Extracto
PRAME pertenece a un grupo de antígenos de cáncer /testículo (CTA) que se caracterizan por su expresión restringida en tejidos gametogénicos normales y una variedad de tumores. El
PRAME
familia es una de las familias de genes amplificados más en el ratón y otros genomas de mamíferos. Los miembros de las proteínas
PRAME
codifican familia de genes de repetición rica en leucina (LRR) que funcionan como reguladores de la transcripción en las células cancerosas. Sin embargo, el papel de PRAME en gónadas normales es desconocida. El objetivo de este estudio es caracterizar la expresión temporal y espacial del ratón
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gen, y para determinar la localización celular de la proteína PRAMEL1 durante la espermatogénesis del ratón. Nuestros resultados indican que el ratón
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se expresó en los testículos solamente. El nivel de mRNA y expresión de la proteína fue baja en los testículos recién nacidos, y aumentó gradualmente de 1 a 3 semanas de edad, los testículos, y luego se mantuvo constante después de tres semanas de edad. La tinción inmunofluorescente de secciones de testículo con el anticuerpo de ratón PRAMEL1 reveló que PRAMEL1 se localizó en el citoplasma de espermatocitos y la región acrosomal de ronda, alargando y espermátidas alargadas. análisis más detallados sobre la preparación testículo squash y espermatozoides en un nivel subcelular indicaron que los patrones de localización de proteínas de PRAMEL1 se coordinaron con alteraciones morfológicas durante la formación del acrosoma en espermátidas, y fueron significativamente diferentes en la pieza de conexión, pieza intermedia y la pieza principal del flagelo entre testicular y espermatozoides del epidídimo. En conjunto, nuestros resultados sugieren que PRAMEL1 puede jugar un papel en la biogénesis del acrosoma y la motilidad de los espermatozoides
Visto:. Mistry BV, Zhao Y, Chang T-C, Yasue H, M Chiba, Oatley J, et al. (2013) Expresión diferencial de PRAMEL1, un /testículo antígeno de cáncer, durante la espermatogénesis en el ratón. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10.1371 /journal.pone.0060611
Editor: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de diciembre de 2012; Aceptado: 28 Febrero 2013; Publicado: April 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Mistry et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el USDA-Nifa (concesión no. 2010-65205-20362) y la puesta en marcha de los fondos de la Universidad del Estado de Pensilvania a W-SL. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la espermatogénesis es un proceso biológico complejo que implica la proliferación mitótica de espermatogonias, la división meiótica de los espermatocitos y la diferenciación morfogenética de espermátidas de espermatozoides maduros. Durante la espermiogénesis, las espermátidas redondas experimentan cambios morfológicos y celulares dramáticos, incluyendo la formación del acrosoma, el alargamiento y la condensación del núcleo, la formación del flagelo, y la eliminación de citoplasma innecesaria, para producir espermatozoides altamente especializado y polarizado [1], [2 ]. El acrosoma es una vesícula de Golgi derivados situado en la región anterior de la cabeza del espermatozoide [3]. Desempeña un papel esencial en la fertilización por su implicación en el proceso de unión de esperma-óvulo y penetrar en el óvulo [4], [5]. Los machos de mamíferos que portan mutaciones que afectan a la biogénesis acrosoma son infértiles o subfértiles [4] - [7]. biogénesis acrosoma comienza en la fase tardía spermatocyte pachytene de la meiosis y continúa durante toda la primera mitad de la espermatogénesis [4], [5], [8]. Inicialmente, las vesículas se forman a partir proacrosomal aparato de Golgi y se montan en la región perinuclear, cerca de uno de los polos del núcleo en pachytene. Después de la terminación de la división meiótica, estas vesículas se fusionan entre sí para formar una única gran vesícula acrosomal que se fija a la envoltura nuclear de espermátidas redondas y continúa para ampliar mediante la adición de material derivado de Golgi [4], [8]. Durante la maduración de las espermátidas alargándose, el aparato de Golgi deja de contribuir a las glicoproteínas del acrosoma, y el complejo acrosoma-núcleo sufre grandes cambios morfológicos de adquirir una característica forma de los espermatozoides la especie dada "[8].
