Extracto
Los estudios recientes han sugerido que la señalización de K-ras aberrante es responsable de desencadenar respuestas inmunológicas y la tumorigénesis inflamación impulsada. Las interleuquinas IL-17, IL-22 e IL-23 han sido reportados en varios tipos de tumores malignos, pero aún no se ha dilucidado la función mecánica exacta de estas moléculas. Dado el papel de K-ras y la participación de interleucinas en la tumorigénesis colorrectal, se reportan los esfuerzos de investigación por primera vez, lo que demuestra que diferencialmente expresados interleucina niveles de IL-17, IL-22 e IL-23 se asocian con K-ras en de manera a lo largo de la etapa específica de la progresión del cáncer colorrectal. Específicamente, a) el efecto de K-ras señalización se investigó en la expresión general de interleuquinas en pacientes con cáncer colorrectal y de controles sanos, y b) se estableció una relación entre K-ras y citoquinas mutantes GM-CSF y IFN-γ. Los resultados indican que las interleucinas específicos se expresan diferencialmente en los pacientes positivos K-ras y el uso de K-ras inhibidor Manumycin A disminuye ambos niveles de interleucina y la apoptosis en células Caco-2 mediante la inhibición de la viabilidad celular. Por último, los niveles de inflamación impulsada por GM-CSF e IFN-γ se modulan a través de la expresión de la interleuquina en pacientes con tumor, con la expresión de la interleuquina en el lumen intestinal y el tejido canceroso mediada por la señalización de K-ras aberrante. En conjunto, los hallazgos a) indican que la interleuquina expresión es influenciada por ras de señalización y las interleucinas específicos desempeñar un papel promotor oncogénico en el cáncer colorrectal, destacando el enlace molecular entre la inflamación y la tumorigénesis, y b) acentuar las correlaciones moleculares entretejidas como conduce a nuevos enfoques terapéuticos en un futuro
Visto:. Petanidis S, D Anestakis, Argyraki M, Hadzopoulou Cladaras-M, Salifoglou a (2013) Expresión diferencial de IL-17, 22 y 23 en la progresión del cáncer colorrectal en pacientes con K-ras mutación: Ras de la señal de inhibición y Crosstalk con GM-CSF y IFN-γ. PLoS ONE 8 (9): e73616. doi: 10.1371 /journal.pone.0073616
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 21 de junio de 2013; Aceptado: 23 de julio de 2013; Publicado: 6 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Petanidis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue co-financiado por la Unión Europea por el FSE y los fondos nacionales griegos a través del programa MREN-Heráclito II. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es la segunda forma más frecuente de cáncer en el mundo. Actualmente, en la mayoría de los países en desarrollo, no hay cribado organizado y programas de diagnóstico [1], [2]. Estudios anteriores han demostrado que el cáncer colorrectal es una enfermedad multifactorial, en la que la expresión de muchos genes específicos, conocidos como oncogenes o supresores tumorales, es anormalmente alterada [3]. A este respecto, el gen PIK3CA, que está implicado en la vía de señalización de PI3K /AKT, está regulado en el cáncer colorrectal. El supresor de tumor gen de la fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) es regulada hacia abajo debido a una mutación genética o supresión [4]. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la carcinogénesis colorrectal aún no se han dilucidado. Hacia esos esfuerzos, es crucial para identificar marcadores moleculares específicos para la detección e identificación de los mecanismos que contribuyen a la carcinogénesis colorrectal. Uno de tales biomarcadores representativa es K-ras, un oncogén con la guanosina trifosfato (GTP) propiedades de unión [5]. Debido a su capacidad de interactuar con las moléculas de señalización clave, incluyendo el transductor de señal y activador de la transcripción (STAT), phosphoinositide 3-quinasa (PI3K), y activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK), el gen K-ras proporciona una función esencial en la división celular, el crecimiento celular y la diferenciación. Por lo tanto, las mutaciones en el gen K-ras (especialmente, las sustituciones de nucleótidos individuales) están implicados en la mayoría de los tipos de tumores, incluyendo adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón, carcinoma ductal de páncreas y el carcinoma colorrectal [6].
