mesénquima y, posteriormente, en el epitelio de la próstata en desarrollo. Tejido experimentos de recombinación utilizando mesénquima y el epitelio de cualquiera de tipo salvaje o ratones deficientes en AR revelaron que una próstata sólo puede desarrollarse cuando el mesénquima tiene un AR funcional, mientras que no se requiere AR epitelial [1] - [3]. El concepto de mesenquimales embrionarias y las células del estroma de adultos como mediadores de órgano-especificidad fue subrayada por un estudio que demostró la diversidad y la memoria de posición en los fibroblastos humanos adultos [4]. En la próstata adulto humano normal la mayoría de la compartimiento del estroma se compone de células de músculo liso y fibroblastos, mientras que el resto consiste en células endoteliales, pericitos, linfocitos y macrófagos [5].
Estudios recientes han puesto de manifiesto una papel para el compartimiento del estroma en la regulación de la progresión de células de cáncer, que está ahora en general [6] aceptada. Dentro del microambiente tumoral se han propuesto los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) como una fuente clave de mediadores pro-tumorigénicos paracrinos [7] - [9]. TGFß1 es uno de los factores secretados por los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) y puede actuar en un bucle autocrino o paracrino mediante la unión al complejo receptor TGFβRI /II en estroma y /o células epiteliales de mama y de próstata células del cáncer [10]. El potencial pro-tumorigénico de TGFß1 se muestra cuando el ablación genética de la TGFβRII en los fibroblastos dio como resultado el crecimiento de tumores reducida en un modelo de ratón [10], [11]. Otro aspecto importante del estroma actividad pro-tumorigénico es la heterogeneidad de las subpoblaciones de fibroblastos y la falta de marcadores apropiados para ellos. Varios marcadores CAF se han propuesto pero la identificación de las distintas subpoblaciones co-expresión de algunos de ellos y la contribución de estas subpoblaciones al crecimiento del tumor recientemente está surgiendo [12] - [14]
Hay una clara relación entre el desarrollo. la señalización y la enfermedad. En el modelo de rata Dunning de cáncer de próstata, la inclusión de mesénquima embrionario redujo el crecimiento del tumor, lo que subraya el poder instructivo de células mesenquimales en las células malignas [15]. Además, la hipótesis de McNeal sugiere que las vías de desarrollo se vuelven a activarse en la enfermedad prostática [16].
Por lo tanto, la identificación de mesenquimales del estroma /mediadores de la comunicación mesenquimal-epitelial es de suma importancia para la comprensión del desarrollo y la enfermedad de un organo. Secretada o proteínas unidas a membrana parecen ser los más probables mediadores de la señalización paracrina del estroma /epitelio.
En un estudio previo de nuestro grupo, análisis en serie de la expresión génica (SAGE) del mesénquima del tracto urogenital rata neonatal identificado 219 putativo transcripciones '' mesenquimales que se expresan en niveles más altos en el mesénquima que el tejido epitelial adyacente. Esta lista podría contener los candidatos a mediadores paracrinos de mesenquimal-epitelial de diálogo [17]. Dentro de los 219 candidatos transcripciones hemos identificado un subconjunto que codificaban secretada o moléculas unidas a la membrana, que son los candidatos más probables para la interacción mesenquimal-epitelial. Hasta la fecha, se han analizado y validado la expresión de algunos de estos candidatos en el desarrollo de la próstata. Hemos demostrado que la Dlk1 y Notch2 señalización era importante para la ramificación, así como la diferenciación del músculo liso epitelial y en sistemas de cultivo de órganos de próstata [18]. El EphB3 receptor y su ligando EphrinB1 también fueron detectados en el mesénquima de próstata, y el cultivo de órganos con el ligando EphrinB1-Fc resultaron en una mayor área de órganos, pero disminuyeron en ciernes con puntas de yemas agrandados, mientras que la incubación con el receptor EphB3-Fc reduce el tamaño del órgano y se redujeron en ciernes [19 ]. Pleiotrophin (Ptn) se encontró que se expresa en el desarrollo de mesénquima de próstata y que regula el crecimiento de desarrollar mesénquima, el epitelio y CAF. Además, la señalización de andrógenos aumenta Ptn expresión [20].