El flagelo de un espermatozoide de mamífero es una estructura compleja basada en microtúbulos importante y altamente organizado que proporciona la movilidad necesaria para que el esperma para alcanzar y fertilizar un óvulo [9]. Estructuralmente, se divide en cuatro componentes principales: la pieza de conexión, la pieza central, la pieza principal, y la pieza final [10]. Asamblea del flagelo comienza al principio de la espermiogénesis. Durante la biogénesis flagelo, un par de centriolos se mueve hacia el lado opuesto del acrosoma en desarrollo en el espacio perinuclear de la spermatid ronda, donde uno de los dos centriolos forma un axonema flagelar. Posteriormente, el axonema sobresale de la spermatid, produciendo el flagelo [8]. Más de 400 proteínas se han encontrado en el flagelo, pero sólo una fracción de las proteínas se han caracterizado a nivel molecular y demostrado que funcionan como estructural, metabólico o proteínas de señalización [11], [12].
antígenos de cáncer /testículo (CTA) son un grupo de proteínas que son altamente expresado en una amplia variedad de tumores malignos, pero su expresión en tejidos normales está restringida principalmente a testicular y células germinales de ovario [13] - [15]. Debido a su patrón de expresión característico, CTAs se utilizan como marcadores de pronóstico para un rango de tumores y también se consideran objetivos prometedores para la inmunoterapia del cáncer [16] - [18]. Al menos 70 familias de genes CTA que participaron más de 240 genes individuales (o isoformas) se han identificado hasta la fecha [19]. Estudios previos han sugerido que las CTA, en general, tienen un papel tanto en la tumorigénesis y la gametogénesis [14], [15], [20]. Sin embargo, información sobre la función y la localización celular precisa de CTA en células germinales y tejidos de cáncer es escasa en comparación con los datos de su expresión y la inmunogenicidad [13], [15].
antígeno expresa preferentemente en el melanoma (PRAME) es un miembro de la CTA, y fue identificado originalmente como un antígeno tumoral expresado en células de melanoma, la activación de una respuesta T citotóxica inmune mediada por células autólogas [21].
PRAME
es un gen de múltiples copias que representa una de las familias de genes amplificados la mayoría de los mamíferos euterios, con ~ 90 copias en el ratón, ~ 50 copias en el ser humano y ~ 30 copias en el genoma bovino [19] , [22], [23]. Curiosamente,
PRAME
ha sido transpuesta a y amplificados en el cromosoma Y en el linaje de bóvido, lo que sugiere un papel en la reproducción masculina [19]. Los miembros de
PRAME
proteínas de la familia de genes codifican LRR (repetición rica en leucina) que se pliegan en forma de herradura en su estructura terciaria. La función primaria de las proteínas LRR es proporcionar un marco estructural versátil para la formación de interacciones proteína-proteína en diversos procesos de reconocimiento molecular, incluyendo la transducción de señales, la adhesión celular, la regulación de la transcripción, el procesamiento del ARN, la apoptosis, la respuesta inmune, y la polarización celular [24 ] - [28]. Expresión y función de PRAME ha sido ampliamente estudiado en una variedad de células cancerosas, y la expresión de alto PRAME se correlaciona con la progresión del cáncer [28] - [30]. En las células de melanoma, las funciones de PRAME como un represor de ácido retinoico (RA) de señalización a través de la interacción con los receptores de RA (RARs) y el reclutamiento de proteínas Polycomb [27], [31]. Estudios recientes también han sugerido que las funciones de PRAME como un activador de la transcripción. Costessi
et al.
(2011, 2012) informó que PRAME es un componente de la ubiquitina ligasa E3 basado Cullin2 y es necesario para reclutar Cullin2 ubiquitina ligasa para el complejo EKC /KEOPS. Este complejo está asociado con los promotores activos regulados por el
factor de transcripción nuclear Y gratis (
NFY
) [29], [32]. Se postula que PRAME también juega un papel en la espermatogénesis. Como paso inicial para poner a prueba nuestra hipótesis y determinar la implicación molecular de la familia de genes PRAME en la reproducción, se optó por trabajar en el
Prame tipo 1 gratis (
Pramel1
) gen de ratón, un representante de la
Prame
familia de genes, que es homóloga a la humana
PRAME, España y está situado en el cromosoma del ratón (MMU) 4. en este trabajo, se caracterizaron los
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de genes con respecto a su patrón de expresión de ARNm y proteínas y localización celular durante el desarrollo de los testículos y la espermatogénesis.