en los últimos años, la evidencia ha demostrado que las interleucinas llevar a cabo funciones importantes en el desarrollo tumoral, la diferenciación celular, la inflamación y la metástasis [7], [8]. A este respecto, la IL-17, que se produce en gran medida por los linfocitos T de memoria activadas, estimula tanto la inmunidad innata y la defensa de acogida, y desempeña un papel activo en las enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes y cáncer. Más específicamente, la IL-17 induce la expresión del factor nuclear kappa B (NF-kB), las quimioquinas CXCL8, CXCL6 y CXCL1, factores de crecimiento G-CSF, GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos), IL-6 , y moléculas de adhesión (ICAM-1), lo que lleva a la acumulación aumentada de neutrófilos, granulopoyesis, y las respuestas inflamatorias [9], [10]. Por otra parte, IL-22 actúa como un mediador de las respuestas inflamatorias celulares mediante la activación de quinasas intracelulares (JAK1, Tyk2, y MAP quinasas) y los factores de transcripción tales como STAT3 [11]. Además, las funciones de IL-22 presenta anti-apoptóticas y tumorigénicas, con datos recientes que muestran que la sobre expresión de esa molécula protege líneas celulares de cáncer de pulmón de la apoptosis a través de a) la activación de STAT3 y sus aguas abajo proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl- xL, y b) la inactivación de las quinasas reguladas por señales extracelulares [12]. Del mismo modo, la IL-23 desempeña un papel clave en la inflamación intestinal crónica y su regulación en los tejidos paralelos malignas niveles de la "biomarcador metastásico" metaloproteinasas de la matriz MMP-9 aumentada, factor de necrosis tumoral TNF-alfa, y aumento de los niveles de la angiogénesis [13 ], [14], [15].
en un esfuerzo por descubrir enlaces moleculares entre las vías oncogénicas e inmuno-inflamatorios en la fisiología del cáncer, la investigación se inició en nuestros laboratorios para investigar las interacciones y las posibles funciones que entretejidos las dianas moleculares antes mencionados podrían desempeñar en el cáncer colorrectal progresión de varias etapas. Con este fin, se presenta en el presente documento por primera vez que a) las interleucinas específicos son hasta reguladas en el carcinoma colorrectal en comparación con los tejidos de colon sanos, B) interleucinas son sobreexpresado en todos los pacientes K-ras y pueden promover el crecimiento celular e inhibir la célula apoptosis en células Caco-2 con cáncer colorrectal a través de las vía de señalización Ras, c) el uso de los K-ras inhibidor Manumycin a disminuye los niveles de interleuquina, y disminuye la apoptosis en-2 Caco células de cáncer colorrectal mediante la inhibición de la viabilidad celular, y d) GM-CSF y IFN-γ (interferón gamma) se modulan a través de la expresión de interleucina ya sea positiva o negativamente. Las observaciones colectivas arrojan luz sobre la asociación funcional entre las interleucinas en la inflamación, ras-señalización y la tumorigénesis colorrectal, lo que potencialmente ayudar en el desarrollo de la detección del cáncer de futuro y la terapéutica.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional del hospital AHEPA, Facultad de Medicina, Universidad Aristóteles de Tesalónica. El documento satisface PLoS ONE políticas con respecto a la investigación con seres humanos. Un consentimiento informado por escrito se recibió de cada paciente. Se obtuvieron consentimientos por escrito, antes de la cirugía, a partir de pacientes que participan voluntariamente en el uso de tejidos exclusivamente con fines de investigación. Los pacientes habían leído y comprendido el documento proporcionado la información del paciente, y los objetivos y métodos de este estudio habían sido explicado completamente a ellos. Los pacientes que participaron habían dado su consentimiento informado por escrito a los autores de este manuscrito para la publicación de estos datos. La investigación clínica se llevó a cabo de acuerdo con las directrices expresadas en la Declaración de Helsinki. Reactivos
