Extracto
Antecedentes
Las metástasis pulmonares son frecuentes en pacientes con cáncer colorrectal primario cáncer (CRC). la proteína de choque térmico 27 (Hsp27) es upregulated en fibroblastos activados durante la cicatrización de heridas y sistémica elevada en diversas enfermedades. fibroblastos asociados al cáncer (CAF) también se cree que desempeñan un papel como marcadores pronósticos y predictivos en diversos tumores malignos incluyendo CRC. Sorprendentemente, la expresión de Hsp27 nunca ha sido evaluada en los CAF. Por lo tanto, el objetivo fue investigar el nivel de expresión de Hsp27 en los CAF y sus implicaciones clínicas en pacientes con metástasis pulmonares CRC.
Métodos
FFPE muestras de tejido de 51 metástasis pulmonares (PMS) y 33 emparejados primaria se evaluaron los tumores de alfa-SMA, CD31, Hsp27 y la expresión de vimentina mediante técnicas de inmunohistoquímica y se correlacionaron con las variables clinicopatológicas. 25 metástasis hepáticas sirvieron como grupo de control. Por otra parte, las muestras de suero (n = 10) antes y después de metastasectomıa pulmonar fueron evaluados para la circulación de fosfo-Hsp27 y Hsp27 total mediante ELISA.
Resultados
No se observó expresión del estroma de la Hsp27 en toda la tarde y mostró una fuerte correlación con alfa-SMA (
P Hotel & lt; 0,001) y vimentina (
P Hotel & lt; 0,001). estromal fuerte Hsp27 se asoció con una mayor densidad de microvasos en el CCR primaria y PM. Por otra parte, la alta estromal Hsp27 y expresión αSMA se asociaron con una menor supervivencia libre de recurrencia después de metastasectomıa pulmonar (
P = 0,018
y
P = 0,008
, respectivamente) y la supervivencia global (
P
= 0,031 y
P = 0,017
, respectivamente). Los niveles séricos de Hsp27 y fosfo total se redujo después de metastasectomıa a niveles comparables con los controles sanos.
Conclusiones
Aquí se describe por primera vez que la Hsp27 se expresa altamente en el estroma tumoral de CCR. Estromales α-SMA y Hsp27 expresiones se correlacionan con la evolución clínica tras metastasectomıa pulmonar. Por otra parte, la Hsp27 suero podría representar un marcador de futuro para la enfermedad metastásica en el CCR
Visto:. Schweiger T, Nikolowsky C, P Starlinger, Traxler D, M Zimmermann, Birner P, et al. (2015) Expresión del estroma de la proteína de choque térmico 27 está asociada con un peor resultado clínico en pacientes con cáncer colorrectal metástasis pulmonares. PLoS ONE 10 (3): e0120724. doi: 10.1371 /journal.pone.0120724
Editor Académico: Gabriele Multhoff, Universidad Técnica de Munich, Alemania |
Recibido: 17 Agosto, 2014; Aceptado: 26 Enero 2015; Publicado: 20 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Schweiger et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Laboratorio Doppler cristiano por cardíaca y torácica Diagnóstico y regeneración y por la Universidad de Medicina de Viena. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este estudio fue apoyado por el Laboratorio Doppler cristiano por cardíaca y torácica Diagnóstico y Regeneración y por la Universidad de Medicina de Viena. Los resultados preliminares con un número limitado de pacientes se han presentado en la reunión anual de la Sociedad Austríaca de Cirugía Cardiotorácica y la Sociedad Austríaca de Cirugía. HJA declara que compiten intereses económicos (número de patente WO 2010/000820 (suero Hsp27 para el diagnóstico de EPOC) y WO 2012/080303 (suero Hsp27 para el diagnóstico de NSCLC)). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. Los otros autores declaran no tener conflictos de interés.
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es, después del cáncer de pulmón, la segunda causa más común de muerte por cáncer en Europa [1]. Más de un quinto de los pacientes con CRC presente con metástasis ya en el momento del diagnóstico del cáncer primario y la misma proporción se desarrollan metástasis en el curso de la enfermedad [1, 2]. Los pulmones son el segundo sitio más común de metástasis a distancia, lo que hace metástasis pulmonares (MP) contribuye de manera fundamental a la alta mortalidad de CRC.