resultados
análisis de la expresión temporal y espacial del ratón
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en los testículos
el patrón de expresión del ratón
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gen (acc. no. NM_031377) se examinó en 11 tejidos de ratones adultos por RT-PCR. A efectos comparativos, otros cinco parálogos del ratón
Prame
familia (X-ligados
Prame
,
Pramel3
, y
Pramel
, y MMU4- vinculada
Pramef8
y
Pramef12
) también fueron analizados (Tabla 1). Los resultados indicaron que los seis paralogs fueron altamente expresado en testículo, con diferentes niveles de expresión en los otros tejidos (Fig. 1). El
Pramel1
y
Prame
mRNAs se expresan específicamente en los testículos, mientras que
Pramel
,
Pramel3
,
Pramef8
, y
Pramef12
mRNAs se expresan predominantemente en los testículos con una baja expresión en el ovario, hígado, bazo, riñón, cerebro, pulmón, músculo y el timo (Fig. 1a). Para examinar más a fondo las expresiones temporales y espaciales de
Pramel1, España se realizó un tiempo de estudio durante el desarrollo de los testículos. Nuestros resultados de RT-PCR indican que, mientras que un nivel más bajo es el
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mRNA se expresó en el testículo recién nacido, se detectó un alto nivel de expresión constante en 1-a través de semana testículos 8 semanas de edad (Fig . 1b).
a. Análisis de la expresión espacial de seis
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parálogos entre 11 tejidos diferentes de ratones adultos.
Prame
y
Pramel1
se expresa específicamente en los testículos, mientras que
Pramel, Pramel3, Pramef8
y
Pramef12
se expresa predominantemente en los tejidos gametogénicos la mínima nivel de expresión en el hígado, los riñones, el cerebro, intestino delgado, pulmones, músculos y timo. segundo. análisis de expresión temporal de
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durante el desarrollo de los testículos. Bajo la expresión se observó en el testículo recién nacido, mientras que se observó una alta expresión constante en los testículos de los ratones de 1 a 8 semanas de edad.
Actb
se utilizó como control positivo. M: marcador; Ov: ovario; Te: testículo; Li: hígado; Sp: bazo; Ki: riñón; Br: cerebro; Si: intestino delgado; Ly: los ganglios linfáticos; Lu: pulmón; Mu: músculos; Th: timo; -.: Control negativo
Para determinar si la proteína PRAMEL1 se expresa en los testículos, se realizó un análisis de transferencia de Western de lisado toda testículos de ratones maduros utilizando un anticuerpo específico PRAMEL1. Como se muestra en la Figura 2a, el anticuerpo PRAMEL1 identificó una banda específica con un peso molecular de ~ 57 kDa, que es el peso molecular previsto para la proteína PRAMEL1 ratón (acc. No. NP_113554). Además, se observó una banda muy pequeño (~ 42 kDa) (Fig. 2a). Para probar la especificidad del anticuerpo, se realizó un control de pre-absorción con el péptido usado para generar el anticuerpo PRAMEL1, en el que no se detectó ninguna banda (Fig. 2a), lo que sugiere que el anticuerpo es PRAMEL1 específica y la banda menor requiere investigación exahustiva. Un tiempo de análisis de la proteína PRAMEL1 indicó, además, que su expresión en testículos era dependiente de la edad (Fig. 2b). El nivel de expresión de la proteína fue muy baja en la etapa de recién nacido (Fig. 2b), consistente con el bajo nivel de transcripción detectado por RT-PCR (Fig. 1b). La expresión se aumentó gradualmente de 1 a 3 semanas de edad, los testículos, y luego se mantuvo constante después de tres semanas de edad (Fig. 2B). Como control positivo, se utilizó un anticuerpo monoclonal β-actina (ACTB) anticuerpo para detectar ACTB, y una proteína esperado de 42 kDa se identificó (Fig. 2a, 2b).