Manumycin A se adquirió de Sigma (Sigma Alemania, Europa). DMEM con HEPES, PBS (tampón fosfato salino), FBS (suero bovino fetal), y tripsina-EDTA reactivos se adquirieron de Invitrogen (Invitrogen, Darmstadt, Alemania). DMSO (dimetil sulfóxido) y Tris-EDTA (Tris-etileno diamina tetraacético) se adquirieron de Applichem (Applichem, Darmstadt, Alemania). K-ras (A-18) con peroxidasa de cabra policlonal IgG de rábano picante (HRP), ratón anti-IgG de cabra-HRP, y GAPDH (L-20) de cabra policlonales anticuerpos IgG-HRP para el análisis de Western blot se obtuvieron de Santa Cruz ( Santa Cruz, California, EE.UU.). La IL-17 humana, IL-22, IL-23, GM-CSF y IFN-γ se detectaron utilizando anticuerpos monoclonales anti-humanos de Santa Cruz. Para la preparación de soluciones madre acuosas (1,0 mu), Manumycin A se disolvió en Tris 10 mM, pH 7,4. La solución madre Manumycin A se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras y posteriormente se dividió en alícuotas y se almacena en la oscuridad a temperatura ambiente. -EDTA tampón Tris (TE) se preparó a partir de una M Tris 1, pH 8, y un EDTA mM solución madre 100. Las concentraciones finales fueron Tris 50 mM y EDTA 1 mM. La acción así preparada se filtra a través de un filtro de 0,22 micras, a continuación, se dividió en alícuotas y se almacena en la oscuridad a temperatura ambiente.
Pacientes
Un total de 92 cáncer colorrectal (CCR), 37-88 años de edad, eran del hospital AHEPA, Facultad de Medicina, Universidad Aristóteles de Tesalónica (Tabla S1). De estos pacientes, 28 albergaban mutaciones K-ras (24 con G12V y 4 con G12D). Estos pacientes fueron sometidos a resección del cáncer colorrectal (en las fases B1-D) entre 2009 y 2012. Además, 56 voluntarios sanos que a) cumplieron con los requisitos de tener sexo y edad similares emparejado con las muestras de pacientes con CRC, y b) no exhibieron colon adenomas, fueron seleccionados como controles. Los pacientes con condiciones inflamatorias, incluyendo las enfermedades infecciosas o colágeno, fueron excluidos. Todos los pacientes fueron clasificados de acuerdo con las clasificaciones de la UICC etapa utilizando muestras resecadas. Las muestras de sangre se obtuvieron por punción venosa antes de la cirugía colorrectal. Cada muestra se centrifugó a 3000 g durante 5 min, y luego se congeló a -80 ° C hasta su análisis.
ADN y ARN Extracción
fijados con formalina, se seleccionaron las secciones del tumor de los pacientes incluidos en parafina por un patólogo para confirmar el diagnóstico y definir las áreas enriquecidas con el tumor para la disección. Las células cancerosas aisladas se lisaron en tampón (0,2 M Tris HCl, 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% SDS, 1 M de acetato de sodio) que contiene proteinasa K a 60 ° C durante 72 hr y extracción de ADN se realizó con el uso de el ADN y el ARN Qiagen kit de purificación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Atenas, Grecia). Para la extracción de RNA, las células cancerosas se resuspendieron en 400 tampón RNA lisis l (0,5 M EDTA, 10% de SDS, 1 M Tris pH 7,5) suplementado con 300 mg de proteinasa K y se incubó a 60 ° C durante 16 horas hasta que el tejido tenía sido completamente solubilizado. RNA se purificó mediante el reactivo Trizol (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), se trató posteriormente con DNasa para evitar la contaminación de ADN genómico, y se almacenó a -80 ° C hasta su uso.
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Antes del ensayo, las muestras de tejido congelado se llevaron a temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron en una solución isotónica de cloruro de sodio (Sigma), cortado en trozos, se pesaron y se homogeneizaron a 4 ° C en tampón de lisis (50 mM HEPES pH 7,4, CHAPS 5 mM, 5 mM DTT) 1. Procesamiento de las muestras se llevó a cabo en una escala de masa de 1 g de tejido /10 ml de tampón de lisis. Los tejidos homogeneizados se mantuvieron a -20 ° C durante 24 horas y después se centrifugaron a 20.000 g durante 15 min a 4 ° C. Los sobrenadantes (10 l por pocillo) se utilizaron para la etapa específica cuantitativa (B1, B2, C1, C2, D) la detección de IL-17, IL-22 e IL-23 a través de ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas de Cytoscreen (Biosource Internacional , Camarillo, CA). Los límites de detección para los kits de ELISA, según lo especificado por el fabricante, eran 9 pg /ml (IL-17), 8 pg /ml (IL-22) y 4 pg /ml (IL-23). Manumycin Se aplicó un tratamiento a todas las muestras de los pacientes etapa D para los tres interleucinas investigados.
