general desfavorable
Extracto
La evidencia reciente vincula la activación aberrante de Hedgehog (Hh) de señalización con la patogénesis de varios tipos de cáncer, incluyendo meduloblastoma, glioblastoma, melanoma, así como el páncreas, colorrectal, y carcinomas de próstata. Aquí hemos investigado el papel del factor de transcripción Gli1 en el cáncer de ovario. Para este fin, el perfil de expresión de Gli1 se examinó en los ovarios normales, tumores ováricos, y líneas celulares de cáncer de ovario, y el
in vitro
efectos de un bloqueador específico Hh-vía, KAAD-ciclopamina, o una específica también se evaluaron inhibidor Gli1 (GANT58) sobre la proliferación celular y en Hh expresión del gen diana. Los resultados obtenidos mostraron que las células epiteliales en el tejido de cáncer de ovario expresan niveles significativamente más altos de Gli1 nuclear que en el tejido ovárico normal, donde la proteína era casi indetectable. Además, el análisis multivariante mostró que Gli1 nuclear se asoció de forma independiente a la mala supervivencia en pacientes avanzados de cáncer de ovario seroso (IC HR = 2,2, 95% 1,0-5,1, p = 0,04).
in vitro
experimentos demostraron la expresión Gli1 en las tres líneas celulares de carcinoma de ovario probados, A2780, Skov-3 y OVCAR-3. Sorprendentemente, aunque KAAD-ciclopamina condujo a la disminución de la proliferación celular, este tratamiento no inhibió la expresión de genes objetivo hedgehog en cualquiera de las tres líneas celulares de cáncer de ovario, lo que sugiere que la inhibición de la proliferación celular era un efecto no específico o tóxico. De acuerdo con estos datos, no se observaron diferencias en la proliferación celular cuando las líneas de células se trataron con GANT58. En general, nuestros datos clínicos apoyan el papel de Gli1 como marcador pronóstico en el cáncer de ovario seroso avanzada y como una posible diana terapéutica en esta enfermedad. Sin embargo, nuestros
in vitro
hallazgos llaman la atención sobre la necesidad de una selección de modelos experimentales adecuados que representan con precisión tumores humanos para probar terapias futuras que implican inhibidores de la vía Hh
Visto:. Ciucci A, De Stefano I, Vellone VG, Lisi L, Bottoni C, Scambia G, et al. (2013) La expresión del glioma asociada homólogo de oncogén 1 (Gli1) en Avanzada seroso de ovario cáncer está asociado con la supervivencia global desfavorable. PLoS ONE 8 (3): e60145. doi: 10.1371 /journal.pone.0060145
Editor: Nils Cordes, Universidad de Tecnología de Dresden, Alemania |
Recibido: 7 de noviembre de 2012; Aceptado 22 de febrero de 2013; Publicado: 28 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Ciucci et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de ovario
epitelial es una de las principales causas de. muerte en mujeres tumores malignos en la gran mayoría de los países desarrollados [1]. De hecho, ya que esta enfermedad tiene pocos síntomas en las primeras etapas de su desarrollo, la mayoría de las mujeres son diagnosticadas después de que el tumor primario ya ha hecho metástasis; a pesar de la respuesta inicial a la citorreducción quirúrgica y el tratamiento de primera línea con carboplatino y paclitaxel, la mayoría de los tumores eventualmente desarrollan resistencia a los medicamentos y la supervivencia a 5 años es generalmente inferior al 30% [2]. señal, aunque se han hecho muchos esfuerzos para aclarar la etiología de la carcinogénesis de ovario y de los mecanismos moleculares implicados en la proliferación de células de carcinoma de ovario, esta enfermedad sigue siendo uno de los menos entendidos de los cánceres malignos humanos.
