Extracto
Objetivo
microRNAs (miRNAs) están implicados en diversas enfermedades neoplásicas, incluyendo el cáncer de próstata (PC). El objetivo de este estudio fue investigar el perfil de miARN en el tejido PC, para evaluar su asociación con los datos clínico-patológicas, y para evaluar el potencial de miRNAs como marcadores de diagnóstico y pronóstico.
Materiales y Métodos
a partir de una cohorte de 535 pacientes sometidos a prostatectomía radical (PR), una muestra de 30 pacientes (14 pacientes con insuficiencia rápida bioquímica (BF) y 16 pacientes sin BF) con una puntuación de Gleason 7 fueron analizados. Un total de 1435 miRNAs se cuantificaron mediante hibridación de microarrays, y miRNAs con la desviación estándar más alto (n = 50) fueron validados por PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) seleccionado.
In situ
hibridación (ISH) se utilizó para evaluar la expresión de miR-21.
Resultados
miR-21 fue el único de miR que fue significativamente regulado en el grupo BF (p = 0,045) miR-21 fue hasta reguladas en pacientes con BF en comparación con el grupo no BF (p = 0,05). En el análisis univariado, la expresión de alto estromal de miR-21 tuvo un impacto predictivo en la supervivencia libre de recurrencia bioquímica fracaso (BFFS) y la supervivencia libre de fracaso clínico (CFFS) (p = 0,006 yp = 0,04, respectivamente). En el análisis multivariado, se encontró que la expresión de alto estromal de miR-21 expresión que es un factor pronóstico independiente para BFFS en pacientes con Gleason 6 (HR 2,41, IC del 95%: 1,06 a 5,49; p = 0,037).
Conclusión
la expresión de alto estromal de miR-21 se asocia a peor bioquímica supervivencia libre de recurrencia después de la PR. Para los pacientes con Gleason 6, miR-21 puede ayudar a predecir el riesgo de una futura evolución de la enfermedad y por lo tanto ayudar a seleccionar los pacientes para el tratamiento adyuvante potencial o un más estricto seguimiento
Visto:. Melbo C-Jørgensen, Ness N, Andersen S, Valkov A, Dønnem T, al-Saad S, et al. (2014) Expresión del estroma de miR-21 predice el fracaso bioquímico en pacientes con cáncer con la próstata Gleason 6. PLoS ONE 9 (11): e113039. doi: 10.1371 /journal.pone.0113039
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: 14 Agosto, 2014; Aceptado: 17 de octubre de 2014; Publicado: 17 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Melbo-Jørgensen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de Helse Nord, La Administración de Salud del Norte (www.helse-nord.no) y la Universidad de Tromsø Universidad del Ártico de Noruega (www.uit.no). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres [1]. El resultado de la enfermedad es variable y difícil de predecir. Durante los últimos 30 años, el número de prostatectomías radicales (RP) ha aumentado 25 veces, debido principalmente a los pacientes con cáncer diagnosticado en exceso no letal [2]. Las pruebas de antígeno prostático específico (PSA) es la herramienta más común para detectar el cáncer de próstata. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que las concentraciones de PSA no son capaces de diferenciar entre los cánceres indolentes y que amenazan la vida en el momento del diagnóstico [3]. Una identificación de los mejores marcadores de pronóstico para la estratificación del riesgo por lo tanto tendrá un impacto importante en el manejo clínico de PC.
