Extracto
Antecedentes
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) la activación desempeña un papel en la carcinogénesis cáncer colorrectal (CRC), y fármacos anti-EGFR se utilizan en el tratamiento del CCR avanzado. Uno de los ligandos de EGFR es inhibidor de tripsinógeno asociado al tumor TATI, también llamado inhibidor de la proteasa serina Kazal tipo 1 (SPINK 1), que recientemente hemos demostrado ser un marcador pronóstico independiente en el CCR.
Métodos
Hemos estudiado el valor pronóstico de la expresión inmunohistoquímica de EGFR y la expresión concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 en una serie de 619 pacientes con cáncer colorrectal.
resultados
de las muestras, el 92% fueron positivos para EGFR. EGFR + /+ TATI se observó en el 62,8%, el EGFR + /TATI- en el 29,5%, EGFR /TATI + en un 4,9%, y EGFR /TATI- en el 2,7% de los pacientes. la expresión de EGFR correlacionado con el grado de la OMS (p = 0,040). En el análisis univariante, la expresión de EGFR correlacionado con la supervivencia favorable (p = 0,006). pacientes EGFR + /+ TATI mostraron una mejor supervivencia que aquellos con otras combinaciones (p & lt; 0,001). En el análisis multivariado, el EGFR + /TATI + fue un factor pronóstico independiente de pronóstico favorable (p & lt; 0,001)..
Conclusión
positividad concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 predice un pronóstico favorable en el CCR
Visto: Koskensalo S, Louhimo J, J Hagström, Lundin M, Stenman UH, Haglund C (2013) Expresión del tumor concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 se asocia con un mejor pronóstico en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (10): e76906. doi: 10.1371 /journal.pone.0076906
Editor: Ichiro Aoki, Escuela de Medicina de la Universidad de la Ciudad de Yokohama, Japón
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: 29 Agosto 2013; Publicado: 25 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Koskensalo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Finska Läkaresällskapet, Medicinska Understösföreningen Liv och Hälsa y la Fundación Sigrid Juselius. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común del mundo [1], [2]. En Finlandia, la incidencia es de 30/100 000 /año [3]. El factor pronóstico más importante en el CCR es el estadio del tumor.
El pronóstico de los pacientes con CCR local está siendo buena supervivencia, 5 años del 80-90%, para los tumores con ganglios positivos es del 60-70%, mientras que para Los tumores con metástasis a distancia es inferior a 10%) [4] - [6]. Los pacientes con estadio III-IV (Dukes C y D) La enfermedad usualmente reciben quimioterapia adyuvante. En el estadio II de la enfermedad (Dukes B), la quimioterapia no se utiliza rutinariamente, aunque algunos de estos pacientes, obviamente, se beneficiarían de la terapia adyuvante. Para identificar a los pacientes con alto riesgo requiere factores de pronóstico adicionales como biomarcadores
.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un objetivo para el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado, pertenece a una glicoproteína transmembrana de la familia de receptores tirosina quinasa ErbB. la interacción ligando-receptor y la dimerización del receptor conduce a la autofosforilación de la tirosina, la activación de una vía de señalización intracelular que promueve la división celular y la migración, la inhibición de la apoptosis y la angiogénesis [7]. Los anticuerpos monoclonales cetuximab y panitumumab se unen a EGFR y desactivar la activación de la tirosina-quinasa y vías de señalización corriente abajo.
Las mutaciones en las vías moleculares activados a través de EGFR pueden contribuir a la carcinogénesis. En CRC, las mutaciones más frecuentes se refieren al gen KRAS ocurre en aproximadamente el 40% de los casos de CCR [8], [9]. Las mutaciones desactivan la actividad trifosfatasa de guanosina (GTPasa), lo que lleva a la acumulación de KRAS activados. Estas mutaciones KRAS conducen a la falta de respuesta a la terapia anti-EGFR [10], [11].
Junto con EGF, anfirregulina, factor de crecimiento transformante (TGF) α, epirregulina, betacelulina, EGF de unión a heparina, y EPIGEN activar EGFR [12]. Recientemente, en adenocarcinomas de páncreas, inhibidor de serina proteasa Kazal tipo 1 (SPINK 1), también llamado inhibidor de la tripsina pancreática secretora (PSTI) y el inhibidor de tripsinógeno asociado al tumor (TATI), se demostró que para activar EGFR [13]. TATI /SPINK1 se expresa junto con EGFR en los adenocarcinomas de páncreas. EGF y TATI /SPINK1 comparten aproximadamente el 50% de homología de aminoácidos [14], y la afinidad de unión de TATI /SPINK1 a EGFR es aproximadamente la mitad de la de EGF [13].