En su conjunto, estos estudios sugieren que una alta proporción de los candidatos identificados por nuestro perfil SAGE jugar un papel en el desarrollo de la próstata y la enfermedad. En el presente estudio, se han analizado más moléculas candidatas de nuestros estudios SAGE hechos para determinar los expresados en la rata y el desarrollo de próstata humano y en el cáncer de próstata. Nuestra razón era que la identificación de moléculas expresadas mesénquima daría una mejor comprensión de la biología del estroma. Seleccionamos secretada y las moléculas unidas a la membrana identificamos en nuestros estudios SAGE y realizó un wholemount en pantalla de hibridación in situ (desea) para definir si mostraban expresión mesenquimales.
A continuación mostramos cinco candidatos identificados por la pantalla deseo de que se confirmó que que muestra la expresión mesenquimales:
La decorina, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 | y
Tsukushi gratis (Tabla 1). Estos fueron examinados durante la rata y el desarrollo de la próstata humana mediante inmunohistoquímica.
La decorina y Tsukushi fueron los únicos candidatos con la expresión del estroma solamente y posteriormente se investigaron en los tejidos de cáncer de próstata (CaP). Decorina mostró una regulación a la baja significativa en comparación con los tejidos no malignos, mientras que la expresión Tsukushi no mostró ninguna expresión diferencial.
Resultados
Identificación y Confirmación de mesénquima Expresado Transcripciones
un estudio previo de nuestro laboratorio, análisis SAGE del mesénquima de próstata de rata identificado 219 transcripciones que se expresan en el mesénquima inductiva; éstos fueron prometedores posibles reguladores de la organogénesis. Nuestros estudios de perfiles de SAGE utilizan los esbozos próstata femenina, denominada VMP, ya que carecía de los epitelios y nuestro objetivo fue identificar las transcripciones no epiteliales. Higo. 1A muestra la homología entre el mesénquima del tracto urogenital femenino y masculino (UGT) en P0.5, y las subregiones importantes del mesénquima se han coloreado en verde. Estos estudios SAGE transcripciones identificadas probable que se expresa en el mesénquima [17]. Aquí, nos centramos en las moléculas secretadas o unidas a la membrana dentro de la lista 219 transcrito como los candidatos más lógicos para la señalización-mesenquimal a epitelial. Para definir cuáles de nuestras moléculas candidatas mostraron patrones de expresión específicos mesenquimales /estroma, se realizó una pequeña pantalla de deseos. Cinco candidatos
La decorina, Semaphorin6D, SPARC, Spry-1 | y
Tsukushi
fueron confirmados como mesénquima-expresados en esta pantalla y elegido para una mayor investigación (Figura 1B, Tabla 1). Higo. 1B ilustra el número de transcripciones (identificados mediante "tags" del extremo 3 'del ARNm), normalizados por millón de etiquetas para tener en cuenta diferentes etiqueta cuenta entre las bibliotecas), lo que dio una aproximación del nivel de expresión del transcrito. A partir de nuestra lista de cinco candidatos,
La decorina
y
SPARC
fueron las transcripciones más altamente expresado, y después
Sema6D, Spry-1 | y
Tsku
. Los niveles de transcripción se midieron en dos bibliotecas diferentes (VMP y VSU) y la relación entre estos dieron una indicación de la probabilidad de la localización para el mesénquima VMP, como el VMP es un subconjunto de la VSU [17]. Moléculas expresadas de forma ubicua dio proporciones más cercano a 1, mientras que los que muestran el enriquecimiento VMP tenía proporciones de 1.4 o mayor.