miRNAs constituyen una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes (~ 20 nucleótidos) que están involucrados en la regulación de la expresión de proteínas . miRNAs se pueden producir como un subproducto de la producción de mRNA como pasajeros inter-intrón, o se pueden transcribir como un producto de una o policistrónico por la ARN polimerasa II [4]. Trabajan mediante la unión a la 3 'UTR del ARNm diana, e inducen el silenciamiento del ARNm por la Argonaut (Hace) de proteínas en el complejo de proteína de silenciamiento inducido por ARN (RISC) [4], [5]. Muchos miRNAs están desreguladas en el cáncer y influencia en la formación y progresión del tumor, ya que se encuentran en regiones del genoma que son comúnmente sobreexpresados o eliminados [6]. Varios miRNAs y sus objetivos se expresan de forma anormal en el PC, que conduce a la progresión tumoral, invasión y metástasis. Las expresiones alteradas de algunos seleccionados miRNAs son potencialmente útiles como biomarcadores para el diagnóstico, el pronóstico y los efectos de clasificación de PC [7] - [9]. miR-21 fue el primer miARN oncogénicos por descubrir [10]. En la PC, se considera el miR-21 para actuar como un oncogén, pero su papel no está claro, y los informes son contradictorios. Hulf et al. [11] encontró miR-21 para actuar como un gen supresor de tumor, mientras que Ribas et al. [12] informó de que la sobreexpresión de miR-21 promueve el crecimiento dependiente de hormonas y la hormona independiente de tumor en líneas celulares PC. Además, concluyeron que los niveles elevados de miR-21 aumenta el desarrollo de tumores, crecimiento tumoral e inducida resistente a la castración fenotipo [13]. Por el contrario, Folini et al. [14] No se encontró ninguna diferencia en la expresión de miR-21 entre el tejido normal de la próstata y PC. Shi et al. [15] encontró miR-21 para participar en la quimio-resistencia y que el miR-21 fue hasta reguladas en las células PC3 resistente al docetaxel (PCR3) en comparación con las células PC3 de tipo salvaje.
En este estudio, se investigó el miARN el perfil de los pacientes con CP. Entre 1435 miRNAs, MIR-21 fue el único candidato que miARN fue significativamente regulada hacia arriba y se sometió a una evaluación posterior como marcador pronóstico para toda la cohorte. El Comité Regional de Medicina y Salud Ética de la Investigación (2009/1393), el Oficial de Protección de Datos de Investigación (NSD), y la Junta Nacional de Inspección de Datos han aprobado este estudio. El comité de ética renunciado a la necesidad de consentimiento. Los registros de los pacientes fue anónimos y no identificable antes del análisis.
Pacientes y métodos
Pacientes y muestras de tejidos
tejido tumoral primario de 535 prostatectomía radical (PR) de los pacientes diagnosticados en el hospital de la Universidad del Norte de Noruega, el hospital St. Olav y el hospital Nordland 1995-2005 se utilizaron en este estudio. embebidos en parafina de tejido bloques adecuados y datos demográficos y clínico-patológicas completas se obtuvieron para todos los pacientes (Tabla 1). Los tumores fueron clasificados según el sistema de clasificación de Gleason modificado [16] y llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la OMS [17]. Todos los tejidos primarios fueron examinados histológicamente por dos patólogos (ER) y LTB.
miARN detección
Para miARN perfiles, 30 pacientes dentro de la puntuación de Gleason (GS) 7 subgrupos se eligieron de forma consecutiva , 14 de ellos con una rápida BF fallo bioquímico (PSA≥0.4 ng /ml en los 24 meses posteriores a la cirugía) y 16 pacientes sin BF. GS 7 se eligió ya que estos pacientes muestran un resultado clínico heterogéneo. Los miRNAs se identificaron por hibridación de microarrays y cuantificados con RT-qPCR (Tabla 2). Un total de 1435 miRNAs se cuantificaron mediante hibridación de microarrays y miRNAs con la desviación estándar más alto (n = 50) fueron seleccionados validado por cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR). Siete miRNAs fueron identificados como los más altura o hacia abajo-regulado. De éstos, el miR-21 fue el único candidato MIR que fue significativamente hasta reguladas por factor de cambio. a continuación, miR-21 se investigó la expresión en toda la cohorte de cromógeno
en
situ
hibridación (CISH) y evaluado como marcador pronóstico para PC. Tanto las células epiteliales tumorales y áreas del estroma asociados a tumores fueron investigados por separado. El tiempo medio de seguimiento fue de 89 meses (rango 6-188). La última actualización de los pacientes fue de noviembre de 2012.