a. Western blot de PRAMEL1. Los extractos de proteína a partir de testículos de ratón adulto se sometieron a análisis de transferencia Western usando un anticuerpo PRAMEL1 ratón. Se ha detectado un proteína inmune-reactivo con un peso molecular esperado de ~ 57 kDa en el testículo, y también se observó una banda muy pequeña de ~ 42 kDa. Como control positivo y la carga se utilizó un anticuerpo monoclonal ACTB, y se observó una proteína inmune reactiva esperado de 42 kDa. Como control negativo, se realizó un control de pre-absorción por el péptido usado para generar el anticuerpo PRAMEL1, y no se detectó ninguna banda. segundo. tiempo de análisis de la expresión de la proteína PRAMEL1 durante el desarrollo de los testículos. extractos de proteínas de recién nacido (Nb), 1-semana (1w), 2-semana (2w), 3-semana (3w), 4 semanas (4w) y 8 semanas (8w) testículos, viejas se sometieron a transferencia de Western con el anticuerpo PRAMEL1 ratón. El nivel de expresión de la PRAMEL1 se aumentó gradualmente de Nb a 3w y luego se mantuvo constante después de 3 semanas de edad. Los números de la izquierda indican los pesos moleculares de las proteínas estándar.
La localización de la proteína PRAMEL1 durante la espermatogénesis
Hemos investigado la expresión celular, espacial y temporal de la proteína de las células germinales durante PRAMEL1 desarrollo por microscopía de inmunofluorescencia indirecta. Inicialmente, se analizó la localización de la proteína PRAMEL1 en las secciones transversales de los testículos de ratones jóvenes, desde recién nacidos hasta 3 semanas de edad. Como se muestra en la Fig. 3, no hubo un patrón de tinción específica observada para el anticuerpo PRAMEL1 través de la sección en los testículos 1-semanas de edad (Fig. 3a, c), aunque se observó débilmente inespecífico tinción de fondo tanto para el anticuerpo PRAMEL1 (Fig. 3a, c) y el control de péptido-absorbida previamente (Fig. 3d). Esto podría ser una consecuencia del relativamente bajo de expresión de la transcripción y de la proteína en esta etapa (Fig. 1b y 2b). En comparación con el control de péptido pre-absorción, donde se observó algo de tinción no específica (Fig. 3i), la tinción específica se observó para el anticuerpo PRAMEL1 principalmente en el citoplasma de espermatocitos en testículos 2 semanas de edad (Fig. 3f, h) . Cuando los ratones llegó a las 3 semanas de edad, una tinción muy singular y fuerte fue detectado por el anticuerpo PRAMEL1 en la región perinuclear de espermátidas redondas (Fig. 3k, m), donde se observó una estructura similar a una tapa en la superficie nuclear (Fig . 3m).
las secciones transversales de 1 semana (a-e), 2 semanas (f-j) y 3 semanas (k-o) testículos de ratón, viejas se tiñeron con el ratón PRAMEL1 anticuerpo. Aunque hubo no se observó ninguna señal específica observada a través de los túbulos seminíferos en 1-semanas de edad, los testículos, la tinción específica (verde) en el citoplasma de espermatocitos (f, h) en 2-semanas de edad, los testículos y la región perinuclear de espermátidas redondas ( k, m) en el testículo 3 semanas de edad. Los paneles a, f, k son la tinción de anticuerpos PRAMEL1. Paneles B, G y L son de contraste con DAPI para visualizar los núcleos. Paneles c, h y m son las imágenes fusionadas para la tinción DAPI y PRAMEL1. Las puntas de flecha apuntan a un área con señales descritas. Paneles d, i y n son la tinción de anticuerpos péptido-preabsorbed como control negativo. Paneles E, J y O son H & amp; E tinción para mostrar la estructura y tipos de células de los túbulos seminíferos. La ampliación es × 400. Barra de escala = 20 micras.