El Sonic hedgehog (Shh) -transduction vía es importante en la regulación de los patrones, la proliferación, la supervivencia y el crecimiento de muchas células y tejidos, en el embrión y del adulto. La unión del secretora ligandos Hh (Sonic, indio o del desierto, SHH, IHH o DHH) a su receptor transmembrana Patched (Ptch1) inicia la vía clásica de señalización Hh mediante la liberación de Smoothened (SMO) de la supresión Ptch1-dependiente. Smo modula un complejo citoplasmático que contiene supresor del fusible (Sufu), activando así los 3 (Gli) reguladores de la transcripción de glioma asociado. induce Gli1 y Gli3 reprime genes Hh objetivo que incluyen
Gli1
,
PTCH1
,
Ciclina D1
,
c-Myc
, y
Bcl -2
, mientras que Gli2 puede actuar ya sea en una forma positiva o negativa dependiendo de eventos de procesamiento posttranscriptional y postraduccionales [3].
activación aberrante de la señalización de Hh ha sido implicada en varios tipos de cáncer, incluyendo la piel, el cerebro , colon, pulmones, próstata, sangre y el páncreas, entre otros, impulsado ya sea por un ligando dependiente o una vía independiente de ligando [4], [5]. vía Hh dependiente de ligando puede ser o bien autocrina, donde el ligando Hh producido por las células tumorales actuar sobre las células tumorales vecina causando activación de la vía de células autónomas, o puede implicar un mecanismo paracrino donde Hh ligando secretado desde el epitelio señala el compartimiento del estroma subyacente para crear una microambiente favorable que propicia el crecimiento del tumor. señalización autocrina se ve en caso de cáncer de pulmón y de próstata, mientras que en caso de cáncer de ovario y colorrectal el mecanismo paracrino parece prevalente [4], [5]. En la señalización independiente de ligando, la vía de Hh se activa en una celda de manera intrínseca a través de mutaciones de pérdida de función en los componentes de acción negativas, como Ptch1 y Sufu, o por medio de mutaciones de ganancia de función en los componentes de acción positiva , como Smo [4]. Además, la señalización de Hh-Gli interactúa con otras vías de señalización en vías bidireccionales y de contexto específico, y varias líneas de evidencia sugieren que la regulación dependiente del contexto del código Gli por oncogenes y supresores de tumor constituye una base para la participación generalizada de Gli1 en los cánceres humanos, esta proteína de soporte progresión del tumor y la transición metastásico [6], [7]. Cabe destacar que, en el cáncer de ovario, la vía Hh podría también interactuar con el estrógeno señalización en una red compleja modulación de la plasticidad fenotípica [8].
En el presente estudio hemos tratado de determinar si la vía de Hh se activa en el ovario cáncer. Con este fin lo primero que investigó mediante inmunohistoquímica la expresión de la proteína Gli1 en el epitelio superficial del ovario normal y en los cánceres ováricos serosos avanzada y su expresión se correlacionó con los parámetros clínico-patológicos y resultados de los pacientes. A continuación, se analizó la expresión de Gli1 en líneas celulares de cáncer de ovario, y el
in vitro
efectos de un bloqueador específico vía hedghehog, KAAD-ciclopamina [9], [10] o un inhibidor específico Gli1, GANT58 [ ,,,0],11], en la proliferación celular y en la expresión de genes objetivo hedgehog. Gli1 es actualmente considerada como la última y por lo tanto fundamental activador transcripcional de la vía Hh; su transcripción es inducida por la señalización de Hh, lo que, hasta el momento, el mejor marcador confiable de una vía activa, que se transcribe consistentemente en las células que responden Hh-[7]. Además, Gli1 ha sido considerado como una diana adecuada para la terapia del cáncer, ya que se encuentra aguas abajo de varias vías de señalización [12].
Materiales y Métodos
Ética Declaración
En este estudio se obtuvo la aprobación del Comité ético de la Universidad Católica del Sagrado corazón, Roma, Italia y los pacientes dieron su consentimiento por escrito para la recogida de tejidos y análisis.