Microarray construcción
Tissue Microarray construcción (TMA) fue elegido para el análisis de alto rendimiento de la patología molecular [18]. Para cada caso, un patólogo (ER) identificada histológicamente y marcado dos núcleos con áreas de células tumorales (células tumorales epiteliales), dos núcleos con tejido estromal tumor, un núcleo de áreas con células epiteliales normales, y un núcleo con tejido estromal normal. El TMA se ensamblaron utilizando un instrumento formar clusters de tejido (Beecher Instruments, Silver Springs, MD, EE.UU.). En pocas palabras, se utilizó una aguja de 0,6 mm de diámetro para cosechar las áreas de tejido son grandes con las correspondientes (FFPE) bloquea tejido incluido en parafina fijado en formol. Las muestras se insertan en un bloque de parafina receptor vacío de acuerdo con un patrón de coordenadas. Para incluir todas las muestras del núcleo, se construyeron doce bloques de la matriz de tejido. Múltiples 4 micras secciones se cortaron con un microtomo Micron (HM355S), colocada en portaobjetos de vidrio, y se sellaron con parafina. La metodología detallada se ha informado anteriormente [19].
extracción de RNA
Se aisló ARN de las muestras incluidas en parafina fijadas con formalina con RecoverAll total de ácidos nucleicos kit de aislamiento de tejidos FFPE (Life Technologies) , y fue enviado a Exiqon (Vedbaek, Dinamarca), que lleva a cabo el experimento de detección de miRNA. El tejido utilizado para la extracción de RNA fue tres 4 mm de profundidad, 0,6 mm de diámetro núcleos cilíndricos cosechadas de compartimientos tumorales son de las FFPE bloques. El microarray utilizado fue LNA matriz 6
ª generación humana, de rata y de microarrays viral diseñado con una biblioteca con 1.435 miARN humanos, ratas y miARN viral. El ARN total (500 ng) de tanto de la muestra y la referencia se marcó con HY3 y la etiqueta fluorescente HY5, respectivamente, usando el kit de marcado de miRCURY LNA microRNA Hi-Power, HY3 /hY5 (Exiqon, Dinamarca) siguiendo el procedimiento descrito por el fabricante. Las muestras marcadas con HY3 y una muestra de ARN de referencia marcado con hy5 se mezclaron por pares y se hibridan a la matriz de 6 de miRCURY LNA microARN Gen (Exiqon, Dinamarca), que contiene sondas de captura dirigidas a todos los microARN para humanos, de ratón o rata registrada en el miRBase 16.0. La hibridación se realizó de acuerdo con el manual de instrucciones de matriz miRCURY LNA microARN utilizando una estación de hibridación Tecan HS4800 (Tecan, Austria). Después de la hibridación, los microarrays diapositivas fueron escaneados y almacenados en un ambiente libre de ozono (nivel de ozono por debajo de 2,0 ppb) con el fin de evitar la posible blanqueo de los tintes fluorescentes. Las diapositivas de matriz miRCURY LNA microARN fueron escaneados utilizando el Sistema Agilent G2565BA escáner de microarrays (Agilent Technologies, Inc., EE.UU.) y el análisis de imágenes se llevó a cabo utilizando el ImaGene 9 (LNA miRCURY microARN matriz de software de análisis, Exiqon, Dinamarca). Las señales cuantificadas con corrección de fondo y se normalizaron utilizando el Lowess mundial (Diagrama de dispersión LOcally tabuladas Smoothing) algoritmo de regresión.
Cuantificación de miRNAs maduros por qPCR en tiempo real
Los criterios para la selección de miRNAs para la validación de PCR estaba; significativa de valor P, alto factor de cambio y plausibilidad antes. El miRNAs elegidos para realizar más pruebas eran de miR-21, miR-141, miR-23a, miR-222, miR-205, miR-143 y miR-145 (Tabla 2). Todos en tiempo real qPCR experimentos se realizaron por Exiqon (Vedbaek, Dinamarca).
ARN (2 l) fue transcrito inverso en 10 l reacciones utilizando el miRCURY LNA universal RT PCR microARN, poliadenilación y kit de síntesis de ADNc (Exiqon ). cDNA se diluyó 100 x y se ensayó en 10 l reacciones de PCR de acuerdo con el protocolo para miRCURY LNA universal RT microRNA PCR; cada microRNA fue ensayada por triplicado por qPCR en el microARN por encargo panel de pick-n-mix. Los controles negativos con exclusión de plantilla a partir de la reacción de transcripción inversa se efectuó y se perfilan como las muestras. La amplificación se realizó en un 480 Sistema de PCR en tiempo real LightCycler (Roche) en placas de 384 pocillos. Las curvas de amplificación se analizaron mediante el software Roche LC, tanto para la determinación de punto Crossing (Cp) por el método derivado de segundo, y para la fusión de análisis de la curva.