A) Esquema general de la anatomía UGT de ratas en la etapa perinatal (P0.5) para el macho (arriba) y hembra (abajo). El área sombreada verde corresponde a mesénquima inductivo, que se encuentra en ambos, macho y UGTs femeninos. El mesénquima VMP femenina se utilizó para estudios de perfiles de genes SAGE, y nuestra pantalla de WISH objetivo de identificar esas transcripciones se expresan en el mesénquima de la próstata masculina. Figura basado en Thomson, 2001 [46]. B) Transcripción niveles de expresión de
La decorina, Sema6D, SPARC, Spry-1 | y
Tsku
ha obtenido a través de SAGE perfiles de rata hembra P0.5 VMP [17]. Las transcripciones fueron identificados a través de secuencias denominadas etiquetas cortas, transcripción específicos y su recuento refleja el nivel de expresión del transcrito. La relación entre VMP y VSU etiqueta cuenta representa la probabilidad de restricción para el mesénquima inductiva; Los valores iguales o más de 1,4-mesénquima sugirieron expresión específica. C) La detección de
La decorina, Sema6D, SPARC, Spry-1 | y
Tsku
distribución de ARNm mediante hibridación in situ en P0.5 UGT de ratas macho. Los pequeños recuadros muestran UGT tratados con las sondas de ARN de sentido negativo de control, barra de escala es 1 mm Abreviaturas: AP próstata anterior, DP próstata dorsal, DLP próstata dorsolateral, el vicepresidente de la próstata ventral, VMP almohadilla mesenquimal ventral, VSU; PMV + músculo liso + urotelio, SV vesícula seminal.
A continuación, se realizaron deseo en ratas neonatales urogenital (UGT) para determinar la expresión de los ARNm que codifican las cinco moléculas candidatas (Fig. 1C).
La decorina
y
SPARC
transcripciones mostraron un patrón de expresión altamente restringido en el mesénquima de la próstata (todos los lóbulos), mientras que
Sema6D
,
Sprouty1
y
Tsukushi
se expresaron en mesénquima próstata, así como mesénquima uretral. En general, distinta expresión era visible en mesénquima adyacente a los conductos epiteliales y /o la más amplia mesénquima epitelio que rodea en la próstata ventral (VP), la próstata dorsal (DP) y la próstata dorsolateral (DLP).
La decorina
mostró el patrón de expresión más restringido en el mesénquima de próstata (Fig. 1C) y era claramente visible en el mesénquima adyacente a brotes epiteliales, y estuvo ausente de mesénquima no prostática, como el mesénquima de la uretra.
immunolocalisation de decorina en desarrollo de rata prostática mesénquima
a continuación examinó la distribución de la proteína decorina para determinar si mostró una distribución similar a la del ARNm, y si también se restringió al mesénquima. En E17.5 Decorin se expresó en un subconjunto de la mesénquima UGT (Fig 2A.); la vejiga y adyacente a la prospectivo VP (Fig. 2B), la expresión estaba restringida a las células individuales con expresión débil en el citoplasma y una fuerte señal en la superficie celular. En E19.5 decorina mostró una fuerte expresión en el mesénquima de próstata y más débil tinción alrededor de la vejiga con los "puntos calientes" (Fig. 2D). Sin embargo, el VP prospectivo y DP también mostraron expresión Decorin pero no tan fuerte que el de la periuretral mesénquima (Fig. 2D, E). Neonatales P0.5 y P6.5 UGTs mostraron tinción similar con la expresión mesénquima de sólo y una ausencia completa tanto en la uretra y el epitelio de la próstata (Fig. 2F-I). Curiosamente, este patrón de expresión diferente del patrón de WISH, donde decorina se encuentra exclusivamente en el mesénquima dentro de lóbulos prostáticos pero no el área peri-uretral, y puede reflejar la secreción y la difusión de la proteína decorina. Al día 28, la expresión de la decorina se encuentra en el estroma circundante conductos prostáticos, y estaba ausente de los epitelios (Fig. 2J, K). En la edad adulta el vicepresidente era morfológicamente totalmente diferenciadas, que contiene los epitelios decorina-negativo, y el estroma decorina-positivo (Fig. 2L, M). En resumen, decorina mostró mesénquima y la expresión del estroma específica en todas las etapas de desarrollo investigados y una ausencia total en el epitelio. Además, se localiza principalmente en el intersticio acelular.