los pacientes
en el estudio participaron 56 pacientes con cáncer avanzado de ovario seroso ingresados en la Unidad de Oncología Ginecológica, Universidad Católica de Roma, entre marzo de 2000 y diciembre de 2008. macroscópica e histológicamente normales ovarios, retirado por razones profilácticas, también se obtuvieron de 12 mujeres posmenopáusicas. características clinicopatológicas de la serie en general se resumen en la Tabla 1. De acuerdo con las directrices estándar, esfuerzo quirúrgico máximo se intentó en todos los pacientes que resultan en la resección completa (tumor residual 0 mm) en 35 (63%) casos. Todos los pacientes recibieron quimioterapia basada en platino (75-100 mg /m
2 para el cisplatino, AUC = 5 para el carboplatino, por ciclo). Cincuenta pacientes (89,3%) también recibieron paclitaxel (135-175 mg /m
2 para cada ciclo). La recurrencia de la enfermedad se definió según los criterios GCIG CA125 [13], [14] y /o la confirmación radiológica de la progresión del tumor. Para definir la quimiosensibilidad, se utilizó la definición común de resistencia de platino, que define como pacientes "sensibles" que recayeron 6 meses o más después de la quimioterapia con platino antes, y como pacientes "resistentes" que recayeron menos de 6 meses después de la quimioterapia se detuvo, o que progresaron durante el tratamiento [15]. había datos de seguimiento disponibles para los 56 pacientes (mediana de seguimiento de 35 meses,; rango, 9-127 meses). Durante el período de seguimiento, se observó progresión y muerte de la enfermedad en 42 y 23 pacientes, respectivamente.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó como se describió anteriormente [16]. Brevemente, el procedimiento de recuperación de antígeno se llevó a cabo por calentamiento por microondas horno en tampón de citrato (pH = 6). Las secciones se incubaron con suero de cabra normal al 20% durante 30 min a temperatura ambiente para reducir la unión no específica. Las células que expresan Gli1 (clon H-300, SC-20687, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, dilución 1:50), se identificaron después de la incubación durante la noche a 4 ° C. Anticuerpo utilizado en el presente estudio se ensayó para determinar la especificidad como se describe anteriormente [17] - [20]. Las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo) durante 30 min, a temperatura ambiente. Los portaobjetos se desarrollaron con (sistema de sustrato DAB, DakoCytomation) diaminobencidina, a contratinción con hematoxilina de Mayer, se deshidrataron en etanol y xileno, y finalmente montadas. carcinoma de células basales se utilizó como control positivo. La tinción sin anticuerpo primario se utilizó como control negativo.
Evaluación de la tinción inmunohistoquímica
La expresión se evalúa teniendo en cuenta el porcentaje de células que presentan inmunorreacción en un mínimo de 500 células neoplásicas histológicamente identificados. Se observó tinción Gli1 tanto en el citoplasma y en el núcleo en las células de carcinoma de ovario. Sin embargo, como Gli1 es un factor de transcripción, única expresión Gli1 nuclear se anotó para los análisis de datos posteriores y estudios de correlación. La inmunotinción fue evaluada por dos observadores independientes (GFZ y VGV) que no tenían conocimiento del diagnóstico de los pacientes. Para definir un valor de corte para Gli1, se comparó la inmunorreactividad nuclear medido en tejidos normales frente a tumorales. La inmunorreactividad estaba ausente en las células epiteliales de todas menos una ovarios normales, con un solo espécimen que muestra una reacción de tinción débil en aproximadamente 10% de las células. secciones tumorales en las que & gt; se tiñeron 10% de las células se consideran por lo tanto ser positivo
Cell Cultura y
Las líneas celulares de carcinoma de ovario A2780, Skov-3 y OVCAR-3 fueron adquiridos a. la Colección Europea de cultivos celulares (ECACC, Salisbury, Reino Unido). células OVCAR-3 y A2780 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Lonza, Basilea, Suiza), SKOV-3 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Lonza). El medio se suplementó con 10% de suero fetal bovino (FBS, Lonza), glutamina 2 mM y antibióticos (100 mg /ml de estreptomicina y 100 IU /ml de penicilina) (Lonza). Todos los cultivos se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire.