A fin de examinar si la estructura similar a una tapa en la superficie nuclear de espermátidas redondas se encuentra en el lado anterior o posterior, el anticuerpo PRAMEL1 ratón junto con la β-tubulina ( TUBB) anticuerpo que se tiñe específicamente en el lado posterior de espermátidas [33], se aplicaron a secciones transversales de los testículos de ratones adultos. En condiciones de baja ampliación (× 400), como la diferenciación de las ganancias epitelio seminífero, PRAMEL1 se puede ver en la región perinuclear de las células germinales post-meióticas (redonda, alargando y espermátidas alargadas) (Fig. 4a, e, i), mientras TUBB fue vista en el lado opuesto de la tinción PRAMEL1 en los alargando y alargados espermátidas (Fig. 4e, i), lo que indica que la proteína PRAMEL1 se encuentra en el lado anterior (
es decir
acrosoma) de la región nuclear en espermátidas de ratón. Un examen más detallado de las secciones de testículo manchadas immunofluorescently-a mayor aumento (× 1000) mostró que la proteína PRAMEL1 fue visto por primera vez en espermátidas redondas, donde fue estrechamente asociada con una estructura similar a una tapa en la superficie nuclear (Fig. 5a, b ). En comparación con la sección de testículo, la preparación aplastado de espermátidas redondas ofrece más detalles sobre el patrón de tinción, donde PRAMEL1 se observó principalmente en la vesícula acrosomal, con poca o ninguna tinción en la región acrosomal gránulos (Fig. 5b). Este patrón coincidió con la formación de la vesícula acrosomal que se extiende en una capa delgada sobre el polo del núcleo para formar la tapa acrosomal. En esta etapa, no se observó tinción para TUBB porque el flagelo aún no se había formado (Fig 4a-d;. La Fig. 5a, b). En particular, el patrón de localización PRAMEL1 cambia de acuerdo con las alteraciones morfológicas que ocurren en el acrosoma y el núcleo durante la espermiogénesis (Fig 4a, e, i;. Fig. 5a-g). Cuando las espermátidas redondas comienzan a alargarse y el flagelo comienza a desarrollarse, TUBB fue vista en el lado opuesto de la tinción PRAMEL1 en la región perinuclear, que marca la posición de desarrollo manchette y la formación de flagelo (Fig 4E, i;. Fig. 5C- gramo). Con el progreso de la morfogénesis spermatid, la tinción de proteínas PRAMEL1 expandió sobre aproximadamente un tercio de la superficie nuclear, imitando desarrollo acrosoma (Fig. 5a-g). Por lo tanto, nuestros resultados indican claramente que la proteína PRAMEL1 se asocia con el acrosoma en espermátidas. Como controles negativos, las secciones se tiñeron o bien con el anticuerpo primario pre-absorción con el péptido respectivo o sólo con el anticuerpo secundario. No se detectó ninguna señal de fluorescencia en las secciones de control, lo que indica que la tinción no específica fue mínima. (Fig 4 m-p;. Fig. 5h)
Las secciones transversales de los adultos (≥ 2 meses de edad) fueron los testículos de ratón doble teñidas con el ratón PRAMEL1 (verde) y anticuerpos TUBA (rojo). La tinción PRAMEL1 se observó en la ronda (a), el alargamiento de (e) y (i) espermátidas alargadas durante la espermiogénesis. La tinción se observó en TUBA alargamiento (f) y (j) espermátidas alargadas, pero no en espermátidas redondas (b). Todas las secciones se contratiñeron con DAPI (paneles c, g, k y o) para visualizar los núcleos. Paneles d, h, l y p se combinan imágenes de PRAMEL1, tuba y DAPI. Las puntas de flecha apuntan a un área con señales descritas. Las inserciones en d, h, l y la imagen se amplían para las zonas de punta de flecha marcada (véase también la Fig. 5a, C, E y G). Paneles M y N son los controles anticuerpo secundario durante burro marcada con FITC anti-IgG de cabra y burro marcada con TRITC anti-IgG de ratón, respectivamente. La ampliación es × 400. Barra de escala = 20 micras.
secciones de testículo (A, C, E y G) y preparaciones de squash de túbulos seminíferos (B, D, F y H) se tiñeron con anti-PRAMEL1 (verde) , anti-TUBB (rojo) y DAPI (azul). las imágenes fusionadas para el triple tinción en espermátidas redondas (ayb), alargándose espermátidas (c, d, eyf) y espermátidas alargadas (g) se muestran. La tinción PRAMEL1 se observó en la región de la vesícula acrosómica de todas las espermátidas en desarrollo y se observó la tinción TUBB en el manchette de alargarse y espermátidas alargadas. Como una preparación secundaria testículo calabaza anticuerpo de control (h) se tiñó con el burro marcada con FITC anti-IgG de cabra y burro marcada con TRITC anti-IgG de ratón. La ampliación es × 1000. Barra de escala = 10 micras.