transcriptasa reversa reacción de polimerasa en cadena (RT-PCR)
RT-PCR se realizó en muestras de tejido de pacientes para IL -17, IL-22, IL-23, GM-CSF y IFN-γ. se utilizó GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) como un control interno. La amplificación se realizó en un volumen total de 20 l por reacción, que contiene 10 l de PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 5 l de cebadores (1 pmol /l), y 5 l de cDNA (40 ng de ARN) . cebadores RT-PCR para IL-17, 1L-22, IL-23, GM-CSF, IFN-γ y GAPDH se enumeran en la Tabla S2. Los parámetros de la reacción de PCR se establecieron como sigue: 95 ° C durante 15 minutos seguido de 40 ciclos de PCR que reaccionan a 94 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Melting análisis de la curva de productos de amplificación se llevó a cabo al final de cada reacción de PCR mediante el aumento de la temperatura de 60 a 95 ° C con una velocidad de transición de temperatura de 0,1 ° C por segundo, lo que nos permite distinguir los productos genuinos de los productos y de imprimación no específicos dímeros. Los productos de PCR también se separaron en un gel de agarosa al 1,5% para visualizar la formación de productos de PCR correctos. La cuantificación relativa (RQ) de la expresión génica se calculó suponiendo 100% PCR eficiente, en el que cada valor de CT de las reacciones se normalizó a la expresión de GAPDH ARNm.
K-ras de detección de la mutación y análisis de secuencia de K-ras G12 Codón
Todas las muestras de tejido tumoral de pacientes fue instantánea congelada y en conserva en nitrógeno líquido antes de su uso. Secciones de parafina A continuación se prepararon y una sección de cada caso se eligió para la tinción de hematoxilina-eosina. Un patólogo experimentado analizó la sección de hematoxilina-eosina para confirmar la presencia de tejido tumoral. Posteriormente, las muestras de tejido de al menos cinco secciones en serie se macrodissected para asegurar que las muestras contenían al menos 80% de células tumorales. Se aisló el ADN a partir de estas muestras de tejido utilizando el Qiagen kit de extracción de ADN (Qiagen, Berlín, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se detectaron mutaciones en el codón 12 de K-ras exón 1 en estas muestras de ADN genómico por secuenciación directa basada en PCR. Los cebadores de PCR para K-ras utilizadas fueron K-ras-forward: 5'-AAGGCCTGCTGAAAGTGACTG-3 'y K-ras-reverso: 5'-CTGGTGCAGGACCATTCTTCAG-3'. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 l que contenía 150 ng del ADN genómico extraído. condiciones de amplificación de PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 1 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, hibridación a 55 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 30 s, con un paso de extensión final a 72 ° C durante 5 min en un ciclador térmico TP-600 (Takara). Productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5% y se purificó para su posterior secuenciación directa del ADN a través de un analizador de ADN ABI-3730XL (Applied Biosystems, Europa).
Análisis inmunohistoquímico de IL-17, IL-22, y IL-23
secciones parafinado de biopsias de colon humano de pacientes con cáncer colorrectal se trataron con IL-17 anti-humano, IL-23 anticuerpos de IL-22 anti-humano y anti-humanos monoclonales (mAb) ( Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). La tinción con isotipo IgG1 de ratón se utilizó como control negativo. Las imágenes se obtuvieron a través de un microscopio Carl Zeiss utilizando el software de análisis de imagen (Carl Zeiss, Berlín, Alemania).