La eficiencia de amplificación se calculó utilizando algoritmos similares al software LinReg . Todos los ensayos fueron inspeccionados para las curvas de fusión distintos y la temperatura de fusión (T
m) se comprobó que estar dentro de las especificaciones conocidas para el ensayo. Además ensayos se detectó por 5 de Cp menor que el control negativo, y con Cp & lt; 37 a ser incluidos en el análisis de datos. Los datos que no pasan estos criterios se omitieron de cualquier análisis adicional.
Uso NormFinder la mejor normalizador se encontró que el miR-23b. Todos los datos se normalizaron a este miARN en todas las muestras (miR-23b - Cp ensayo).
In situ
hibridación
cromógeno
en
situ
hibridación (CISH) se realizó de acuerdo con "One-día protocolo microRNA ISH" desarrollado por Exiqon, Vedbek, Dinamarca. Etiquetado ácido nucleico bloqueado (LNA) modificado sondas de Exiqon para el miR-21 (HSA-mir-LNA 21miRCURY Art. nº 38102-15), control positivo (U6 tiene /MMU /RNO) y controles negativos (scramble-miARN) se usado. Algunas optimizaciones del método se realiza para obtener una detección específica y sensible de miARN en nuestras secciones de FFPE TMA.
Se incubaron 4 micras TMA diapositivas durante tres días a 37 ° C para fijar los núcleos de súper helada Plus diapositivas . Las secciones se deparaffinised en xileno (3 × 5 min) y luego hidratado para soluciones de etanol a PBS, pH 7,4. Proteinasa-K 20 micras /ml, el tratamiento se realizó en PK-tampón (5 mM Tris-HCL, pH 7,5, NaCl 1 mM, en autoclave) a 37 ° C durante 20 min en un hybridizer ThermoBrite. Después de lavado con PBS, las secciones se rehidrataron a través de etanol y se secó al aire. Los LNA-sondas se desnaturalizaron por calentamiento a 90 ° C durante 4 minutos. La hibridación de las sondas de LNA-miR-21 (50 nM), revueltos miRNA (50 nM) y U6 (1 nM) se llevaron a cabo en un hybridizer ThermoBrite a 50 ° C durante 60 min. lavados astringentes se realizaron en la temperatura ambiente 5x tampón SSC, tampones pre-calentadas SSC (50 ° C), 5 min en SSC 5x, 2 × 5 min en 1 x SSC, 2 x 5 min en 0,2 SSC, y 5 min en RT 0.2 x SSC. Las secciones fueron bloqueadas contra la unión no específica en solución de bloqueo de DIG lavar y tampón bloque de ajuste (11 585 762 001, Roche, Mannheim, Alemania) durante 15 minutos a temperatura ambiente en una cámara húmeda. La fosfatasa alcalina (AP) conjugada contra DIG (11 093 274 910, Roche, Mannheim, Alemania) 1:800 se incubó durante 30 min a RT en una cámara de humedad para la detección inmunológica. Después de PBS-T lavar las reacciones enzimáticas del sustrato se llevó a cabo con NBT /BCIP (11 697 471 001, Roche, Mannheim, Alemania) a 30 ° C en el ThermoBrite de 120 min. La reacción se detuvo con una min de lavado 2 × 5 en tampón KTBT (50 nM Tris-Hcl, 150 nM NaCl, KCI 10NM), seguido de lavado en agua doblemente destilada. Las secciones fueron teñidas con marcador rojo rápido nuclear (Waldeck, ZE-012 a 250) a TA durante 1 min y luego se enjuaga con agua del grifo. La deshidratación se llevó a cabo mediante el aumento de los gradientes de soluciones de etanol y por último montaje con Histokitt medio de montaje (Asistente-Histokitt, 1025/250 Sondheim /Rhoen Alemania).