Además de las células cancerígenas, un tumor comprende las células del estroma. Las interacciones de las células del estroma y el cáncer se cree que es un determinante importante del comportamiento del tumor y la respuesta al tratamiento [3, 4]. Los componentes celulares del estroma son fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y pericitos [5]. fibroblastos asociados con el cáncer (CAF), y fibroblastos especialmente activados, desempeñan un papel importante en la red de tumor de estroma, similar a los fibroblastos dérmicos en la cicatrización de heridas. Esto contribuyó a la descripción de los tumores como "heridas que no se curan" de Dvorak
et al
. a finales de los años 80 [6]. CAF contribuyen a diversas características de promotores de tumores, como el volumen de negocios extra-celular de matriz, el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis [7, 8]. Debido a la expresión de α-actina de músculo liso (α-SMA), que se activa la CAF se describe a menudo como miofibroblastos. También han demostrado ser positivo para la activación de fibroblastos proteína-α /seprase, palladin y vimentina [9-12]. Recientemente, se han hecho esfuerzos para caracterizar la "firma" de estos fibroblastos por la expresión de genes de perfiles proteoma y [13, 14].
En el contexto de enfermedades benignas, la curación de heridas y la formación de queloides es bien sabido que fibroblastos activados expresan altos niveles de la proteína de choque térmico 27 (Hsp27), que es crucial para la adhesión de fibroblastos, la contractilidad y la motilidad [15-17]. La vía de p38-MAPK inducida por TGF-beta es el regulador clave en la inducción de la Hsp27 en células musculares lisas y miofibroblastos [18, 19]. Una vez sintetizados, dos funciones principales de Hsp27 son críticos en el proceso de cicatrización de la herida: la promoción de la motilidad miofibroblastos y la angiogénesis. Hsp27 está implicada en la estabilización de los filamentos de actina y de caracol, un inductor de la transición epitelial-mesenquimal. Ambos mecanismos contribuyen a la inducción del fenotipo myofibroblastic [20, 21]. Otra función de la Hsp27 ejecutado de una manera paracrina es la mejora de la angiogénesis. Se demostró que la Hsp27 extracelular conduce a la activación de NFkB y la posterior expresión de la VEGF factores proangiogénicos y la interleucina-8 (IL-8) en las células endoteliales [22]. Junto con otros, nuestro grupo pudo demostrar que una sobreexpresión de Hsp27 está fuertemente ligada a varias patologías benignas y malignas del pulmón asociado con la activación de fibroblastos, incluyendo el enfisema enfermedad /pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática y de pulmón de células no pequeñas cáncer [21, 23-26].
Teniendo en cuenta el hecho de que los fibroblastos activados desempeñan un papel importante en la progresión de la enfermedad maligna, así como en diversas enfermedades no malignas del pulmón, que tuvo como objetivo investigar la prevalencia de Hsp27 estroma tumoral positiva en las metástasis pulmonares CRC y tumores primarios correspondientes. Por otra parte, hemos tratado de describir las implicaciones en la evolución clínica tras metastasectomıa y la presencia de Hsp27 celular y secretada en estos pacientes.