Análisis de transferencia Western de la IL-17, IL-22 e IL-23
Recogidos muestras de tejido de pacientes colorrectales se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron en 100 l de tampón de lisis enfriado en hielo por 1 × 10
6 células. Los lisados se incubaron en hielo durante 10 min, se agitaron durante 45 s y se mantuvo en hielo durante otros 10 min. Después de centrifugar a 14000 g y 4 ° C durante un período de 15 min, se recogió el sobrenadante y las proteínas se cuantificaron por el método de Bradford. proteínas de lisado disueltos en tampón de muestra 6xLaemmli se separaron (30 g /carril) mediante electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (10% de acrilamida) y electro-transferido a PVDF (difluoruro de polivinilideno) membranas. Después de bloquear con leche sin grasa 5% en tampón TBST (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,6), las membranas se incubaron durante 90 min con la dilución adecuada del anticuerpo primario en TBST más un 1% leche sin grasa. Después del lavado, las membranas se incubaron con la dilución adecuada del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante en TBST más leche no grasa 1%. Por último, las transferencias fueron desarrolladas por ECL (quimioluminiscencia aumentada) y digitalizada a través de un sistema de imágenes de 500 BioSpectrum. GAPDH se utilizó como control interno en todos los experimentos.
ELISA SPOT para GM-CSF y IFN-γ
IFN-γ células productoras de muestras de sangre de pacientes se cuantificaron con un IFN-γ ELISPOT kit (Diaclone, Besançon, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con modificaciones menores. Las membranas se recubrieron con anticuerpos IFN-gamma humanos y se incubaron durante la noche a 37 ° C. Entonces, 1 × 10
se añadieron 5 PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) de pacientes con cáncer colorrectal en las placas y se incubaron durante 26 horas a 37 ° C con 5% de CO
2. Las células se retiraron y se añadieron los anticuerpos biotinilados contra IFN-γ humano sobre las membranas. Las manchas se contaron mediante un contador de placas automatizado de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Europa)
producción de células a partir de PBMCs de pacientes se cuantificaron mediante el uso de un kit de GM-CSF ELISPOT (amp I + GM-CSF;. D Biosystems, Minneapolis , EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las placas de filtración de ELISPOT de 96 pocillos se recubrieron con 4 mg /ml de anticuerpo GM-CSF en 100 l de reactivo durante la noche diluyente a 37 ° C. Las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado (PBS con 0,5% de Tween 20) y se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente en tampón de bloqueo que contenía PBS, suplementado con 1% de BSA y 5% de sacarosa. placas de ELISPOT se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2, y 100% de humedad. Los pocillos que contenían células sólo sirvieron como control negativo. Las manchas se contaron mediante un contador de placas automático (Applied Biosystems).
Cell Cultura y
adenocarcinoma colorrectal células epiteliales humanas Caco-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en DMEM (medio eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Biochrom, Alemania). Los cultivos de células se hicieron crecer hasta la confluencia y se mantuvieron en una atmósfera humidificada a 37 ° C y 5% de CO
2. Las células Caco-2 se incubaron con medio libre de suero bovino fetal durante 24 h antes del tratamiento con Manumycin A a una concentración final en el rango de 50 a 300 mM. Tres conjuntos independientes de experimentos se realizaron en un Manumycin un tratamiento.
MTT viabilidad celular Ensayo
La viabilidad celular en células Caco-2 se investigó utilizando el MTT (3- (4,5-dimetiltiazol -2-il) bromuro) de ensayo -2,5-difeniltetrazolio. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10
4 células /pocillo. Después de un tratamiento de 24 horas con Manumycin A, se añadió una solución de MTT (10 l /pocillo) y se incubó a 37 ° C durante 4 h. Después se retiró el medio, y los cristales de formazán precipitados se disolvieron en 100 l de DMSO. Después de agitar durante 30 min, la absorbancia a 570 nm se midió utilizando una microplaca de ELISA lector (Biorad, Europa). La viabilidad celular relativa se calculó como sigue: la viabilidad celular relativa = (absorbancia media experimental /absorbancia media de control) x 100%. Los ensayos se realizaron por triplicado en tres experimentos independientes.