Recientemente hemos demostrado que el tejido expresión de TATI /SPINK1 es un indicador de pronóstico favorable en pacientes con cáncer de colon [15]. En el presente estudio se evaluó la relación entre la expresión de EGFR y TATI y su posible valor pronóstico en el cáncer colorrectal.
estaban disponibles Materiales y Métodos
Pacientes
Los datos clínicos de 643 pacientes consecutivos que se sometieron a cirugía para el diagnóstico histológico de cáncer colorrectal en el Departamento de cirugía, hospital Meilahti, hospital central Universitario de Helsinki, entre 1982 y 1998. los datos clínicos completos y muestras de tejido de archivos estaban disponibles en 623 casos, 333 de ellos de sexo masculino. La mediana de edad fue de 65,9 años (rango 22,7-90,3), y la mediana del tiempo de seguimiento de 4,81 años (rango de 0 a 25,8). La supervivencia y la causa de la muerte de datos hasta marzo de 2011 se obtuvieron del Centro de Población de Registro de Finlandia, Finlandia y Estadística. El diagnóstico y la estadificación se realizaron de acuerdo con la clasificación de los Duques modificado '[16]. El estudio ha sido aprobado por el comité de ética local y cumple con la Declaración de Helsinki (ONR SUH 226 /E6 /06) y la Autoridad Nacional de Supervisión del Bienestar y la Salud. características clínico-patológicas de los pacientes se describen en la Tabla 1.
Muestras de tejidos y la preparación de bloques de TMA
fijados en formalina y muestras de tejidos quirúrgicos incluidos en parafina se obtuvieron de los archivos del Departamento de Patología de la Universidad de Helsinki. Punto de vista histopatológico se definieron regiones representativas de las muestras de tumor y marcadas en H & amp; E se desliza. Tres núcleos de cada bloque del tumor se tomaron muestras con 1,0 mm pegadores mediante el uso de un tejido microarrayer semiautomática (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, EE.UU.). Tres bloques de serie paralelas fueron construidos, incluyendo toda una muestra de cada paciente. A partir de cada bloque, 4 micras de espesor secciones se cortaron para inmunohistoquímica.
La inmunohistoquímica
El Laboratorio de Visión Autostainer TM 480 (LabVision, Fremont, CA, EE.UU.) se utilizó para la inmunotinción. Muestras de tejido fueron deparaffinized en xileno y rehidratada a través de series de alcohol graduado. Para recuperar los antígenos, las muestras se calentaron en el módulo de tratamiento previo de la tinción automática en TRIS-EDTA 9,0 tampón de pH pre-calienta durante 20 min a 98 ° C. Las muestras se incubaron durante 5 min en DAKO VERDADERO peroxidasa solución de bloqueo (DAKO, Glostrup, Dinamarca) para la inactivación de peroxidasas endógenas. Las secciones se incubaron durante 60 min con anticuerpo monoclonal primario NCL-EGFR (clon 113) contra el dominio extracelular, que se tiñe tanto la membrana y citoplasma (Novo Castra, Newcastle, Reino Unido, dilución 1:10). Se hicieron reaccionar las secciones durante 30 min con enlace HRP y por 30 min con la enzima HRP (polímero anti-ratón marcada-anti-conejo) (DAKO, Carpinteria, CA, EE.UU.). Entre cada uno de los pasos de las secciones se aclararon con Tween 20-PBS (tampón de cloruro de sodio tamponada con fosfato, pH 9,0). A continuación, las muestras se incubaron durante 10 min en el sistema de DAB + EnVision (DAKO, Glostrup, Dinamarca), y se tiñeron con hematoxilina durante 1 minuto. Finalmente las muestras fueron lavadas en agua corriente del grifo. Se llevó a cabo la inmunotinción de TATI como se describe (Koskensalo 2011).