La localización de PRAMEL1 en los testículos y del epidídimo los espermatozoides
Además, investigó la distribución subcelular de PRAMEL1 en espermatozoides testiculares /epidídimo mediante la realización de la tinción de inmunofluorescencia indirecta, utilizando el PRAMEL1- y α-tubulina (TUBA) anticuerpos específicos. Los espermatozoides fueron recogidos de los túbulos seminíferos de los testículos aplastados maduros, y caput, corpus y cauda regiones del epidídimo. Los resultados revelaron que, similar a la tinción en espermátides, PRAMEL1 se localiza principalmente a la región acrosoma anterior de los espermatozoides (Fig 6a, b, d, e;. Tabla 2). Como se observaron diferentes patrones de tinción entre testicular y espermatozoides del epidídimo, más de 200 espermatozoides de cada grupo (Tabla 2) fueron examinados para estudiar la localización detallada de la proteína PRAMEL1 en células de esperma. Se encontró que todos los espermatozoides testiculares (100%) mostraron acrosomal localización de PRAMEL1, mientras que sólo el 86,5% de los espermatozoides del epidídimo fueron positivos para PRAMEL1 en la región acrosomal (Tabla 2). Por otra parte, PRAMEL1 se observó en la pieza principal del flagelo (41%) de espermatozoides testiculares (Fig. 6a, Tabla 2), mientras que se observó en la pieza de conexión (96%) y la pieza intermedia (87,9%) en los espermatozoides del epidídimo (caput, corpus y cauda) (figura 6a, b, d, e;. Tabla 2). PRAMEL1 tinción también fue visto en gota citoplasmática de espermatozoides del epidídimo (Fig. 6d). Se encontró que el 55% de los espermatozoides del epidídimo tenía gotas citoplasmáticas situadas en el extremo distal de la pieza intermedia. Alrededor de 73% de los espermatozoides citoplásmica gotita-cojinete mostró la señal PRAMEL1 en la gota citoplasmática (Fig 6d;. Tabla 2). También se observó que el porcentaje de espermatozoides citoplasmática gotita que devengan varió entre los tres ratones estudiados. Por tanto testicular y espermatozoides del epidídimo, no se observó tinción PRAMEL1 en la región de corona circular del flagelo. TUBA se localizó en la región acrosomal anterior de cabezas de espermatozoides, y la pieza intermedia y pieza principal del flagelo de espermatozoides del epidídimo de los espermatozoides (Fig. 6a, b, d, e). No se observó ninguna señal cuando se omitieron los anticuerpos primarios durante la tinción, lo que sugiere un mínimo la unión no específica de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia (Fig. 6c, f).
espermatozoides de ratón recogido a partir de preparaciones de squash de los túbulos seminíferos (una , B y C) y del epidídimo (d, eyf) se tiñeron con la PRAMEL1 (verde), tuba (rojo) anticuerpos y DAPI (azul). La tinción PRAMEL1 se observó en la región de acrosoma testicular y espermatozoides del epidídimo (a, b, d y e). En espermatozoides testiculares (a) PRAMEL1 fue también detectado en la pieza principal del flagelo de espermatozoides, mientras que en los espermatozoides del epidídimo (D y E) se observó la tinción PRAMEL1 predominantemente en la pieza de conexión, pieza intermedia y la gota citoplasmática. Como control anticuerpo secundario los espermatozoides testicular (c) y del epidídimo (f) se tiñeron con burro marcado con FITC IgG anti-cabra de burro y marcada con TRITC anti-IgG de ratón. Magnificación × 1000. Barra de escala = 10 micras.