La puntuación de CISH
Se realizó el análisis de imágenes utilizando el sistema de imágenes ARIOL (Genetix, San José, EE.UU.) que componen de un microscopio (Olympus BX 61) equipado con una etapa automática y el cargador de diapositivas, junto con una cámara. Los núcleos fueron fotografiados utilizando 20x aumentos. La intensidad de la tinción dominante en las células tumorales epiteliales y del estroma tumoral que rodea las células se anotó como; 0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = fuerte. Todas las muestras se obtuvieron de forma independiente y anónimos por dos patólogos (ER y AV). Al evaluar una variable para un núcleo dado, los observadores fueron cegados a las puntuaciones de las otras variables y dependiendo del resultado. La media de puntuación para cada caso se calcula a partir de los cuatro núcleos y dos examinadores. En caso de desacuerdo (discrepancia score & gt; 1), los portaobjetos se revisarán y se llegó a un consenso por los observadores
Métodos estadísticos
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico IBM. SPSS, versión 21 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) (S1). Los valores de puntuación de cada patólogo se compararon para la fiabilidad entre observadores mediante el uso de un modelo de efectos aleatorios de dos vías con la definición acuerdo absoluto. Se utilizó una prueba de rangos con signos de Wilcoxon para evaluar si había una diferencia estadísticamente significativa en la expresión de miR-21 entre el tejido normal y el tejido de cáncer. Al comparar los dos grupos de la muestra (BF frente al grupo no-BF) a partir de los resultados qPCR, se utilizó la prueba t de Student bilateral. Para toda la cohorte, se realizaron pruebas de Pearson chi-cuadrado y la prueba de correlación de Spearman para examinar las asociaciones entre la expresión de miR-21 y marcadores clínico-patológicos. El método de Kaplan-Meyer fue utilizada para hacer gráficos de BFFS y CFFS. Se utilizó la prueba de log-rank para la prueba de significación estadística. Las variables significativas de los análisis univariados se evaluaron más en el análisis de supervivencia multivariante mediante un modelo de regresión de Cox por pasos hacia atrás con una probabilidad para la eliminación gradual de entrada en 0,05 y 0,10, respectivamente. El nivel de significación utilizado fue de p & lt; 0,05 para todos los análisis. Todos los análisis de supervivencia se llevó a cabo utilizando tres diferentes puntos finales: (i) la supervivencia libre de progresión bioquímica (BFFS), (ii) el fracaso clínico supervivencia libre (CFFS), y (iii) la muerte PC supervivencia libre (PCDF). BF se caracterizó como un PSA≥0.4 ng /ml y el aumento en un mínimo de dos muestras diferentes de sangre después de la operación. CF se definió como verificado progresión local sintomática y /o metástasis verificadas a los huesos, órganos viscerales o los ganglios linfáticos en la TC, RM, gammagrafía ósea o la ecografía. PCDFC se define como muerte causada por PC progresiva.
Resultados
Características de los pacientes y las variables clinicopatológicas
cohorte total.
Una visión general de la cohorte de pacientes de características demográficas, clínicas e histopatológicas se presentan en la Tabla 1. La mediana de edad en la cirugía fue de 62 (rango 45-75). Las prostatectomías eran retropúbica en 435 casos y perineal en 100 casos. Al final del seguimiento, 170 pacientes habían experimentado BF, CF 36, y 15 pacientes habían muerto de PC.
miARN detección de subgrupos.
En los 30 pacientes con una puntuación de Gleason 7 que se sometió a miARN cribado, mediana de edad fue de 65 años (rango 57-71), mediana de PSA de 18,8 ng /ml (rango 5-79), el tamaño medio del tumor de 22 mm (rango 3-45), el 21% experimentó CF y el 14% estaban muertos de próstata cáncer. En el grupo total de pacientes con puntuación de Gleason 7 (n = 270), mediana de edad fue de 62 (rango 47-74), la mediana de PSA de 18,0 ng /ml (rango de 0,7 a 71), el tamaño medio del tumor de 23 mm, 22% CF experimentado y el 9% estaban muertos de cáncer de próstata. Ninguna de estas diferencias fue estadísticamente significativa.