Materiales y Métodos
Estudio de la población
De abril 2009 a noviembre 2013, se incluyeron todos los casos consecutivos de metastasectomıa pulmonar del CRC primaria y muestras de tejidos adecuados en este estudio. Los pacientes recibieron el trabajo de diagnóstico incluyendo torácica y la tomografía computarizada (TC) abdominal. Si los pacientes se habían sometido a metastasectomıa pulmonar antes, la muestra de la primera metastasectomıa también se examinó y la fecha de la primera metastasectomıa se utilizó para el cálculo de los resultados. Pulmón metástasis supervivencia libre (LMFs) se define como el tiempo entre el diagnóstico del tumor primario y el diagnóstico de la diseminación metastásica en el pulmón. Resección R0 se logró en todos los pacientes. De los 33 pacientes, se pudieron obtener muestras de tumor primario correspondiente. Los exámenes de seguimiento se llevaron a cabo en intervalos de 3 a 6 meses. la supervivencia libre de recurrencia (RFS) se define como el período desde el primer metastasectomıa pulmonar a la evidencia de enfermedad recurrente en cualquier sitio verificado por tomografía computarizada. En 10 casos consecutivos, las muestras de suero obtenidas antes metastasectomıa y durante el seguimiento estaban disponibles. muestras de suero de seguimiento se recogieron 3 a 6 meses después de la cirugía. Se recogieron voluntarios sanos Además, las muestras de suero de edad, el género y el tabaquismo status- combinarse. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la extracción de sangre y la participación. Un estudio de cohorte de 25 pacientes consecutivos con metástasis hepáticas resecadas CRC sirvió como grupo de control adicional. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Medicina de Viena (EK 91/2006, EK1194 /2011 y EK1044 /2012) y se llevó a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki. La cohorte del estudio actual se basa en los trabajos publicados anteriormente por nuestro grupo. [27, 28]
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con un protocolo estándar. En breve, las muestras de tejido, incluidos en parafina fijadas con formalina se cortaron en secciones gruesas de 4 micras y deparaffinized. Se realizó la recuperación de antígenos mediada por calor. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con peróxido de hidrógeno 0,3%. Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la inmunohistoquímica, que en la etapa secundaria, el kit ImmPRESS basado polimerización (Vector Laboratories, Burlingame, California) fue utilizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. 3,3'-diaminobencidina (DAB) se utilizó como sustrato (Vector Laboratories, Burlingame, California). Por último, las secciones se contratiñeron con hematoxilina. vimentina tinción se realizó en un sistema Ventana ES Immunostainer (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, EE.UU.). Por inmunofluorescencia, anticuerpos secundarios fluorescentes apropiados se utilizaron y núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Como controles negativos, se omitió el anticuerpo primario. Los controles positivos fueron muestras de tejido con presencia conocida de la respectiva proteína diana. Una lista detallada de anticuerpos y diluciones se proporciona como información complementaria (S1 Tabla).
La puntuación de las células tumorales teñidas.
puntuación de tinción inmunohistoquímica (IHC puntuación) se calculó como se describe anteriormente [29] . El porcentaje de células tumorales positivas podría alcanzar valores entre 0 y 100%, y se multiplicaron por la intensidad de tinción (0 a 3). Por lo tanto, resultados de IHC pueden ir desde 0 a 300. Dos observadores ciegos clasificado el tinción. En caso de que las dos clasificaciones difieren, la corredera se discutió y re-evaluado. La puntuación continua IHC se dicotomizó mediante la aplicación de la puntuación media de metástasis o tumores primarios como valor de corte.
La puntuación de las células del estroma de colores.
Las secciones se puntuaron semicuantitativamente como se describe anteriormente [10 ]. En pocas palabras, las diapositivas fueron examinados a bajo aumento y evaluados por su intensidad de la tinción en las células del estroma en el centro del tumor. La tinción del estroma se evaluó como de grado 0 (negativo, & lt; 1% de células estromales positivos), grado 1+ (, 1-10% de células estromales positivos bajos), grado 2 + (intermedio, & gt; células estromales positivos 10-50% ) y el grado 3+ (fuertes, & gt; 50% de células estromales positivos) por dos observadores ciegos. En caso de que las dos clasificaciones difieren, la corredera se discutió, re-evaluado y se llegó a un consenso en todas las diapositivas.
Determinación de la densidad de microvasos.
densidad de microvasos (MVD) se midió utilizando el método de "punto caliente", tal como se publicó en otros lugares [30]. En resumen, los portaobjetos fueron examinados con pocos aumentos para identificar el área con el mayor número de microvasos CD31-positivo ( "punto caliente"). MVD se determinó contando todos los microvasos a 200 aumentos (que corresponde a 0,95 mm
2). Los valores medios se calcularon a partir de dos densidades contados de forma independiente. En caso de una fuerte discrepancia entre observadores, fue reevaluado la diapositiva.
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Las muestras de suero fueron evaluadas por Hsp27 humana disponible comercialmente, fosfo-Hsp27 y la interleucina 8 kits de ELISA (todos amp; I & D Systems, Minneapolis, EE.UU.). La medición se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron por duplicado. La absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de placas (PerkinElmer, Waltham, EE.UU.), en comparación con una curva estándar con un contenido de proteína conocida y se convierte en pg /mL.