Etapas de desarrollo de E17.5 (CA), E19.5 (D, E), P0.5 (F, G), H (P6.5 , I), P28 (J, K) y adultos jóvenes (L, M) fueron investigados. En las etapas de desarrollo E17.5, E19.5 los aumentos muestran las áreas de potencial VP, mientras que al P0.5 y P6.5 el vicepresidente o DP se muestran. La decorina estaba ausente en el epitelio y el compartimiento de músculo liso, pero presente en el mesénquima /estroma. La expresión era especialmente fuerte en mesénquima adyacente a la uretra y el epitelio de la próstata, como se indica por puntas de flecha negras y flechas. Notablemente, Decorin apareció para co-localizar con fibras estructurales en la matriz extracelular, indicados por puntas de flecha blanca en I y M. Leyenda: vejiga B, de los vasos sanguíneos BV, C capilares, DP próstata dorsal, E epitelio, M mesénquima, L lumen conductos prostáticos, S estroma, SM músculo liso, T uretra, próstata ventral VP. Barras de escala: 200 micras de A, D, F, H y L, 400 micras de J, y 50 micras de todos los demás. Tenga en cuenta que el panel H se ha ajustado el tamaño - incluyendo la barra de escala - y no está en el mismo aumento que los paneles A, D y F.
immunolocalisation de Tsku en Desarrollo de rata prostática mesénquima
expresión Tsku en E17.5 y E19.5 se limita a mesénquima y el músculo liso, y mostró una localización citoplasmática en el VP y DP (Fig. 3A, B). En P0.5 y P6.5, Tsku estaba ausente en el epitelio, pero presente en el músculo liso y el mesénquima que rodea los conductos epiteliales en la VP y DP (Fig. 3 C, D). El
Tsku
ARNm y proteínas mostraron patrones de distribución similares.
Etapas de desarrollo de E17.5 (A), E19.5 (B), P0.5 (C), P6.5 ( D), se investigaron P28 (e) y el joven adulto VP (F). En las etapas de desarrollo E17.5, E19.5 los aumentos muestran las áreas de potencial VP, mientras que al P0.5 y P6.5 o bien es el vicepresidente o el DP. expresión de la proteína fue Tsku mesenquimales /estroma sólo hasta P28 (flechas). Sin embargo, en VP de adultos, hubo una baja expresión adicional en el epitelio (punta de flecha en F). Curiosamente, las células del músculo liso también fueron positivos para Tsku (P0.5 a P28). Las barras de escala son iguales a 200 micras.
En el día 28, el epitelio carecía Tsku y expresión del estroma fue menos intensa (Fig. 3 E). El VP adulto completamente diferenciada mostró una disminución adicional de la tinción en comparación con P28. Además, Tsku se observó en las células epiteliales (Fig. 3 F).
inmunolocalización de Semaphorin6D, SPARC y Spry-1 en el desarrollo de la rata prostática mesénquima
Semaphorin6D se expresó en el mesénquima, incluyendo el VP esbozos, en E17.5 a E19.5 (complementario Fig. S1 a, B), VP perinatal y lóbulos DP, y al P6.5 UGT, pero estuvo ausente en el epitelio (Fig. S1 C, D). Sorprendentemente, la inmunotinción se limita a los núcleos aunque semaforinas se reportan normalmente a ser localizados en la membrana plasmática. Sin embargo, el patrón del deseo y la detección de proteínas fueron consistentes en P0.5 UGT. Sin embargo, en VP adulto completamente diferenciada, sólo se encontraron los leucocitos para expresar Semaphorin6D (Fig. S1F). En resumen, la expresión Semaphorin6D era más fuerte y más coherente en el mesénquima de E17.5 a P0.5 UGT con la localización nuclear.
La inmunotinción de SPARC no era detectable en E17.5 E19.5 o viejos UGT ( datos no mostrados). mesenquimales expresión débil en el VP y DP se observó a P0.5 y estuvo ausente en el epitelio (Fig. S2A). SPARC se expresa en el mesénquima que rodea las yemas epiteliales en tanto P0.5 y P6.5 pero su tinción fue más frecuente e intensa en la última etapa. En contraste, no hubo expresión detectable SPARC epitelial (Fig. S2B). Las pautas de
Detección SPARC
a través del deseo y la inmunohistoquímica (IHC) fueron consistentes en P0.5 UGT.