Scoring
EGFR immunopositivity citoplasmática en las células tumorales se anotó por dos investigadores independientes (S. K. y J. H.) sin el conocimiento de la evolución clínica. immunopositivity EGFR citoplasmática se evaluó por el porcentaje de células teñidas positivamente. La positividad en más del 50% de las células se marcó como 3, 10 a 50% como 2, y menos de 10% como 1 (Figura 1). La ausencia de positividad se anotó como 0. Se excluyeron los puntos de tejido sin células tumorales. La puntuación más alta se utilizó para cada paciente. Para el análisis estadístico, los pacientes fueron divididos en dos grupos:. EGFR (puntuación 0) y EGFR + (puntuaciones 1-3) guía
A. EGFR positivo, B. EGFR negativo, C. TATI /SPINK1 positivo, negativo inmunoexpresiones D. TATI /SPINK1
TATI /SPINK1 puntuación inmunoexpresiones era análoga a la de EGFR (Koskensalo 2011).; Para el análisis estadístico de los pacientes fueron divididos en dos grupos:. TATI- (puntuación 0) y TATI + (puntuaciones 1-3)
El análisis estadístico
Se analizaron por separado EGFR tinción solo y junto con TATI /SPINK1 tinción (EGFR +/-, TATI +/- o EGFR-TATI +/-). La asociación entre inmunoexpresiones y variables clínico se evaluó mediante la χ
2 o la prueba exacta de Fisher en caso de bajas frecuencias esperadas. La supervivencia se analizó mediante el método de Kaplan-Meier. Estadísticamente significativas covariables en el análisis univariado fueron analizados en el análisis de supervivencia multivariante mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox. A p & lt; 0,05 se consideró significativo. Los análisis estadísticos se realizaron con el software IBM SPSS Statistics 20.0.
Resultados
La inmunotinción para EGFR
evaluación fiable de la inmunotinción fue posible en 520 de las 623 muestras. En 69 (13,3%), immunopositivity EGFR citoplásmica se puntuó como alta (3), en el 172 (33,1%) en forma moderada (2) y, en 236 (45,4%) como débil (1), mientras que 43 (8,3%) mostraron no immunopositivity EGFR (Fig. 1). Se evaluó solamente tinción citoplásmica, porque si citoplasma es positivo, la tinción de la membrana no es adecuado para la evaluación fiable
EGFR inmunorreactividad asociada con el grado del tumor.; positividad se detectó con mayor frecuencia en altamente y moderadamente diferenciado que en los tumores indiferenciados (p = 0,040). la expresión de EGFR no mostró asociación con el estadio de Dukes, pero positividad fue más a menudo presente en locales (Dukes A-B) que en los tumores con metástasis (Dukes C-C) (94,4% frente a 88,8%, p = 0,021) (Tabla 1 ).
inmunotinción simultánea para EGFR y TATI /SPINK1
Evaluación de la inmunotinción para ambos EGFR y TATI /SPINK1 fue posible en 511 de las 623 muestras. La combinación EGFR + /TATI + estaba presente en 321 (62,8%), EGFR + /TATI- en 151 (29,5%), EGFR-TATI + en 25 (4,9%), y EGFR /TATI- en 14 (2,7%) pacientes.
EGFR + /TATI + correlaciona con la histología presentan con mayor frecuencia en los adenocarcinomas que en otros tipos de tumor histológico (p = 0,005), y varía según el grado de la OMS, siendo lo más a menudo presentes en los tumores altamente y moderadamente diferenciados (p & lt; 0,001) ( La Tabla 2) guía empresas
valor pronóstico de EGFR
En el análisis univariante, EGFR inmunoexpresiones (p = 0,006), la edad del paciente (p = 0,009), la OMS grado (p. & lt; 0,001) y el estadio de Dukes (p & lt; 0,001) asociado con el pronóstico. La supervivencia a cinco años fue del 59,9% en los pacientes EGFR + y el 40,5% de los pacientes EGFR-(Tabla 3) guía empresas
En el análisis multivariado de la supervivencia, el EGFR (p = 0,023), la edad (p & lt de los pacientes;. 0.001 ), estadio de Dukes (p & lt; 0,001), la localización del tumor (p = 0,001), y la OMS grado (p = 0,033) fueron factores de pronóstico independientes (Tabla 4) guía empresas
papel pronóstico de la combinación. de EGFR y TATI /SPINK1
expresión concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 correlaciona con el pronóstico, la supervivencia a los 5 años es 65,0% en los pacientes EGFR + /+ TATI, el 47,7% en EGFR + /TATI-, el 43,2% de EGFR /TATI +, y 42,4% en los pacientes EGFR-/TATI- (p & lt; 0,001) (Tabla 4, Figura 2). Alta edad (p = 0,009), avanzó estadio de Dukes (p & lt; 0,001), y se hace avanzar la OMS grado (p & lt; 0,001). Correlacionado con mal pronóstico (Tabla 5)
En multivariante análisis de supervivencia, la expresión de EGFR /TATI (p & lt; 0,001), la edad (p & lt; 0,001), estadio de Dukes (p & lt; 0,001), y la ubicación (p = 0,003) fueron factores pronósticos independientes (Tabla 6) guía
Discusión
recientemente, hemos mostrado que TATI es un factor pronóstico independiente en el cáncer colorrectal, expresión tisular alta se asocia con un pronóstico favorable. Aquí nos muestran que inmunoexpresiones concomitante de EGFR y TATI es un factor pronóstico independiente de supervivencia favorables en el cáncer colorrectal, y es un factor pronóstico más fuerte que el EGFR o TATI /SPINK1 solo.