TUNEL ensayo
La apoptosis celular en las células Caco-2 se visualizó utilizando el TUNEL (nick fin de etiquetado mediada por desoxinucleotidiltransferasa terminal de biotina UTP) de detección ensayo (Roche, Atenas, Grecia). Las células se incubaron con Manumycin durante 24 horas y después se lavaron tres veces con PBS. Brevemente, las células se trataron con proteinasa K y se enjuagaron dos veces con PBS. Se añadió un tampón de equilibrio que contiene la mezcla nucleótido marcado y la enzima TdT; la mezcla se dejó incubar a 37 ° C durante 1 hora en un CO 5%
2 cámara humidificada, y luego se llevó a cabo la tinción. Observado a través de un microscopio de fluorescencia Carl Zeiss, con detección a 570 nm, las células normales no están manchados mientras que las células apoptóticas tienen una fuerte fluorescencia roja.
Análisis estadístico
prueba de la t de Student y de una sola vía y ANOVA de dos vías se utilizaron para el análisis estadístico de los datos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad 5.1 (GraphPad, La Jolla, EE.UU.). Los casos con valores de p & lt; 0,05 o & lt; 0,01 se consideró estadísticamente significativa (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt; 0,001).
Resultados
interleucina y K-ras de correlación en la etapa del cáncer colorrectal progresión
Los niveles de IL-17, IL-22 e IL-23 en pacientes con cáncer y controles sanos se determinaron mediante ELISA Inmunoensayo interleucina humana, Western Blot, y RT- Las técnicas de PCR.
IL-17
Inicialmente, la IL-17 niveles de expresión se midieron en etapas consecutivas de cáncer colorrectal y en los tejidos sanos de control utilizando ELISA. Los resultados mostraron que la IL-17 los niveles de expresión fueron en general más alta en K-ras tejidos de cáncer positivos (de 170 pg /ml en B1 a 247 pg /ml en D) en comparación con K-ras muestras negativas (de 150 pg /ml en B1 a 225 pg /ml en D) (P & lt; 0,05) (Figura 1A). Análisis de IL-17 de los niveles de proteína a lo largo de cáncer etapas B1-D en pacientes mostraron que eran significativamente mayores en comparación con el a) los niveles de los pacientes negativos K-ras (62% vs. 38%) correspondiente, y b) los controles sanos ( 62% vs. 16%) (Figura 2A). Además, el nivel de ARNm de IL-17 se determinó en muestras positivas K-ras. Se observó un aumento significativo en el ARNm de IL-17 niveles (Figura 2B). Con el fin de examinar el efecto de la mutación K-ras (G12V) sobre la expresión de interleucina, la ras farnesil transferasa inhibidor Manumycin A se aplicó en muestras normales y de la etapa D del paciente, debido a la sobreexpresión selectiva de que la interleuquina en esa fase particular. Al final del tratamiento Manumycin A (10 μΜ), una disminución significativa (P & lt; 0,001) en los niveles de IL-17 se observó (Figura 1A). Una disminución similar en K-ras muestras etapa positiva D fue ejemplificada por la proteína y los niveles de mRNA (P & lt; 0,001 para los niveles de proteína, P & lt; 0,01 para los niveles de ARNm) (Figura 3A-B). Los experimentos indican la importancia de mutantes K-ras de señalización de la IL-17 expresión.
Determinación de la interleucina (A) IL-17, (B) IL-22, y (C) IL-23 concentraciones (pg /ml) en los tejidos tumorales de K-ras positivo, pacientes de cáncer de colon negativos K-ras, y pacientes de control en las distintas etapas de la progresión del cáncer de colon. Manumycin A se aplicó en muestras normales y la etapa D del paciente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de las muestras para cada grupo involucrado. Gran barra indica la comparación entre la etapa D del paciente y la etapa D + muestras de tratamiento Manumycin.