inmunocitoquímica
Las células (2,0 a 4,0 × 10
4 células /pocillo) colocaron en portaobjetos de dos pozos cámara (Nunc® Lab-Tek II cámara de diapositivas, Nunc, Inc., Naperville, IL). Las células se cultivaron durante 24 h y se utilizan para la inmunotinción. Los portaobjetos se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100. La peroxidasa endógena se bloqueó con 3% de H
2O
2 de 5 min. Después de lavar dos veces con PBS, las células se incubaron con una solución de bloqueo que contiene 20% de suero de caballo normal en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Se drenó el exceso de solución de bloqueo, y las muestras se incubaron con una dilución 1:50 de anticuerpo anti-Gli1 (clon H-300, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. Las muestras se enjuagaron a continuación tres veces con PBS y se incubaron con anticuerpo secundario, EnVision System-HRP (Dako, Carpinteria, CA), durante 30 min a temperatura ambiente. La inmunorreactividad se detectó utilizando el sustrato de 3,3'-diaminobencidina (sistema de sustrato DAB, Dako). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Mayer, se deshidrataron en etanol y xileno, y finalmente montadas.
Ensayo de proliferación
A2780 (3,0 × 10
4 por pocillo), OVCAR-3 (2,0 × 10
4 por pocillo) y SKOV-3 (2,0 × 10
4 por células pocillo) se sembraron en placas de 24 pocillos en medio de cultivo completo. Después de la incubación durante la noche, el medio se cambió a 2% FBS que contienen varias concentraciones de KAAD-ciclopamina (Santa Cruz Biotechnology), o GANT58 (Calbiochem, San Diego, CA). Las sustancias se disolvieron en DMSO absoluto y se diluyeron en el medio de cultivo apropiado inmediatamente antes del uso. Las células de control recibieron la misma cantidad de DMSO diluyente. Después de 48 h de incubación, las células se recogieron por tripsinización, y las células viables se contaron usando Nucleocounter (Chemometec, Allerod, Dinamarca). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces por duplicado.
MTT Ensayo
Todas las líneas celulares de cáncer de ovario se sembraron (4,0 × 10
3 por pocillo) en placas de 96 pocillos en completa medio cultural. Después de la incubación durante la noche, el medio se cambió a 2% FBS que contienen varias concentraciones de KAAD-ciclopamina (Santa Cruz Biotechnology) o GANT58 (Calbiochem). La citotoxicidad se cuantificó por medición de la reducción de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio, un tetrazol) para producir un producto de formazán azul oscuro. MTT se añadió a cada pocillo 48 h después del comienzo de la lesión. Después de 3 h de incubación, la solución de parada /solubilización se añadió a los pocillos de cultivo para solubilizar el producto de formazano, y la absorbancia a 570 nm registró usando un lector de placas de 96 pocillos (Victor 1420, Wallac, Perkin Elmer). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces por duplicado.
Análisis de Western Blot
extractos de células enteras se prepararon después de la lisis en un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 0,5% NP-40, 10% de glicerol suplementado con inhibidores de fosfato y de la proteasa. Cantidades iguales de proteína (50 mg /muestra) fueron separados por SDS poliacrilamida de gradiente de electroforesis en gel (4-20%) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), transferidos a membranas de PVDF (Immobilon-P de transferencia de membrana, Millipore, Billerica, MAMÁ). Las membranas se bloquearon durante 1 hora con 5% (w /v) de leche sin grasa seca en Tris Buffered Saline que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST) y se incubaron con anticuerpos primarios (Gli1: H300, Santa Cruz Biotechnology; ß-actina: A5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en TBST con leche seca no grasa al 3%, a 4 ° C durante la noche. Después de lavar tres veces con TBST, las membranas se marcaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas específicas se visualizaron con el sistema de transferencia de Western ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). El análisis de transferencia Western β-actina se realizó como un control de igual carga de la muestra.