El análisis estadístico
Todo obtuvo Los datos se evaluaron estadísticamente mediante el programa SPSS 19 (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.) y GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., California, EE.UU.). Se utilizó la prueba t de Student para comparar las medias de dos grupos independientes, emparejado prueba t para grupos dependientes y se expresan como media ± desviación estándar (DE). Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank test se utilizaron para comparar las funciones de supervivencia. prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher se utilizaron para comparar las variables binomiales. Todas las pruebas fueron de dos caras. Los valores de p-iguales o inferiores a 0,05 se consideraron como estadísticamente significativo.
Resultados
Las muestras de tejido de la tarde de un total de 51 pacientes consecutivos estaban disponibles. La mediana de edad en metastasectomıa fue de 63 años (rango 33-83). 29 (56.9.1%) hombres y 22 (43,1%) se incluyeron pacientes de sexo femenino. Las características clínico-patológicas de los pacientes incluidos se resumen en la Tabla 1.
Hsp27 se expresa altamente en el estroma asociado al cáncer de metástasis pulmonares
Para evaluar el nivel de expresión de Hsp27 en cáncer- estroma asociado, secciones de tejido se tiñeron para Hsp27 y vimentina (Fig. 1). La expresión de Hsp27 estroma tumoral en PM se anotó en 0 casos (0%), 17 (33%), 17 (33%), 17 (33%) como 0, 1+, 2+ y 3+, respectivamente. La correlación de la estroma tinción Hsp27 con las características del paciente y del tumor se muestra en la Tabla 1. La intensidad de tinción de las células del tumor se determinó por separado (S1A FIG). 23 (45%) metástasis fue evaluado como muy positiva la Hsp27 y 28 (55%) de las metástasis tan bajo /negativo (IHC rango de puntuación de 0-160; mediana /cortada 30). No hubo correlación entre el tumor y el estroma la expresión de Hsp27 en las metástasis pulmonares (Chi cuadrado;
P = 0,237
). 33 tumores primarios correspondientes estaban disponibles. La expresión del estroma Hsp27 en el primario tumores 0 (0%), 6 (18%), 15 (46%) y 12 (36%) se obtuvo como 0, 1+, 2+ y 3+, respectivamente. La determinación de la tinción de Hsp27 en las células tumorales en el tejido tumoral primario, 14 (42%) de los casos se obtuvo como Hsp27 positivo y 19 (58%) rango negativo (puntaje tan bajo /IHC 5-100; mediana /cortada 70 ).
fibroblastos estromales se identificaron mediante tinción más vimentina. (Sustrato de DAB, mismo espécimen de tumor por fila, ampliación 200x).
Hsp27 se co-expresada con α-SMA y vimentina en el estroma de los PM
estroma tumoral ha sido activado descrito como altamente positivo α-SMA en el CCR primario y metastásico [12, 31]. Por lo tanto, las muestras fueron teñidas con α-SMA. La expresión de α-SMA en el estroma fue evaluado de la misma manera semicuantitativa como tinción Hsp27. 0 (0%), 13 (25,5%), 24 (51%) y 13 (25,5%) casos se puntuaron como 0, 1+, 2+ y 3+, respectivamente. La distribución de puntuación de tinción de acuerdo con las variables clinicopatológicas se representa en la Tabla 1. Los niveles de expresión de α-SMA se correlacionó significativamente con la expresión de Hsp27 en el PMS (
P
. & Lt; 0,001, figura 2A). Esto también se observó en las metástasis hepáticas (S2 FIG). A fin de evaluar el estroma co-expresión de α-SMA y Hsp27, los portaobjetos representativos de tumores primarios y metastásicos fueron co-etiquetados para α-SMA y Hsp27 por inmunofluorescencia. Un fuerte co-expresión se puede observar especialmente en los PM (Fig. 2D). estroma tumoral con fuerte Hsp27 y tinción α-SMA también fue altamente positivo para vimentina (S3 Tabla).
microvasos CD31-positivo rodeadas de estroma tumoral junto a las células tumorales (asterisco) (B). MVD fue significativamente mayor en los tumores primarios y metástasis con una fuerte expresión del estroma Hsp27 (C). La inmunofluorescencia mostró un co-expresión de Hsp27 estromal y α-SMA especialmente en PM (400 aumentos) (D).