Discusión
A pesar de PRAME ha sido ampliamente estudiado en la tumorigénesis y la biología del cáncer, y está siendo utilizado como un biomarcador para el diagnóstico del cáncer y el antígeno la inmunoterapia específica del cáncer [28] - [32], [34], la función de la familia de genes PRAME en la gametogénesis y la reproducción no se ha caracterizado. En el presente estudio, se caracterizó la expresión del ARNm y la proteína del ratón
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gen, un miembro de la
Prame
gen de la familia, durante el desarrollo de los testículos y la espermatogénesis. Nuestros resultados indican claramente que PRAMEL1 se expresa en el citoplasma de los espermatocitos y el acrosoma y el flagelo de espermátidas y espermatozoides, que proporcionan una primera visión de la función potencial de la
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familia de genes en la espermatogénesis. Con el fin de comprender el papel biológico (s) de toda esta familia de genes y la relación entre el
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y otros miembros de la familia, se recuperan los datos expresivos de un total de 10
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parálogos de la Expresión génica Omnibus (GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (Tabla 3) [35] - [40]. Combinado con los datos de RT-PCR obtenidos a partir de este trabajo, hemos sido capaces de agrupar estos paralogs en tres grupos principales en base a sus perfiles de expresión espacial y temporal: el grupo I, expresa sólo en las gónadas masculinas y de células germinales (
Prame
y
Pramel1
); el grupo II, expresa sólo en las gónadas femeninas y de células germinales (
Oog1-3
); y el grupo III, predominantemente expresa tanto en las gónadas masculinas y femeninas (
Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12, España y
Oog4
) (Tabla 3). En conjunto, los patrones de expresión divergentes de los
Prame
parálogos durante la gametogénesis en tanto hombres como mujeres indican que los diferentes miembros de la
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familia de genes pueden estar involucrados en diferentes etapas de desarrollo de la gametogénesis y la embriogénesis.
se ha informado en estudios anteriores que diferentes CTA están involucrados en diferentes etapas de la espermatogénesis. Algunos de los cuales se expresan exclusivamente en una sola etapa, como SYCP1 (
synaptonemal complejo proteína 1 |, también conocido como HOM-TES-14), que se limita a la profase meiótica de los espermatocitos y SP17 (
proteína de esperma 17
), que se expresa en los espermatozoides maduros Sólo [41], [42]. Otros CTA como CTAG1 (
cáncer /testículo antígeno 1 |, también conocido como NY-ESO-1) y la TRO (
trophinin
, también conocido como
magphinin
o MAGE -D3), se expresa en varias etapas de la espermatogénesis. CTAG1 se expresa en espermatogonias través pachytene [43], [44], mientras que TRO se expresa en casi todos los tipos de células germinales de las espermatogonias de espermatozoides maduros [45]. En el presente estudio, hemos demostrado que, al igual que el
gen Tro
, el ratón
Pramel1
se expresa ampliamente en diferentes tipos de células germinales durante la espermatogénesis. La proteína PRAMEL1 fue detectado por primera vez, aunque a un nivel relativamente bajo, en los testículos recién nacidos por Western Blot, lo que sugiere la expresión de PRAMEL1 en espermatogonias. Se detectó un aumento gradual nivel de PRAMEL1 en los testículos en 1-, 2-, 3-semanas de edad y se mantuvo a un nivel más alto en los testículos maduros. Este aumento de la expresión de la proteína coincide con el aumento de la expresión de ARN de recién nacido a los testículos 1 semanas de edad, y podría explicarse por una regulación de la expresión génica o, alternativamente, por un aumento en el número de células germinales ya que hay es la proliferación de células germinales dramática antes de la primera ola de la espermatogénesis.
a diferencia de las células cancerosas en el que la proteína PRAME se localizó en el núcleo, el ratón PRAMEL1 fue visto por primera vez en el citoplasma de espermatocitos en 2 semanas de edad testículos en este estudio. A continuación, se observó una expresión dominante de la proteína PRAMEL1 en la región anterior (redonda, alargando y alargada) espermátidas, en coordinación con las alteraciones morfológicas del acrosoma, lo que sugiere que el
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juega un papel en el desarrollo del acrosoma . Por otra parte, se observó que PRAMEL1 se distribuyó diferencial a lo largo de diferentes partes del flagelo de espermatozoides entre los testículos y espermatozoides del epidídimo. A medida que la motilidad ganancia de espermatozoides durante la transición de testículo a la región caudal del epidídimo, la localización diferencial de PRAMEL1 a lo largo de diferentes partes del flagelo durante la transición de esperma puede ser una indicación de que PRAMEL1 está implicada en la maduración del esperma y la motilidad (véase la discusión más adelante ).