Análisis de ARNm en PCR en tiempo real
ARN total fue extraído por medio de ARN total aislamiento NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel GmbH & amp; Co. KG) y fue transcrito de forma inversa usando el kit RETROscript (Ambion®, Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para evaluar los cambios cuantitativos en los niveles de ARNm de Gli1, cada mezcla de reacción de RT se después se sometió a PCR en tiempo real (Q-PCR) usando las siguientes condiciones de ciclo: 35 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 20 s; recocido y extensión a 60 ° C durante 20 s; utilizando el SYBR Brilliant III Ultra-Fast Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 20 l en una máquina de PCR en tiempo real MX3000P (Stratagene). Los cebadores de PCR para la detección de transcripciones específicas fueron las siguientes: Gli1, 5'-GCCAGCCAAGAGAGACCAACAG-3 'y 5'-CCGACAGAGGTGAGATGGACAG-3'; β-actina 5'-ACG CTA TTG TCC TCC CTG AGG AT-3 'y 5'-TTA ATG ACG TCA CGC CGC TCA TCC-3'. las concentraciones de ARNm relativos se calculan a partir del punto de despegue de las reacciones (ciclo umbral, CT) utilizando el método de cuantificación comparativo realizado por el software de Stratagene y se basa en el método -ΔΔCt. Este análisis se aproxima a la meta de una muestra dada mRNA (Gli1) nivel respecto a la media de los niveles de ARNm diana en los controles no tratados (valor "calibrador"), permitiendo así el análisis estadístico de desviación de la media, incluso entre los controles. Los valores de Ct para la expresión de β-actina sirvió como una señal de normalización. En cada ensayo, la eficiencia de PCR también se calculó utilizando dilución en serie de una muestra experimental; Se encontraron valores de eficiencia entre el 80 y el 100% para cada conjunto de cebadores y se tienen en cuenta para el análisis de cuantificación comparativa.
Análisis estadístico
La expresión de Gli1 y su asociación con parámetros clínico se evaluó utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global se calcularon a partir de la fecha del diagnóstico hasta la fecha de progresión /muerte, o la fecha visto por última vez. El efecto pronóstico de los diferentes parámetros en el resultado clínico (es decir, la recurrencia o muerte de la enfermedad) se puso a prueba mediante el trazado de las curvas de supervivencia según el método de Kaplan-Meier, y se compararon los grupos mediante la prueba de log rank, así como por el análisis multivariante utilizando el modelo de Cox . las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier se generan a partir de la fecha de diagnóstico histológico a la hora del último seguimiento o la muerte. En el análisis univariante, cada parámetro se clasificó para su posterior análisis estadístico. Sólo las variables con valor p ≤0.2 en el análisis univariado se incluyeron en el modelo multivariado. Los resultados obtenidos en
in vitro
en experimentos se expresaron como media ± desviación estándar y se analizaron mediante la prueba t-Student de dos colas. Las diferencias se consideraron significativas si P £ 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism5 (San Diego, CA, EE.UU.). análisis de Cox se realizó utilizando el StatPlus 2009.
Resultados
Expresión en Gli1 avanzada serosos Cáncer de ovarios
Un total de 56 cánceres ováricos serosos avanzada primarias y 12 tejidos ováricos normales de se evaluaron las mujeres posmenopáusicas. inmunorreactividad Gli1 estaba ausente en el epitelio de la superficie, así como en células estromales, de los ovarios normales (Fig. 1A) en todos menos un caso, este último que muestran una tinción nuclear débil en aproximadamente 10% de las células. Se observó una reacción nuclear positiva en 29% de los carcinomas serosos (Fig 1B.); inmunorreactividad citoplásmica también se observó en la mayoría de los especímenes examinados. Estos hallazgos indican que la vía de señalización Hh se activa en células de carcinoma de ovario en comparación con las células epiteliales normales.
imágenes representativos para Gli1 inmunotinción que muestra la expresión en el epitelio normal de ovario (A), y alto (B) o bajo (C ) expresión en tejidos de cáncer de ovario. carcinoma de células basales se utilizó como control positivo (D). Magnificación 20x, 40x y. curva de supervivencia (E) de Kaplan-Meier para la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad y (F) la supervivencia global de acuerdo con la expresión de Gli1 nuclear en pacientes con cáncer de ovario seroso avanzadas. Positivo (& gt; 10%) Gli1 expresión en el núcleo se asocia significativamente con la desventaja de supervivencia global (p = 0,04) guía empresas
La Tabla 2 muestra inmunoreactividad nuclear media de Gli1 en pacientes con cáncer de ovario seroso avanzada de acuerdo a. parámetros clínico. No se demostró la correlación entre la expresión Gli1 nuclear y cualquiera de los parámetros examinados.