detección de microarrays y qPCR validación
600 de 1435 miRNAs investigados por microarrays, tenía la expresión por encima de la fuerza de fondo (señal de fondo se define como 1,2 veces la intensidad de la 1 -quartile cada diapositiva) (Tabla 2). De éstos, se analizaron más de 50 miRNAs con la más alta desviación estándar (SD). Desde el análisis de microarrays, una agrupación jerárquica-2D mostró un nivel de expresión relativa de miRNAs que son regulados hasta en ambos grupos (Figura 1a). Los niveles de expresión de miRNAs 7 fueron validados por RT-qPCR (Tabla 3, Figura 1a). Cinco de los siete miRNAs analizados mostraron tendencia similar en los dos grupos. El diagrama de mapa de calor muestra el resultado de la de dos vías agrupación jerárquica del nivel de expresión de los cinco miRNAs. La puntuación z fue recortar desde -2 a +2 (más Figura 1b). miR-21 fue el único miARN que fue significativamente hasta reguladas en el grupo BF. Esto estaba en concordancia con los resultados de la matriz. Hubo una fuerte correlación entre la matriz y la hibridación QRT-PCR.
a) niveles de expresión relativa de 50 miRNAs que fueron expresadas en las 30 muestras de tejidos emparejados con puntuación de Gleason 7. El eje X muestra los individuos y el eje Y muestra miRNAs. cuadrados rojos codifican para un máximo regulado miRNAs y cuadrados verdes para codificar miRNAs reguladas por. b) Mapa de Calor resultados de la agrupación jerárquica de dos vías basado en la qPCR resultados. El miRNAs mostraron la misma tendencia en la validación qPCR y en el análisis de microarrays. Los valores normalizados (DCP) se han utilizado para el análisis. El color rojo representa un nivel de expresión por encima de la media, de color azul representa la expresión más baja que la media.
La expresión de miR-21 y correlaciones en la cohorte total
En general, miR-21 se expresa a un nivel superior en las zonas del estroma del tumor que en las células epiteliales tumorales (Figura 2). La intensidad de la expresión de miR-21 era más fuerte en el citoplasma de tejido tumoral en comparación con los tejidos normales de los pacientes (p & lt; 0,001). No hubo diferencia en la expresión de miR-21 entre las células epiteliales tumorales y las células epiteliales normales. Una expresión significativamente mayor de miR-21 se encuentra en la zona del estroma tumoral que en el área del estroma no neoplásica (p & lt; 0,001). Mediante la comparación de las células epiteliales tumorales con las células del estroma tumoral, miR-21 se expresó en niveles más altos en las células del estroma tumoral (p & lt; 0,001).
Se encontraron correlaciones significativas entre la expresión del estroma tumoral elevada de miR-21 y pT-etapa (
r = 0,134
, p = 0,003), la infiltración perineural (PNI) (
r = 0,175
, p & lt; 0,001) y la infiltración vascular (
r
= 0,222 p & lt; 0,001). Encontramos una correlación débil entre la expresión del estroma de miR-21 y la puntuación de Gleason (
r = 0,218
, p & lt; 0,001). También hubo correlaciones significativas entre la expresión del estroma de miR-21 y la puntuación de Gleason (GS); GS & lt; 7, GS 7 y GS & gt; 7 (r = 0,238, p & lt; 0,001).
No hubo diferencias en la expresión del estroma de miR-21 entre los subgrupos de puntuación de Gleason, 3 + 4 (n = 220, 41%) y 4 + 3 (n = 80, 15%) (r = - 0,001, p = 0,991)
El análisis univariante
El variables clínico pT-etapa (. p & lt; 0,001), el valor de PSA preoperatorio dicotomizada a 10 ng /dl (n = 221, p & lt; 0,001), la puntuación de Gleason (p & lt; 0,001), tamaño del tumor dicotomizaron a 20 mm (n = 285, p & lt; 0,001), la infiltración perineural (PNI) (no = 134, P & lt; 0,001), márgenes quirúrgicos positivos (PSM) (n = 286, p = 0,041), el margen circunferencial quirúrgico positivo (n = 154, p & lt; 0,001), el margen apical quirúrgico positivo (n = 210, p = 0,04), y la infiltración vascular (n = 43, p & lt; 0,001) se correlacionaron significativamente con BFFS en la supervivencia univariante análisis (Tabla 1)
el 4
ª se utilizó cuartil. como de corte. Una alta expresión de miR-21 en las zonas del estroma tumoral se correlacionó significativamente con BF (n = 170, p = 0,006, Figura 3a), y CF (n = 36, p = 0,041, no figura que se muestra.) No hubo correlación entre alta expresión del estroma de miR-21 y PCD (n = 14, p = 0,505).
b) Los pacientes con Gleason 6.