A P28 y adultos, la expresión de SPARC fue muy baja en el estroma al P28 (Fig. S2C) y ausente en VP adulto (Fig. S2D). Sin embargo, hubo una fuerte expresión en un subconjunto de células luminales epiteliales, localizada en los núcleos. En resumen, aunque ausentes en las etapas embrionarias y fetales, SPARC se expresa en el mesénquima durante el período de ramificación, pero hay una inversión estromal-epitelial de expresión durante la formación y el mantenimiento de la próstata adulta con fuerte expresión en algunas células epiteliales pero no el estroma .
rata se detectó la proteína Spry-1 en el mesénquima en el desarrollo de VP en E17.5 y E19.5 UGT (Fig. S3 a, B). En la etapa P0.5 perinatal (Fig. S3C), la detección Spry-1 fue más fuerte en el mesénquima adyacente a los conductos epiteliales y menos intensa en las células mesenquimales entre conductos, y se localiza adyacente al núcleo en lugar de ser distribuida en el citoplasma (Fig. S3F). Los patrones para la detección de Spry-1 a través de WISH y IHC fueron comparables en P0.5 UGT (Fig. S3C).
No hubo detección débil de Spry-1 dentro de los conductos epiteliales prostáticas en P0.5 y fue más pronunciado en P6.5, mientras mesenquimales Spry-1 de expresión se mantuvo inalterada (Fig. S3D). Por el contrario, lóbulos prostáticos en el día 28 y para adultos VP mostraron una reversión de Spry-1 de expresión en comparación con P0.5 UGT. En el estado diferenciado, la expresión fue mínima en las células estromales, pero fuerte en el epitelio, en el que Spry-1 se distribuye por todo el citoplasma de las células basales y luminales (Fig. S3E, F).
La distribución de decorina, SPARC, Spry-1 y Tsukushi en fetal humano de próstata
a continuación, se examinó la localización de la proteína de la decorina, SPARC, Spry-1 y Tsukushi en la próstata fetal humano. Una semana 14 de la próstata humana muestra en ciernes epitelial temprana, similar a la rata P0.5 etapa perinatal [21]; véase también la Fig. 4, dos filas superiores). Sin embargo, la correlación precisa de las etapas de desarrollo es difícil debido a las diferencias anatómicas, como roedores muestran emparejados y lóbulos discretos, mientras que la próstata humana es compacto sin organización lobular [21].
próstatas fetal humano en las semanas de gestación 14, 16 y 19 se muestran en los dos superiores, medias dos y dos filas inferiores, respectivamente (cada etapa de edad n = 1 tisular). Los A-S, C-U y filas E-W representan visiones generales (barra de escala = 200 um), mientras que el B-T, D-V y F-X filas muestran aumentos (barra = 50 micras escala). Cada columna muestra la tinción de una proteína a través del período de tiempo de desarrollo indicado, y recuadros muestran los controles negativos de IgG. Sólo Decorin expresión se limitaba a la mesénquima, mientras SPARC y TSKU eran también mesenquimales con un poco de expresión epitelial en wk 19. SPRY-1 mostró expresión en mesénquima y alguna expresión epitelial con la edad. Las flechas indican ejemplos de expresión mesenquimales mientras que las puntas de flecha indican la expresión epitelial. Leyenda:. Dorsal d, e epitelio, ed conducto eferente, s estroma, u uretra, v ventral
expresión de decorina en próstatas fetales humanos se limitó al compartimento mesenquimales y estaba completamente ausente en el epitelio urinario y epitelio prostático en todas las etapas de desarrollo (Fig. 4A-F). En particular, la expresión de decorina en las zonas ventrales del músculo liso fue extremadamente baja o ausente (por ejemplo, la Fig. 4C, parte inferior del panel).
No se pudo localizar Semaphorin6D en la próstata fetal humano debido a la escasa reactividad de anticuerpos a Sema6D humana (datos no presentados).
expresión SPARC mostró tinción más fuerte al aumentar la edad fetal y se expresa predominantemente en el mesénquima (Fig. 4G-L). En wk14, expresión era adyacente a las células endoteliales y también estaba presente en el músculo liso en wk16 (Fig. 4K-L). En ambas etapas, el epitelio estaba desprovista de expresión de SPARC. En wk19, la tinción del estroma fue intensa y se encuentra en la mayoría de las células mesenquimales (Fig. 4K-L), incluyendo las células endoteliales capilares, y con la tinción débil en el epitelio. La tinción en la región apical de epitelial sugiere que la señal epitelial SPARC puede ser no específica (punta de flecha en la Fig. 4 l) como proteínas secretoras de próstata pueden unirse no específicamente algunos anticuerpos.