El papel pronóstico de la expresión Gli1 tanto para SLE y la SG fue probado en univariante y multivariante para ajustar parámetros clínico. modelo univariante de DFS no detectó ninguna asociación entre la expresión Gli1 y el resultado clínico (Tabla 3, Fig. 1E). Por otro lado, utilizando el análisis de Kaplan-Meier se encontró que los pacientes con expresión positiva Gli1 tenían un pronóstico de supervivencia global desfavorable; la mediana de supervivencia global en esta población fue de 35 meses, mientras que se mantuvo sin definir para los pacientes negativos-Gli1, ya que más del 50% de ellos todavía estaban vivos en el momento del análisis (p = 0,04) (Tabla 4, Figura 1F). Cabe destacar que, en el modelo multivariado, Gli1 expresión nuclear retuvo un papel negativo en el pronóstico independiente para el sistema operativo (p = 0,04, Tabla 4).
Los factores pronósticos clásicos en el cáncer avanzado de ovario seroso
El papel pronóstico de la edad al momento del diagnóstico, el grado histológico, el tumor residual, y quimiosensibilidad tanto para SLE y la SG fue probado en los análisis univariados y multivariados (Tablas 3 y 4). Se encontraron [21] y el platino-resistencia a estar asociado con un mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad, en tanto univariado; La presencia de cualquier tumor residual en la cirugía primaria (0 mm & gt) (p = 0,003 y p & lt; 0,0001, respectivamente) y el análisis multivariado (p = 0,003 y p & lt; 0,0001, respectivamente). Platino resistencia también se encontró que era una variable pronóstica independiente desfavorables para el sistema operativo (p = 0,002).
Gli1 se expresa en células de carcinoma de ovario
Para investigar un posible papel para Gli1 en cáncer de ovario , primero se determinó el nivel de proteína en tres líneas celulares de carcinoma de ovario humano A2780, Skov-3 y OVCAR-3. El análisis inmunocitoquímico mostró Gli1 tinción nuclear en las tres líneas celulares (Fig. 2A). expresión de la proteína fue confirmada después por Western blot utilizando un anticuerpo comercial producido contra los aminoácidos 781-1080 de Gli1 de origen humano (Figura 2A). El anticuerpo reconoce diversas formas que eran casi visible en todas las líneas celulares: el 130 KDa isoforma probable que actúa como activador, los débiles represor 100 KDa [22], y una banda adicional 70 KDa aún no identificados, pero también informaron en la celda mesotelioma pleural maligno culturas [23].
(a) Tres líneas celulares de carcinoma de ovario humano, A2780, SKOV-3, OVCAR-3 y se sometieron a inmunotinción con anticuerpo contra Gli1. Todas las tres líneas celulares expresan Gli1. Expresión de proteínas también se confirmó por análisis de transferencia de Western. ß-actina se utilizó como control de carga. (B) Las células se cultivaron en medio FBS 2% y se trató con 2, 5 y 10 mM KAAD-ciclopamina (K) o GANT58 para 48 h. tratamiento KAAD-ciclopamina inhibe la proliferación celular en todas las tres líneas celulares, mientras que GANT58 no afecta el crecimiento celular. el número de células Se muestra se expresan como porcentaje de células tratadas con DMSO (media ± SD de tres experimentos diferentes; * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001, prueba de la t). la expresión (C) Gli1 ARNm se evaluó mediante análisis Q-PCR en las células de cáncer de ovario tratados con 10 mM KAAD-ciclopamina durante 48 h. Los datos se expresan como factor de cambio vs. cada control respectivo (CTRL), tomada como calibrador para el análisis de la cuantificación comparativa de los niveles de mRNA. Cada muestra se midió por triplicado, el experimento se repitió 2 veces con resultados similares. Gráficos muestran la media ± SD.