(A) los niveles de expresión de proteínas de IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF e IFN -γ. GAPDH se utilizó como control de carga para el análisis de transferencia Western. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes. El análisis densitométrico de cada nivel de proteína se calculó a partir de la media de tres experimentos. Cada valor se expresó como la relación de la proteína medido a nivel de GAPDH (P & lt; 0,001). (B) los niveles de expresión de ARNm de IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, y IFN-γ a partir de tejidos de cáncer de colon realizadas por análisis de RT-PCR. 5 g de ARN total fue aislado de los tejidos de cáncer. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
Efecto de Manumycin Un tratamiento (10 mM) en los niveles (A) de expresión de ARNm de IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, y IFN-γ en pacientes con cáncer colorrectal positivas K-ras como se realizó por análisis de RT-PCR. células de colon en estadio D de los pacientes fueron tratados con Manumycin A (10μM) durante 24 horas, antes de la RT-PCR. 5 g de ARN total fue aislado de las células del colon tratados. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. (B) los niveles de expresión de proteínas de IL-17, IL-22, IL-23, GM-CSF, y IFN-γ en K-ras pacientes de cáncer colorrectal positivas como realizó por análisis Western Blot. células de colon en estadio D de los pacientes fueron tratados con Manumycin A (10μM) durante 24 horas, antes de la cuantificación de proteínas. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes.
IL-22
Tejido IL-22 niveles se elevaron significativamente en el grupo negativo K-ras en comparación con los pacientes que llevan la mutación K-ras (de 94 pg /ml vs. 80 pg /ml en B1 a 216 pg /ml vs. 150 pg /ml en D) (P & lt; 0,05 para B1-C1, P & lt; 0,01 para C2-D) ( Figura 1B). Además, la proteína y los niveles de mRNA de IL-22 fueron significativamente mayores en el grupo negativo K-ras. En concreto, en estos pacientes, la proteína IL-22 niveles fueron elevados en el grupo negativo K-ras (84% vs. 60%) (P & lt; 0,001) (Figura 2A). Además, los niveles de ARNm de IL-22 en el grupo positivo K-ras fueron más bajos en comparación con el grupo negativo K-ras (P & lt; 0,001) (Figura 2B). La adición de Manumycin A en 10 μΜ a muestras normales y de la etapa D del paciente causó una disminución en la IL-22 niveles (P & lt; 0,001 para los niveles de proteína, P & lt; 0,01 para los niveles de mRNA). (Figura 1B, 3A-B)
IL-23
el ELISA, ARNm, y el análisis de proteínas reveló que K-ras pacientes positivos mostraron un aumento en IL-23 expresión en comparación con el negativo K-ras (P & lt; 0,01 para B1, P & lt; 0,05 para B2-D) y el grupo de control sano (P & lt; 0,001) (Figura 1C, 2A-B). Para determinar la correlación entre la presencia de K-ras e IL-23 expresión, se añadió Manumycin A a muestras normales y de la etapa D del paciente y la proteína IL-23 y los niveles de mRNA en K-ras se determinaron los pacientes positivos (Figura 1C, 3A-B) . Los resultados muestran que la inhibición de K-ras causa una disminución significativa de la IL-23 niveles (P & lt; 0,001 para los niveles de proteína, P & lt; 0,01 para los niveles de ARNm), estableciendo así una correlación entre K-ras y los niveles de IL-23
GM-CSF
Para investigar los posibles mecanismos de participación de GM-CSF en las diversas etapas de la carcinogénesis de colon, la expresión de GM-CSF se controló y se cuantifica, mediante ELISPOT, Western Blot, y RT- métodos de PCR. Para el GM-CSF ELISPOT, se prepararon células de PBMC recién aisladas y utilizadas para la detección de GM-CSF. Los resultados muestran un aumento gradual de los niveles de GM-CSF durante la progresión del cáncer de colon, especialmente en las etapas C2 y D (P & lt; 0,001) (Figura 4A, Figura S1). Por otra parte, la proteína GM-CSF y niveles de mRNA fueron significativamente mayores en K-ras positivo, los pacientes etapa D (p & lt; 0,001) (Figura 2A-B) en comparación con K-ras pacientes de control negativo y sanos, lo que indica una activación GM-CSF inducida durante la tumorigénesis de colon progresión de la etapa del cáncer (Figura 4A, Figura S1). Los resultados observados están de acuerdo con los hallazgos recientes que indican la importancia de GM-CSF en los procesos tumorigénicos K-ras de cáncer de colon positiva (vide infra). Manumycin A se añadió a las muestras de pacientes normales y de la etapa D (Figura 4A) y la proteína GM-CSF y niveles de mRNA en K-ras se determinaron los pacientes positivos (Figura 3A-B). Los resultados muestran que la inhibición de K-ras causa una disminución significativa en el GM-CSF mRNA y los niveles de proteína (P & lt; 0,001 para los niveles de proteína, P & lt; 0,05 para los niveles de ARNm), estableciendo así una correlación entre las dos moléculas
En (A) GM-CSF ELISPOT de PBMCs se obtuvo de los pacientes antes de la cirugía. Las células mononucleares se estimularon y se investigaron para la secreción de GM-CSF. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de los diferentes grupos. (B) IFN-gamma ELISPOT de PBMCs se obtuvo de los pacientes antes de la cirugía. Las células mononucleares se estimularon y se investigaron para la secreción de IFN-γ. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Los resultados se presentan como media ± desviación estándar de los diferentes grupos. Gran barra indica la comparación entre la etapa D del paciente y la etapa D + muestras de tratamiento Manumycin.