Spry-1 se encontró que era se expresa en ambos, el epiteliales y mesenquimales compartimentos en los tres años de edad (Fig. 4 M-R). En wk14, la localización epitelial estaba en la membrana basal y en la parte superior de la parte apical de las células epiteliales luminales. expresión mesenquimales se limitaba a pequeñas manchas intensas, pero que estaban dispersos por todo el mesénquima (Fig. 4 K-L). En wk16, expresión epitelial estaba ausente de la membrana basal, pero aún presente en la superficie apical mientras que la expresión mesenquimales se localizó en el citoplasma de un subconjunto de células, incluyendo las células endoteliales. En wk19, expresión epitelial fue distribuida uniformemente a través de las capas basales y de células luminal, localizado en la superficie celular y el citoplasma. expresión mesenquimales se limita una vez más a pequeñas manchas dentro de un subconjunto de fibroblástica y células endoteliales.
Tsukushi se encuentra en pequeñas subregiones mesenquimales en comparación con las otras tres proteínas, y su prevalencia era mínima en las tres etapas (Fig. 4S-X). No hubo un patrón de expresión clara en lo que respecta al tipo de célula o área, sino que se encontró en los fibroblastos y las células endoteliales, y se detectó en el lado apical de algunas células epiteliales luminales en las semanas 14, 16 y 19.
decorina, SPARC, Spry-1 y Tsukushi mostraron notables similitudes en lo que se refiere a la localización mesenquimales, así como aumento de la intensidad de la tinción en humanos y roedores, entre P0.5 a P6.5 y wk14 a wk19, respectivamente. Las similitudes en la distribución de proteína entre ratas y humanos sugieren que estas moléculas se expresan mesénquima y pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo del crecimiento y el patrón de la próstata.
La expresión de decorina se encuentra disminuida en cáncer de próstata
decorina y Tsukushi demostraron la mayoría de los patrones de expresión-mesénquima específica en el desarrollo de la próstata de rata y humano, mientras que Semaphorin6D, SPARC y Spry-1 mostraron tanto mesenquimales y epiteliales expresión. Decidimos centrarnos en las moléculas que muestran mesénquima-única expresión y por lo tanto decorina y Tsukushi llevaron adelante para la evaluación de la expresión en el cáncer de próstata de pacientes y controles emparejados.
Arrays de tejido micro (TMA) y muestras de nuestra propia colección de CaP se tiñeron para Tsukushi pero no se observó diferencia entre PCa y el tejido no maligno (datos no mostrados). A continuación, se analizó la expresión de decorina.
zonas representativas de tinción decorina se muestran en la Fig. 5A, la tinción B. Decorin fue marcado por un único investigador ciego para el alcance de la estroma Decorin tinción (0 = sin tinción, 1 = ~1-20%, 2 = ~20-50%, 3 = & gt; 50% de estroma zona). Además, la intensidad de la tinción más prevalente en cada punto del tejido se evaluó (independiente del tamaño del área de manchado) con un sistema de puntuación 0,1,2,3 no lineal siendo 0 ausencia de tinción, y 1, 2, y 3 que representa el aumento de la intensidad de la mancha. Asumimos que la intensidad de la tinción fue en proporción a la cantidad real de la proteína decorina. Entre los tejidos malignos y no malignos, no hubo diferencia en la extensión de la superficie del estroma de la expresión de decorina (prueba de Mann-Whitney; p = 0,45). Sin embargo, encontramos una intensidad disminuida de la tinción de decorina en áreas malignas en comparación con las áreas de control no malignas. En total se analizaron 186 puntos de tejido de secciones comerciales TMA y tejidos de chips de RTUP de 10 pacientes.
CaP tejido se tiñó mediante IHC para decorina. A) Un representante de punto tejido de CaP mostró tinción menos intensa que B) un punto de tejido no maligno representativa. Al mismo tiempo el tejido prostático procesado de nuestro propio banco de tejidos se utilizó con IgG no específica como control negativo C) y anti-decorina anticuerpo como control positivo (D), lo que demuestra la especificidad de la tinción. La evaluación de la intensidad de la tinción DAB para cada punto de tejido se muestra en E), demostrando una puntuación significativamente más baja en CaP (n = 91) en comparación con los controles no malignos (n = 20) (prueba de Mann Whitney, de dos colas, p & lt; 0,0001). Las cajas indican los percentiles 25-75 mientras que los bigotes indican los percentiles 10-90.