El tratamiento con KAAD-ciclopamina inhibe la proliferación celular de células de ovario Carcinomas
Con el fin de examinar si la vía Hh activado es esencial para la proliferación del carcinoma de ovario células, A2780, Skov-3 y OVCAR-3 fueron expuestos a la creciente concentración de KAAD-ciclopamina, un compuesto capaz de inhibir tanto Hh ligando-dependiente y activación de la vía independiente, a través de la interacción directa con Smo. El recuento directo de células viables mostró que KAAD-ciclopamina indujo una reducción dependiente de la dosis de la proliferación de células tumorales de ovario (Fig 2B). Evaluación de la viabilidad celular mediante el ensayo MTT confirmó el efecto inhibidor de KAAD-ciclopamina sobre el crecimiento celular A2780, mientras que no se observó ningún efecto inhibidor de SKOV-3 y células OVCAR-3 (Fig. S1). Una sobre o subestimación de los resultados de MTT si se compara con los resultados del conteo de células, ya ha sido reportado por varios autores, los principales factores que contribuyen a esta discrepancia que se representan por las diferencias en el tamaño celular, la morfología celular, el crecimiento celular (clúster o monocapa) o la actividad mitocondrial [24] - [26]
Efecto de KAAD-ciclopamina en la señalización de Hh
Para confirmar que la reducción de la proliferación celular
in vitro fotos: por KAAD-ciclopamina. era debido a la inhibición específica de la vía de Hh, analizamos el cambio en niveles de ARNm y de proteína Gli1 en líneas celulares de carcinoma de ovario tratados con el fármaco. análisis Q-PCR mostró que el tratamiento de A2780, SKOV-3 y OVCAR-3 con 10 mM KAAD-ciclopamina no modulan significativamente los niveles de Gli1 después de 48 h de exposición (Fig. 2C). La falta de un efecto de KAAD-ciclopamina sobre la actividad de señalización de Hh se confirmó adicionalmente por inmunotransferencia (datos no mostrados). Estos datos sugieren que la inhibición de la proliferación de cáncer de ovario
in vitro
por KAAD-ciclopamina no es un evento mediado por Smo.
El tratamiento con GANT58 no inhibir la proliferación celular de células de ovario Carcinomas
con el fin de confirmar la falta de efecto de la modulación de la vía Hh sobre la proliferación de células de cáncer de ovario, A2780, SKOV-3 y OVCAR-3 se expusieron a una concentración creciente de GANT58, un inhibidor de Gli1 específico. Los resultados obtenidos mostraron que GANT58 no indujo ninguna reducción en la proliferación de células tumorales de ovario (Fig. 2B). Estos datos fueron confirmados por el ensayo MTT (Fig. S1).
Discusión
Aunque la activación de la vía Hh ha demostrado en varios tipos de tumores malignos [5], sólo hay unos pocos informes que muestran que en muestras de carcinoma de ovario humano [27] - [30], con sólo dos examinar el papel pronóstico de moléculas de señal de Hh en el cáncer de ovario. Además, los resultados de estos dos estudios fueron contradictorios: Chen et al [27] encontraron que entre Shh, Dhh, Ptch, SMO y Gli1, Dhh fue el único factor asociado con el resultado de supervivencia, mientras que en el estudio de la Liao [29] examinar el pronóstico papel de Shh, Ptch, SMO y Gli1, esta última era la única proteína asociada de forma independiente con la supervivencia de los pacientes. están disponibles en el momento en que podría ayudar a explicar esta discrepancia no los datos, aunque podría ser debido al análisis de diferentes población en términos de fase y /o histotype tumor. En el presente estudio se investigó el papel pronóstico de Gli1 en una población homogénea de los cánceres de ovario seroso avanzados que muestran que los pacientes cuyos tumores expresan tinción nuclear Gli1 (& gt; 10%) experimentan un sistema operativo más corto en comparación con los casos negativos (≤10%). El papel independiente de la expresión Gli1 como marcador de mal pronóstico se sustenta en el análisis multivariado, después de ajustar por tumor residual en la cirugía y la quimiosensibilidad. En general, nuestros hallazgos no sólo refuerzan la hipótesis de que Gli1 puede representar un nuevo marcador pronóstico importante en el cáncer de ovario, pero también sugieren que los tumores Gli1 que expresan mal responden a las terapias de segunda línea, apoyando así la posible utilidad terapéutica de las combinaciones de agente dirigido-Gli con los tratamientos estándar en pacientes con cáncer de ovario.