MVD se incrementa en muestras de tejido con tumor de estroma Hsp27 positivo
Recientemente se ha demostrado que Hsp27 media la angiogénesis [22]. Por lo tanto, se determinó la MVD por tinción con CD31 y correlacionado con las expresiones Hsp27 (Fig. 2B y 2C). En la tarde, se encontró una tendencia hacia una mayor MVD en muestras con altos niveles de Hsp27. MVD fue 33,0 ± 2,9, 40,1 ± 3,8 y 43,0 ± 4,7 para 1+, 2+ y 3+ intensidad Hsp27 (media ± DE). Sin embargo, esta tendencia no alcanzó el nivel de significación (
P = 0,081
). Del mismo modo, en el documento CRC primaria con altos niveles de estroma de Hsp27, significativamente más microvasos se podían encontrar (27,7 ± 3,2, 37,2 ± 4,0 y 46,4 ± 5,2 para 1+, 2+ y 3+ Hsp27 intensidad, respectivamente;
P =
0,031). Una descripción detallada de MVD estratificados por características clinicopatológicas se proporciona en la Tabla S2.
estroma Hsp27 se asocia con un mal resultado después de metastasectomıa pulmonar
Se evaluó la asociación de las variables clinicopatológicas pertinentes con LMFs, y RFS OS después de metastasectomía (Tabla 2). Ninguna variable tuvo un impacto significativo sobre los LMFs. Las pacientes mujeres tenían una fuerte tendencia hacia un tiempo más corto de los PM (
P = 0,091
). La expresión del estroma de ni α-SMA ni Hsp27 se asoció con una disminución significativamente LMFs. Sin embargo, ambos marcadores histológicos tuvieron un impacto significativo sobre el pronóstico de los RFS después metastasectomıa pulmonar (
P = 0,018
y
P = 0,008 para
estromal y Hsp27 α-SMA, respectivamente) (Fig. 3 ). Una vez más, las pacientes mostraron una fuerte tendencia a la disminución de RFS. Por otra parte, los pacientes con antecedentes de metástasis hepáticas anteriores tenían un RFS disminuyó en comparación con los pacientes sin metástasis hepáticas en la historia. Sin embargo, ambas variables, el sexo y la historia de las metástasis hepáticas anteriores, no tuvieron influencia significativa en la RFS. Además de eso, extensa del estroma estroma Hsp27 Hsp27 y α-SMA se asociaron con una disminución de la supervivencia global después de metastasectomıa (
P = 0,031
y
P = 0,017 para
estromal y Hsp27 α-SMA, respectivamente). Debido a la alta tasa de concordancia, estromales y Hsp27 α-SMA no había factores independientes en el análisis de los resultados al agregar dos variables en un análisis multivariado (datos no presentados).
Soluble Hsp27 se incrementa sistémicamente en los pacientes antes de metastasectomía pulmonar
Los niveles elevados de Hsp27 soluble se pueden detectar sistémicamente en varias enfermedades malignas y no malignas. En un subgrupo de 10 pacientes de nuestros pares de muestras de suero (pre y post-metastasectomıa) estaban disponibles (Fig. 4). Se comparó el nivel sérico del total Hsp27 y Hsp27-fosfo a voluntarios sanos emparejados (S3 Tabla). los niveles de Hsp27 séricos totales fueron 2.276 ± 905, 3245 ± 1684 y 2064 ± 1226 pg /ml (media ± DE) para el control, las muestras pre y post-Metastasectomía, respectivamente. Hsp27 total disminuyó significativamente después metastasectomıa (
P = 0,016
). los niveles de fosfo-Hsp27 suero fueron 84 ± 63, 156 ± 82 y 88 ± 114 pg /ml (media ± DE) de las muestras de control, antes y después de Metastasectomía, respectivamente. Se encontró una diferencia significativa entre los controles sanos y muestras de pre-Metastasectomía (
P = 0,041)
. Aunque los niveles cayeron después de metastasectomıa, la diferencia no fue significativa. IL-8, una citoquina proangiogénica implicados en la señalización Hsp27, se detectó en concentraciones muy bajas de 15 ± 8, 45 ± 58 y 9 ± 8 pg /ml (media ± DE) en las muestras de suero. Las diferencias de sistémicos de IL-8 niveles entre los tres grupos no difirieron significativamente entre sí. No se encontró correlación entre el nivel de expresión del estroma Hsp27, Hsp27 tumoral y los niveles sistémicos (datos no mostrados). Por otra parte, hay una correlación significativa entre la unión total o fosfo-Hsp27 y los marcadores inflamatorios estándar (CRP y fibrinógeno) se encontró (Fig S1B y S1C).