En los análisis de subgrupos que encontramos una expresión de alto estromal de miR-21 se asoció significativamente con un mayor riesgo de BF en pacientes con GS 6 (n = 167, p = 0,023, Figura S3b), pero esto no se encontraron resultados para los pacientes con GS 7 (n = 262, p = 0,228) , grado de Gleason 3 + 4 (n = 189, p = 0,0290, grado de Gleason 4 + 3 (n = 73, p = 0,818), y GS & gt;. 7 (n = 36, p = 0,895) también encontramos alta del estroma correlacionada con la expresión de BF para los pacientes con márgenes circunferenciales positivos (n = 139, p = 0,026), pero no para aquellos con márgenes circunferenciales libres (n = 339, p = 0,107).
el análisis multivariado
marcadores clínico-patológicos y moleculares significativos relativos a análisis univariante se introdujeron en el modelo multivariado. La Tabla 4 presenta los factores pronósticos independientes para BF; pT-etapa (p = 0,001), grado de Gleason (p = 0,021), no apical PSM (n = 286, p = 0,001), apical PSM (n = 210, p = 0.003). Para CF; Gleason (p = 0,013), PNI (n = 134, p = 0,028), no apical PSM (p = 0,028).
La expresión de alto estromal de miR-21 fue un factor pronóstico independiente para BF en pacientes con Gleason 6 (n = 167, HR 2,40, IC del 95%: 1,06 a 5,49; p = 0,037). Existe una asociación significativa entre la expresión máxima del estroma de miR-21 y BF también se encontró en el subgrupo de pacientes con PSM (HR 1,95, IC del 95%: 1,95 a 3,21; p = 0,008). Sin embargo, para toda la cohorte (n = 471), sólo hubo una tendencia hacia una asociación independiente entre la expresión del estroma de miR-21 y BF (n = 170, p = 0,089). La expresión de alto estromal de miR-21 no fue un factor pronóstico independiente de CF (n = 36, p = 0,395).
Discusión
En este estudio, se encontró una mayor expresión de miR 21 en los tejidos de cáncer en comparación con el tejido prostático normal. La expresión fue mayor en las zonas del estroma tumoral. expresión del estroma tumoral elevada de miR-21 fue un factor pronóstico independiente de recidiva bioquímica en pacientes con Gleason 6, pero no el fracaso clínico, probablemente debido a algunos eventos en el último grupo. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que informó la expresión del estroma tumoral de miR-21 como marcador pronóstico de BF después de la prostatectomía radical. Por otra parte, también encontramos una expresión elevada del estroma ser un marcador independiente de PSM en la pieza de PR.
Estudios recientes han demostrado que los miRNAs son significativamente alteradas en el cáncer de próstata, lo que sugiere que los miRNAs actúan como reguladores clave de la carcinogénesis de próstata. Se han realizado varios estudios para identificar los genes miARN la firma-PC específico, pero n se ha alcanzado consenso con respecto al papel de los miRNAs en el desarrollo y progresión de la PC [20], [21]. En un estudio realizado por Violinia et al. [22], el ARN total fue extraído de 363 cánceres sólidos, incluyendo cáncer de próstata, y 177 tejidos normales. Encontraron una regulación general de 39 miRNAs, incluyendo el miR-21, mientras que 6 miRNAs se redujeron reguladas. Estos resultados estaban de acuerdo parcial con un estudio realizado por Ambs et al. en el que el ARN total extraído a partir de 60 PC micro-diseccionado y 16 tejidos no tumorales circundantes se analizaron [23]. MiR-21 es generalmente considerado como un oncogén, pero hasta ahora su papel en la PC no está clara y los informes han sido contradictorios [11], [12], [14], [20]. miR-21 se ha encontrado para ser elevados en PC3 y DU145 líneas de células independientes de andrógenos [24]. Por otra parte, miR-21 se identificó como un miARN regulado por receptor de andrógenos cuyo nivel fue elevado en PC comparación con el tejido normal adyacente [12]. Inhibiciones de miR-21 disminuyen la proliferación celular inducida por andrógenos PC, mientras que la expresión elevada de miR-21 promueve mejores crecimiento tumoral y la resistencia a la castración
en
in vivo
[12]. Otros también han encontrado miR-21 hasta reguladas en pacientes con PC hormonas y quimioresistente [13], [15].