estudios anteriores en células de cáncer demostraron que las funciones de PRAME, ya sea como un supresor de la transcripción de la AR señalización [27], o como un activador de la transcripción en regiones promotoras obligado por NFY [29], [32]. Sin embargo, nuestros datos sugieren que
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no podrán participar en la regulación de la transcripción a través de mecanismos mediados por RA ^ y NFY porque (1) PRAMEL1 se localiza en el citoplasma de las células germinales durante la espermatogénesis, y (2) que es más importante, la transcripción se apaga durante la mitad de la espermatogénesis [27], [29], [31] y los espermatozoides son células terminales diferenciadas esencialmente carentes de actividad de transcripción y la traducción [46].
vale la pena señalar que dos LRR- que contiene, proteínas testículo-expresó han sido implicados en la espermatogénesis, es decir LRRC67 (
repeticiones ricas en leucina que contiene 67
, también conocido como LRR testículo o TLRR) y PPP1R7 (
proteína fosfatasa 1, reguladora (inhibidor) subunidad 7
, también conocido como Sds22) [47], [48]. Ambas proteínas interactúan con una fosfatasa central,
proteína fosfatasa 1
(PP1), que sirve como un gen hub en varios procesos de regulación [46] - [48]. La proteína LRRC67 interactúa con PP1 para formar un complejo implicado en la reorganización del citoesqueleto en células germinales masculinas [49]. La proteína LRRC67 también interactúa con un motor molecular relacionado con la quinesina, KIFC1 (
kinesin miembro de la familia C1
), para el transporte de moléculas a lo largo de los microtúbulos en el manchette [33], [50]. Del mismo modo, la interacción de PP1 y PPP1R7 también se ha implicado en el desarrollo del esperma. La dimerización de PPP1R7 y PP1γ2 conduce a una disminución de la actividad fosfatasa de PP1γ2 y posteriormente induce la motilidad de los espermatozoides caudal [51], [52]. Debido a los patrones estructurales y de expresión similares, predecimos que PRAMEL1 puede interactuar con PP1γ2 para el transporte de moléculas a lo largo de los microtúbulos en el flagelo de espermatozoides. Queda por determinar si PRAMEL1 realiza la función similar en la formación de espermatozoides y la motilidad del acrosoma.
Materiales y Métodos
Animales
C57BL /6J fueron criados en nuestra colonia en la instalación del ratón de la Universidad Estatal de Pensilvania, y un total de seis pares de criadores se establecieron. Los testículos fueron retirados de ratones a 0 días (recién nacido), 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas y 8 semanas de edad. Al menos tres animales (biológicas repeticiones) se utilizaron para cada edad. Testículos, epidídimo y otros tejidos de los criadores de adultos varones y los ovarios de las hembras criadores fueron recolectados después de la época de cría. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania (IACUC).
Preparación de tejidos testicular
En la histología testicular, testículos enteros fueron disecados de los ratones adultos y fijo por incubación durante la noche en solución de Bouin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 4 ° C. a continuación, los tejidos se lavaron en 70% de etanol, deshidratado, y se incluyeron en bloques de parafina. Los tejidos incluidos en parafina se seccionaron a 4 micras utilizando un microtomo y se montaron en portaobjetos de vidrio.
muestras de testículo Squashed se prepararon como se describe anteriormente [53]. Brevemente, los testículos adultos fueron extirpados y se transfieren a un plato de vidrio de Petri que contiene PBS enfriado en hielo (NaCl 140 mM, KCl 2,6 mM, Na 6,4 mM
2HPO
4, y KH 1,4 mM
2 PO
4, pH 7,4). Después de retirar la túnica albugínea, túbulos seminíferos se transfirieron a una nueva placa de Petri que contiene PBS. Con unas pinzas finas, los túbulos se tira suavemente aparte y se cortó un pedazo pequeño de solo túbulo. La pieza de túbulo seminífero se transfirió a una nueva placa de Petri y se añadieron 15 a 30 l de solución 0,1 M de sacarosa preparada en PBS. Las células se liberaron de los túbulos por la depilación con pinzas aparte del túbulo y re-suspensión en la solución de sacarosa pipeteando arriba y abajo.