expresión del estroma Hsp27 en las metástasis pulmonares se aumentó significativamente en comparación con el hígado metástasis
además, evaluó la expresión del estroma del estroma y Hsp27 α-SMA en metástasis hepáticas de 25 pacientes. En cuanto a la expresión del estroma Hsp27 0 (0%), 12 (48,0%), 11 (44,0%) y 2 (8,0%) casos fueron anotados como 0, 1+, 2+ y 3+, respectivamente. expresión del estroma α-SMA expresión fue calificado como 0 (0%), 8 (32,0%), 11 (44%) y 6 (24,0%) casos fueron anotados como 0, 1+, 2+ y 3+, respectivamente. Se encontró una fuerte correlación entre el estroma y Hsp27 α-SMA (P & lt; 0,001). Por otra parte, estromales Hsp27 positividad se encontró una frecuencia significativamente mayor en las metástasis pulmonares en comparación con metástasis hepáticas (P = 0,014), mientras que esta diferencia no fue significativa para α-SMA (P = 0,625). Además, la expresión de Hsp27 en las células tumorales (mediana 120 (rango de 0 a 270)) fue significativamente mayor en las metástasis hepáticas en comparación con metástasis pulmonares (P = 0,037). Además, se analizó la supervivencia global de los pacientes con metástasis hepáticas en función de su estroma Hsp27, α-SMA y la expresión de Hsp27 tumor, pero no se encontraron diferencias significativas (figura S3).
Discusión
las metástasis a distancia son la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer. Hoy en día, el microambiente del tumor y, especialmente, los fibroblastos ha sido de creciente interés, proporcionar información adicional sobre el comportamiento del tumor y potenciales dianas terapéuticas [32]. Los miofibroblastos se pueden encontrar en el microambiente de diversos tumores y extensa de fibroblastos-activación podría estar relacionado con la progresión rápida de la enfermedad en la enfermedad maligna [32].
En esto hemos podido demostrar en un estudio de cohortes bien definido que vimentina
+ αSMA
+ células estromales son muy presente en las metástasis pulmonares de CRC primaria. Wikberg
et al
. describen que los miofibroblastos en el centro del tumor son una mejor pronosticador de mal pronóstico de los fibroblastos en el margen del tumor [33]. Nosotros, por lo tanto, restringido el marcador de la activación de los fibroblastos putativo a la parte central del tumor. En comparación con Henry
et al
., Que se identificó por miofibroblastos FAP-tinción en el cáncer de colon primario, se encontró una distribución similar de la puntuación del estroma (0%, 20%, 38% y 35% para el negativo, baja , tinción intermedia y fuerte, respectivamente). Adicionalmente, se describen la asociación de grandes cantidades de fibroblastos activados con una disminución de la supervivencia global en pacientes con cáncer de colon, especialmente en la situación metástasis [10]. Esto va en línea con nuestros resultados muestran una disminución de RFS después metastasectomıa pulmonar.