El análisis estadístico con la prueba de Mann-Whitney no paramétrico confirmó una disminución significativa de la intensidad de la tinción del estroma decorina en áreas malignas en comparación con las áreas de control no malignas (p = 0,0001, Fig. 5E). Los resultados sugieren una regulación a la baja de decorina en el CaP. A continuación examinó una posible correlación entre la intensidad de la tinción decorina y la puntuación de Gleason, sin embargo no había evidencia de correlación (datos no mostrados).
Discusión
Las moléculas se expresa en el mesénquima de próstata y el estroma desempeñan un papel clave en el desarrollo, la homeostasis del tejido y las enfermedades como el cáncer. Hemos establecido para identificar moléculas que mostraron expresión-mesénquima específica en la próstata, y, posteriormente, a los que también mostró la expresión desregulada en el cáncer de próstata. Nuestro punto de partida fue una expresión de genes en el desarrollo de perfiles de estudio de nuestro grupo que proporcionó una lista de 219 moléculas que fueron potencialmente restringidos a mesénquima de próstata inductivo. La distribución de la transcripción de varios de estos candidatos fue examinado por wholemount hibridación in situ, lo que lleva a la identificación de cinco moléculas expresadas mesénquima durante el desarrollo de la próstata. Una de estas moléculas, el supresor tumoral putativo decorina, también mostraron regulación a la baja en el estroma del cáncer de próstata.
Expresión de moléculas mesenquimales en el desarrollo de próstatas
Hemos identificado la expresión mesenquimales de
decorina, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1 y Tsukushi Hoteles en UGT de ratas macho P0.5 perinatales a través de WISH y sus respectivas proteínas a través de la IHC. En todos los casos, había una muy buena correlación entre la tinción IHC deseo y la detección de las moléculas. La distribución de la proteína decorina mostró la localización peri-epitelial que no fue detectada a través de WISH. El anticuerpo Decorin se validó en el proyecto Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/) como específico para decorina humana y ya que es una proteína secretada, se especula que la fuerte tinción adyacente al urotelio es el resultado de secreción y difusión.
La decorina, Semaphorin6D, SPARC, Sprouty1
y
Tsukushi
se expresa en el mesénquima de rata durante E17.5 a P0.5. En P6.5 cuatro moléculas mostraron expresión mesenquimales de sólo con solamente Spry-1 que muestra la expresión tanto en el mesénquima y el epitelio. Cuando la diferenciación de próstata era casi o totalmente completa en P28 y adultos, respectivamente, hubo claras diferencias entre los grupos: los proteoglicanos Decorin y Tsukushi habían localización del estroma, Semaphorin6D ganado una débil expresión en el epitelio, pero estaba casi totalmente ausente en el estroma, mientras que Spry -1 y SPARC mostraron una inversión de patrones con fuerte expresión hacia el compartimiento epitelial y casi ausencia en el estroma. A partir de estos datos se concluye que entre las moléculas investigadas actualmente dos conservan la expresión del estroma en la próstata diferenciada y el resto o bien dejan expresión del estroma o cambiar a epitelial expresión.
Expresión mesenquimales en la rata y el Desarrollo Humano de próstata
Existen revisiones recientes de la anatomía comparada entre humanos y roedores [21], así como comparaciones de los programas de expresión génica global en el desarrollo del cáncer de próstata en comparación con [22]. Sin embargo, pocos estudios hasta ahora compararon los genes expresados mesénquima y sus productos proteicos entre los roedores en desarrollo y de próstata humana [23]. En el estudio actual, se encontró que la expresión de decorina, SPARC, Spry-1 y Tsukushi en la próstata humana correlaciona bien con las respectivas etapas de desarrollo en la próstata de rata, lo que sugiere que la rata es un modelo adecuado para el estudio del desarrollo de la próstata humana.
Un papel para decorina en el desarrollo del cáncer de próstata y
Varias funciones se han descrito anteriormente para la decorina en el desarrollo.