en este contexto, fueron rápidos para examinar si la vía Hh activado es esencial para la proliferación de células de carcinoma de ovario. Con este fin, en primer lugar se evaluó por análisis inmunocitoquímico y de inmunotransferencia de la expresión de Gli1 en diferentes líneas celulares de cáncer de ovario, es decir, A2780, SKOV-3 y OVCAR-3, estos estudios revelan expresión de la proteína similar en las 3 líneas celulares examinadas. Desde la ciclopamina inhibe la señalización Hh mediante la unión a y la prevención de la activación por Smo [31], se evaluó la contribución al lado de la señalización autocrina al crecimiento del tumor mediante el estudio del efecto de este fármaco sobre
vitro
la proliferación celular en. En particular, se encontró que, a pesar de este alcaloide vegetal indujo una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación celular en las líneas celulares ensayadas, sin embargo este efecto no se correlacionó con una inhibición de la señalización de Hh, como se juzga por la falta de modulación Gli1 en cultivos de células tratadas. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de la proliferación celular no fue el resultado de la inhibición de la vía Hh mediada por Smo canónica, sino más bien un efecto no específico o tóxico. De acuerdo con estos datos, no se observaron diferencias en la proliferación celular cuando las líneas de células se trataron con GANT58, un inhibidor de Gli1 específico. En particular, la falta de respuesta de las líneas celulares Skov-3 y OVCAR-3 a la inhibición de la vía Hh es consistente con los resultados previos de nuestro y otros grupos, utilizando ciclopamina o un inhibidor de Gli1 específica [32], [33]. Por otra parte, Kudo
et al
. [34] también mostró recientemente que el tratamiento con anti-Gli1 shRNA no afectó la expresión Gli1 en las células A2780. Por otro lado, nuestros
in vitro
datos están en contraste con los estudios de Liao
et al
. [29] y Kandala y Srivastava [35] lo que demuestra que, después del tratamiento con ciclopamina, la expresión Gli1 se redujo en las células A2780 SKOV-3 y OVCAR-3 o, respectivamente. Las razones de estos resultados contradictorios siguen sin estar claros, añadiendo otra capa de complejidad a los esfuerzos destinados a atribuir el crecimiento del tumor de ovario a la actividad excesiva de Hh. A pesar de que puede ser debido a diferencias en los sistemas experimentales (por ejemplo, líneas celulares son propensos a genotípica y la deriva fenotípica durante su cultivo continuo) y /o métodos de ensayo, también es concebible que en realidad podrían reflejar la heterogeneidad de la señalización autocrina y paracrina en el cáncer de ovario . En este contexto, es digno de observar que, junto con la tinción de las células cancerosas epiteliales, también se observó expresión nuclear esporádica de Gli1 en el estroma circundante (datos no mostrados), este hallazgo sugiere una interacción celular entre estroma y el epitelio, con posible ocurrencia de señalización paracrina. Desafortunadamente, debido al componente de estroma limitada por lo general asociados con lesiones de alto grado, que no fueron capaces de determinar el alcance de la expresión Gli1 en microambiente tumoral, y se necesitan más estudios para aclarar mejor el papel de paracrina la señalización de Hh en el cáncer de ovario.
en realidad, también se han notificado discrepancias similares en los resultados experimentales en otros tumores, como el de próstata, páncreas y de colon [36], [37]. Yauch et al [38] hicieron la observación interesante que Smo-antagonista mediada por la inhibición del crecimiento de un gran número de líneas celulares de cáncer de origen epitelial no se correlaciona con Hh expresión del gen diana en estas células, lo que sugiere que a) la observó
vitro
la represión del crecimiento en podría ser debido a los efectos fuera de la meta cuando se utilizan estos compuestos a altas concentraciones, y b) no es un requisito para paracrina de señalización Hh ligando en la tumorigénesis de los cánceres que expresan Hh-, con importantes implicaciones para la