Curiosamente, α-SMA fenotipo positivo del estroma asociado al tumor fue acompañada por la expresión de Hsp27. Por un lado, esta pequeña proteína de choque térmico se ha examinado en células tumorales CRC sí mismos [34-36]. Un aumento de la expresión de Hsp27 en las células tumorales de CRC primaria fue descrito como pronosticador negativo para la supervivencia [37, 38]. Por otro lado, Hsp27 fibroblastos que expresan fueron examinados en el contexto de la cicatrización de heridas y fibrosis. A lo mejor de nuestro conocimiento, estromales Hsp27 no se ha descrito como un potencial marcador pronóstico en el CCR. Curiosamente, fuerte estroma expresión de Hsp27 se asocia con una elevada MVD en los tumores primarios (P = 0,031) y en PM (P = 0,081). Debido a la fuerte correlación de Hsp27 con α-SMA como un marcador establecido para la activación de fibroblastos, la sobre-expresión de Hsp27 se asoció con significativamente peor resultado clínico después de metastasectomía pulmonar (mediana RFS 19, 17 y 8 meses para 1+, 2+ y 3+, respectivamente), comparable con el impacto pronóstico de la expresión del estroma α-SMA. El RFS disminución también se tradujo en un sistema operativo significativamente diferente entre el bajo, intermedio y alto del estroma o Hsp27 α-SMA, respectivamente (Fig. 3). Del mismo modo, Tsujino
et al
. describe α-SMA fibroblastos positivos como capaces de predecir la recurrencia de la enfermedad en una cohorte de pacientes con estadio II y III primaria CRC [12]. Kahlert
et al
. demostrada por microdisección de metástasis CRC, pulmón e hígado primarios que un grupo de factores pro-angiogénicos son expresados diferencialmente en las células tumorales y el compartimiento del estroma. La expresión del estroma de la angiopoyetina-2 en metástasis pulmonar fue un factor pronóstico independiente de supervivencia pobre después de la cirugía en el análisis multivariante (
P = 0,044
), incluso en un lugar pequeño estudio de cohortes (n = 25) [39]. Estos resultados apoyan los resultados de nuestro trabajo, en la que podríamos describir como Hsp27, marcador del estroma más proangiogénico con impacto pronóstico después metastasectomıa. También es importante mencionar, que Sato
et al
. la expresión de alto estromal descrito de la descripción factores de ETS1 como predictor de CRC metástasis pulmonares [40]. Curiosamente, ETS1 está fuertemente interactuando con la pequeña red de proteínas de choque térmico [41].
El análisis de las muestras de sangre en un subgrupo de pacientes reveló que el CCR metastásico es un inductor relevante incluso de expresiones Hsp27 sistémicos. El nivel de Hsp27 solubles totales y fosfato Hsp27, una forma polimerizada de Hsp27, disminuyó significativamente después de la eliminación completa de las OMP. Por otra parte, en comparación con un grupo control de voluntarios sanos, el total de los niveles de Hsp27 y Hsp27 fosfo-pre-operativas se incrementaron y disminuyeron después de la cirugía a los bajos niveles comparables. Al igual que en nuestros hallazgos, Zhao
et al
. pudo demostrar aumento de los niveles séricos de Hsp27 en el cáncer de ovario con metástasis peritoneales. En la misma obra, también se demostró que los niveles cayeron después de la quimioterapia [42]. IL-8, que se piensa para mediar localmente el efecto proangiogénico de Hsp27, también fue elevado antes de metastasectomía sin alcanzar significación [22]. Nontheless, los niveles circulantes de Hsp27 no se correlacionó con la expresión del estroma o tumor. Además, no se correlacionó con los niveles sistémicos de proteína C reactiva y el fibrinógeno. Así, la Hsp27 de circulación puede estar influenciada por otros factores como la secreción, la degradación y eliminación. Sobre la base de estos resultados preliminares, serán necesarios más estudios de cohortes con tamaños adecuados para aclarar aún más el posible papel pronóstico y predictivo de los niveles circulantes de Hsp27 en pacientes con CCR.
En los pacientes con enfermedad hepática CRC metástasis del tumor de estroma Hsp27
+ vimentina
+ αSMA
+ fibroblastos son menos evidentes que en las metástasis pulmonares. En contraste con esto, la expresión Hsp27 en las células tumorales fue significativamente mayor en las metástasis hepáticas resecados en comparación con metástasis pulmonares. Esto va en línea con la observación de que la señalización de p38 MAPK, una quinasa fundamental para la fosforilación y la activación de la Hsp27, está regulado por disminución en CRC metástasis pulmonares en comparación con metástasis en el hígado [43]
.