En concordancia con los resultados anteriores, se observado la sobreexpresión de EGFR en muestras de cáncer colorrectal, [17], [18]. inmunoexpresiones EGFR correlacionado significativamente con el grado del tumor, siendo más a menudo positivos en los tumores de alta y moderadamente diferenciados, como se informó anteriormente [19]. Por el contrario, la expresión de EGFR también se ha demostrado que se correlaciona con una mala diferenciación [18]. Al igual que en otros estudios, se encontró correlación con la histología [20], [21], pero no hay correlación entre la inmunotinción de EGFR y estadio de Dukes. Esto está en concordancia con el estudio realizado por Giralt [20], mientras que Spano et al. informaron fuerte sobreexpresión de EGFR en T3 T4 que en los tumores de colon [17]. Deng et al. encontrado, en 94 pacientes con cáncer colorrectal, una asociación entre la alta expresión y estadio tumoral alto [22].
Aquí mostramos que inmunoexpresiones EGFR es un marcador independiente de pronóstico favorable en los pacientes con cáncer colorrectal. Nuestros resultados difieren de los otros; la expresión de EGFR no se correlacionó con la supervivencia en un estudio de 249 [19] y 132 pacientes con CCR [17] o en 87 pacientes Dukes C CRC, [6]. Sin embargo, en algunos estudios específicamente de cáncer de colon, la expresión de EGFR correlaciona con mal pronóstico. En un estudio de 149 pacientes, la expresión de EGFR era un marcador independiente de pronóstico adverso, pero no se observó la expresión de EGFR en sólo el 35,6% de las muestras, que es menor que por lo general informó [23]. Resnick et al. también mostraron una asociación entre la fuerte expresión de EGFR y de mal pronóstico en el cáncer de colon [24]. En un subanálisis incluyendo sólo el cáncer de colon, nuestro estudio mostró una asociación entre la expresión de EGFR y la mejora de la supervivencia, pero la diferencia no fue significativa (datos no mostrados).
En un análisis de subgrupos de cáncer de recto, encontramos significativamente mejor las tasas de supervivencia (p = 0,001) en pacientes con positividad EGFR (datos no presentados). En 87 pacientes con cáncer rectal que habían recibido radioterapia preoperatoria, Giralt et al informaron de la expresión de EGFR en el pre-tratamiento biopsies- pero no en samples- quirúrgica de asociarse con un pronóstico adverso [20]. En un estudio realizado por Fernebro et al. en 269 pacientes con cáncer rectal, no se observó asociación con la supervivencia libre de metástasis [25]. En un estudio de 40 pacientes con cáncer rectal, Yasuda et al. encontró disminución de los niveles de EGFR después de la quimiorradioterapia, pero la expresión de EGFR no era un marcador de pronóstico [26]. La radioterapia puede tanto reducir y aumentar la expresión de EGFR [27], [20]. No hemos analizar la expresión de EGFR en las biopsias previas al tratamiento, pero no hubo diferencias en la expresión de EGFR han nacido entre los pacientes con cáncer rectal recibir o no radioterapia preoperatoria (datos no mostrados).