Hemos encontrado que una expresión del estroma tumoral elevada de miR-21 en tumores con Gleason 6 BF predicho. Esto está en consonancia con los informes anteriores [25]. Estromal miR-21 análisis de la expresión puede ser una herramienta potencial para predecir qué tumores altamente diferenciadas que tiene más probabilidades de progresar. Estudios recientes han proporcionado información valiosa para aclarar la involment de miR-21 en microambiente tumoral: Bullock et al. [26] demostraron que upregulated miR-21 expresión se produce en las células del estroma asociadas con el cáncer, pero no en las células de cáncer colo-rectal. Por otra parte, encontraron que ectópico miR-21 expresión en fibroblastos modula el impacto citotóxico de Oxaliplatino (chemotherapheutic usado en el tratamiento de cáncer de colon), que dio lugar a la progresión del cáncer. Bronisz et al. [27] demostraron que la regulación a la baja de miR-320 en los fibroblastos del estroma mamario reprograma el microambiente del tumor mediante la activación de un secretoma pro-oncogénica, y curiosamente, Yao et al. [28] informó de que los miofibroblastos transdiferenciación de fibroblastos progenitoras en respuesta a TGF-β se podría evitar el uso de inhibidores antisentido específicos de miR-21. En conjunto, estos datos sugieren influencia pro-metastásico de los ARNm en la diferenciación de fibroblastos y el fenotipo, y que miR-21 pueden ser mediados a través de la microambiente tumoral. Sin embargo, la evidencia biológica y funcional para apoyar estos resultados, especialmente carcinomas de próstata, es limitada.
Es bien sabido que menos del 3% de los pacientes con Gleason score≤6 jamás progresar tratados o no, y que un porcentaje sustancial de estos pacientes continúan someterse a un tratamiento innecesario después de un diagnóstico de bajo riesgo PC (basado en un PSA & lt; 10 ng /ml y ≤ etapa T2a) [29], [30]. Estromal miR-21 análisis de la expresión puede ser una herramienta potencial para predecir qué tumores altamente diferenciadas que tiene más probabilidades de progresar. Más estudios para aclarar el papel exacto de miR-21 en estos tumores altamente diferenciados son necesarios. En contraste con los informes anteriores, encontramos una alta expresión de miR-21 en pacientes con márgenes quirúrgicos positivos, [25]. Los mecanismos moleculares de esto son desconocidas.
Los resultados divergentes de miR-21 en diferentes estudios podrían reflejar la heterogeneidad de PC, así como diferente diseño del estudio y la metodología. Un examen de miARN de toda la cohorte habría fortalecido nuestro estudio. Además, la calidad de los tejidos examinados (incluyendo la manipulación) puede afectar drásticamente la interpretación de los datos de microarrays. Además de los datos interesantes sobre BF, nuestro estudio es un tanto limitada por el bajo número de casos con recaída clínica o PCD. Otros estudios de este microARN y sus vías asociadas pueden descubrir nuevos mecanismos para la progresión del cáncer y la intervención terapéutica.
Conclusión
Este estudio sobre miARN perfiles y validación en el cáncer de próstata añade una prueba más de miR-21 como marcador pronóstico para PC. Estos resultados indican que la expresión del estroma de miR-21 tiene un papel importante en la progresión de la enfermedad, pero el mecanismo subyacente necesita de mayor investigación.
Información de Apoyo
archivo S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0113039.s001 gratis (postal)
Reconocimientos
Agradecemos a los técnicos de laboratorio que participan en el Departamento de Patología de la UNN por su apoyo y habilidades técnicas. Especialmente queremos agradecer a Magnus Persson, Mona Pedersen y Marit Nilsen Nina, Christopher Fenton, Øystein Størkersen y Anders Angelsen.