Los resultados de este trabajo son de traslación relevancia debido a dos aspectos: en primer lugar, Hsp27, sistémicamente, o confinado en el estroma del tumor, podría poseer pronóstico potencial y el valor predictivo. metastasectomıa pulmonar es una opción de tratamiento que ofrecen, en pacientes con CCR PM. Sin embargo, la identificación de los pacientes que se beneficiarán de la cirugía sola o una quimioterapia adyuvante opcional es una cuestión de la investigación actual [44]. Los biomarcadores como Hsp27 podría ayudar a identificar a los pacientes con alto riesgo de recurrencia precoz de la enfermedad después de la cirugía. La quimioterapia adyuvante y un estricto seguimiento se podrían ofrecer a estos pacientes. Durante el seguimiento de los pacientes con enfermedad maligna, los marcadores séricos, por ejemplo, CEA, CA 19-9 y beta-HCG, se utilizan habitualmente en la actualidad y marcadores adicionales podrían potenciar la exactitud de estos marcadores establecidos. Una limitación de este estudio es, que el CEA y los niveles de CA19-9 no se determinaron de forma rutinaria antes de metastasectomıa. La correlación de estos marcadores tumorales establecidos con suero Hsp27 se abordará en un futuro estudio.
En segundo lugar, la Hsp27 es una diana terapéutica prometedora. Apatorsen (OGX-427, OncoGenex, Bothell, Washington, EE.UU.), un oligonucleótido antisentido modificado, se une a la transcripción Hsp27 ARNm y por lo tanto inhibe la expresión de Hsp27 [45]. Actualmente en curso en fase II de los estudios están reclutando pacientes con avanzado de la próstata, de vejiga, de páncreas y cáncer de pulmón de células no pequeñas [46]. Los elevados niveles de expresión de Hsp27 en el estroma asociado al tumor proporcionan un fundamento para el uso de Hsp27 también en pacientes con CRC primaria. Teniendo en cuenta que no sólo las metástasis pulmonares CRC, sino también a metástasis de hígado y de los ganglios linfáticos exhiben una fuerte contratación de miofibroblastos, especialmente los pacientes con enfermedad metastásica podrían beneficiarse de la inhibición Hsp27
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En conclusión, podríamos demostrar que la Hsp27 es co-expresada con αSMA en el estroma tumoral de las metástasis pulmonares CRC y, por otra parte, que su sobre-expresión se asocia con una peor evolución clínica tras metastasectomıa. Es de destacar que la Hsp27 soluble también era sistémica medible, por lo que el suero Hsp27 un potencial marcador sérico futuro en el CRC.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Los anticuerpos y diluciones utilizadas para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
doi: 10.1371. /Journal.pone.0120724.s001 gratis (DOCX)
S2 tabla. Los datos descriptivos sobre el paciente, el tumor primario y metástasis características estratificados por MVD y vimentina (N = 51)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120724.s002 gratis (DOCX)
S3 Tabla. Características de los pacientes y controles sanos emparejados
doi: 10.1371. /Journal.pone.0120724.s003 gratis (DOCX)
S1 Fig. expresión Hsp27 también se encontró en sí misma las células tumorales (anti-Hsp27; sustrato DAB; 200 aumentos) (A)
Correlación de pre-operatorio proteína Hsp27 y C-reactiva (CRP) o fibrinógeno (n = 10) (B. y C). Ni Hsp27 total de (B), ni fosfo-Hsp27 (C) se correlacionaron significativamente con la PCR y el fibrinógeno
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120724.s004 gratis (TIF)
S2 Fig. En CRC metástasis hepáticas estromales y Hsp27 α-SMA de puntuación significativamente correlacionado (n = 25) (A)
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S3 Fig. La distribución de estroma Hsp27 (A) difería significativamente en las metástasis hepáticas (n = 25) en comparación con metasatses de pulmón (n = 51).
Esta diferencia no alcanzó significación para estromal α-SMA (B). expresión Hsp27 en las células tumorales fue significativamente mayor en las metástasis hepáticas en comparación con metástasis de pulmón (C). No se observaron diferencias significativas entre los subgrupos con respecto a la supervivencia global (D-F)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120724.s006 gratis (TIF)