tratamientos EGFR se han utilizado para la metástasis cánceres colorrectales, pero el valor de inmunoexpresión EGFR para predecir la eficacia del tratamiento adyuvante es controversial. Curiosamente, el antagonista de EGFR cetuximab ha demostrado ser eficaz incluso contra tumores EGFR-negativos [28]. Una explicación para esto puede ser que el tratamiento anti-EGFR está dirigido contra los tumores con metástasis, y la correlación entre inmunoexpresiones EGFR en el tumor primario y lesión metastásica está claro y varía entre los estudios [19], [29], [22]. Además, los tumores EGFR-positivo no siempre responden al tratamiento con cetuximab [30]. Por otra parte, los tumores con mutaciones de KRAS se han encontrado para responder mal a la terapia anti-EGFR [10], [11], y se recomienda el análisis del estado mutacional del gen KRAS para todos los CCR metastásico [31]. mutaciones de KRAS en el codón 12 se correlaciona con un pronóstico adverso [31], [32]. BRAF es el segundo paso de la vía mediada por EGFR. BRAF mutado se correlaciona con un pronóstico adverso [33], pero los pacientes con la mutación BRAF puede beneficiarse de los tratamientos EGFR [31]. Un nuevo método que parece ser superior a análisis de mutaciones de KRAS para seleccionar los pacientes para la terapia anti-EGFR se combina el análisis de mutaciones de KRAS y el número de copias del gen EGFR [34].
El PIK3CA (la fosfatidilinositol-4, 5-bisfosfonato 3-quinasa, gen del polipéptido catalítico de la subunidad alfa) vía es otra vía aguas abajo de la señalización de EGFR. Las mutaciones del gen PIK3CA pueden promover la transformación maligna [35]. El uso de la aspirina bloquea la vía PIK3CA, y se correlaciona con un mejor pronóstico en los pacientes con un gen mutado [36]. Por desgracia, los datos sobre el uso de la aspirina no estaba disponible en nuestros registros de los pacientes.
Ozaki et al. demostraron que EGFR y TATI /SPINK1 se co-expresan en cáncer de páncreas y que SPINK1 estimula la proliferación de células de cáncer pancreático a través de la activación de EGFR [13]. Aquí nos muestran que en más o menos dos de cada tres muestras de carcinoma colorrectal EGFR y TATI /SPINK1 se co-expresó. Hemos demostrado anteriormente que la expresión tisular de alta TATI /SPINK1 se correlaciona con un mejor pronóstico en el CCR; Aquí mostramos que la expresión concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 es un mejor marcador para la mejora de la supervivencia. Se sabe que hay bucles de realimentación positivos y negativos dentro de las vías de EGFR mediada dependiendo del tipo de célula, y una razón para mejor pronóstico en el cáncer colorrectal puede ser que la unión de TATI conduce a la inhibición de cascadas que conducen a la transformación maligna. Además, TATI unión a EGFR puede inhibir la unión de ligandos activadores más fuertes.
Por tanto, es plausible que TATI /SPINK1 y la interacción entre TATI /SPINK1 y EGFR desempeñan diferentes funciones en la CRC que en cancer.Interestingly de páncreas, expresión de TATI /SPINK1 en tejido de cáncer también se asocia con buen pronóstico en el cáncer gástrico [37] y la pérdida de expresión TATI /SPINK1 se correlaciona con enfermedad agresiva en el cáncer de vejiga [38]. Esto indica que TATI /SPINK1 ejerce diferentes funciones en diferentes patologías. TATI /SPINK1 no es sólo un activador de EGFR, sino también un inhibidor de tripsina eficaz y la tripsina se expresa por varios tumores [38]. Así, no es sorprendente que también ejerce diferentes funciones en diferentes tumores. Hasta el momento, el EGFR inmunohistoquímica no es una herramienta para la predicción de los cuales los pacientes que puedan beneficiarse de un tratamiento adyuvante EGFR. Sería interesante estudiar si la adición de análisis de tejidos TATI /SPINK1 más evaluación del número de copias de genes análisis de la mutación KRAS y EGFR podrían mejorar aún más los resultados prometedores de Algars et al. [34].
En conclusión, a lo mejor de nuestro conocimiento, se muestra por primera vez que inmunoexpresiones concomitante de EGFR y TATI /SPINK1 es un marcador pronóstico independiente de pronóstico favorable en los pacientes con cáncer colorrectal. La combinación es una herramienta de pronóstico más fuerte que cualquiera de TATI /SPINK1 o EGFR solo. son necesarios para comprender mejor la relación entre la TATI /SPINK1 y EGFR en el cáncer colorrectal y para evaluar el uso potencial de esta combinación de marcadores para predecir la respuesta al tratamiento más estudios.
Reconocimientos
Agradecemos Päivi Peltokangas , Tuire Koski, y Elina Aspiala por su excelente asistencia técnica.