IFN-γ
Con el fin de examinar el efecto de la mutación K-RAS en IFN-γ durante las etapas de la progresión del cáncer colorrectal, se determinó el nivel de expresión de IFN-γ. Tal como se muestra (Figura 4B, 2A-B, Figura S1), IFN-γ es el regulado en pacientes con cáncer de colon en comparación con controles sanos. Además, hay una disminución significativa de la proteína y los niveles de mRNA de IFN-gamma entre K-ras negativas y K-ras individuos positivos (P & lt; 0,001), con lo que señala el efecto de K-ras de señalización en IFN-gamma baja regulación . Además, el tratamiento con Manumycin A causó un aumento en los niveles de expresión de IFN-γ, como se muestra por transferencia de Western y experimentos de RT-PCR (P & lt; 0,001 para los niveles de proteína, P & lt; 0,01 para los niveles de ARNm) (Figura 3A-B). Los resultados sugieren un mecanismo de K-ras de señalización de IFN-γ retroalimentación, que desempeña un papel importante en la carcinogénesis de colon.
Manumycin Una represión de la viabilidad y el crecimiento celular de células Caco-2
los resultados observados muestran por primera vez que ras inhibidor Manumycin a reduce la viabilidad celular en las células Caco-2 con cáncer de colon. El efecto de esta forma específica de inhibidor en la viabilidad de las células de cáncer de colon se examinó después de la incubación en un medio que contiene Manumycin A con concentraciones en el rango de 10 a 300 mM durante 24 horas. Las células incubadas en el medio en la ausencia de Manumycin A sirvieron como controles. Empleo del ensayo MTT reveló que la inhibición de la viabilidad celular en todas las células cancerosas de adenocarcinoma de colon Caco-2 probados se produjo de una forma dependiente de la dosis (Figura 5A-B). En detalle, la viabilidad celular se redujo significativamente de 90% (a 10 μΜ) a 40% (a 300 μΜ) (P & lt; 0,001), en comparación con el control. Los patrones observados de inhibición como una función de la concentración Manumycin A revelan las propiedades antitumorales de los inhibidores de ras en K-ras inducidas señalización cáncer de colon.
(A) ensayo MTT que muestra el efecto de Manumycin A sobre la viabilidad celular en el cáncer células Caco-2. Las células se trataron con diferentes concentraciones de Manumycin A durante 24 horas. La viabilidad celular se midió con un lector de placas de ELISA a 570 nm. ampliación de la imagen × 200. (B) Los resultados indican que Manumycin A inhibe la viabilidad de las células de adenocarcinoma de colon humano Caco-2 en una manera dependiente de la dosis. Los valores representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Manumycin A induce la apoptosis en (C) Caco-2 células de cáncer de adenocarcinoma de colon humano. Caco-2 apoptosis de las células se detectó usando el ensayo de detección de TUNEL de Roche. concentraciones Manumycin A: 10, 50, 100, 200 y 300 μΜ. La línea celular cancerosa se expone a Manumycin A en diferentes concentraciones durante 24 horas y se tiñe. células apoptóticas rojos fueron vistos usando un objetivo Carl Zeiss (Zeiss Europa) microscopio de fluorescencia. ampliación de la imagen × 200. (D) Los gráficos representan los resultados cuantitativos de la apoptosis. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.