Extracto
Antecedentes
acuaporina 3 (AQP3) y Aquaporin4 (AQP4) juegan un papel importante en el movimiento transcelular y agua transepitelial como proteínas de la membrana de los canales de agua. Poco se sabe de su expresión y la importancia de los tejidos tiroideos humanos. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de AQP3 y AQP4 en los tejidos normales, hiperplásicos y neoplásicos de la tiroides en conjunción con líneas celulares de cáncer de tiroides humana.
Métodos y Resultados
análisis
inmunohistoquímica demostró AQP3 en la membrana citoplasmática de las células normales de C, pero no en las células foliculares. Por el contrario, AQP4 no se encontró en células C pero se identificó en células foliculares normales. AQP4 fue positiva en el 92% de las tiroides enfermedad de Graves y el 97% de bocio multinodular, y que no pudo demostrar AQP3 en estos tejidos hiperplásicos. En las lesiones neoplásicas de la tiroides, se observó AQP3 en el 91% de los carcinomas medulares de tiroides, pero no en otros tumores de células foliculares. AQP4 se demostró en el 100% de los adenomas foliculares, el 90% de los carcinomas foliculares, y el 85% de los carcinomas papilares, mientras que fue negativa en todos los carcinomas medulares y carcinomas indiferenciados. reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), análisis reveló la expresión de ARNm AQP3 sólo en los carcinomas medulares y expresión AQP4 ARNm en tumores derivados de células foliculares, excepto para los carcinomas indiferenciados. En líneas celulares de cáncer de tiroides, mediante RT-PCR y Western Blot, ARNm y proteínas AQP3 solamente se identificaron en la línea celular TT (línea celular de carcinoma medular humano) y AQP4 en las otras líneas celulares. Además, la expresión de ARNm AQP3 fue hasta reguladas por SFB y la administración de calcio, tanto en una dosis y tiempo dependiente en las células TT.
Conclusión
Las expresiones diferenciales de AQP3 y AQP4 siempre son representativas de la naturaleza biológica y /o función de lo normal, hiperplásico, y las células tiroideas neoplásicas y, además, pueden tener valor para determinar el diagnóstico diferencial de los tumores tiroideos
Visto:. Niu D, Kondo T, T Nakazawa, Kawasaki T, T Yamane , Mochizuki K, et al. (2012) Expresión diferencial de las acuaporinas y su utilidad diagnóstica en el cáncer de tiroides. PLoS ONE 7 (7): e40770. doi: 10.1371 /journal.pone.0040770
Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia |
Recibido: 28 de abril de 2012; Aceptado el 13 de junio de 2012; Publicado: 10 de julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Niu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de tiroides es la neoplasia maligna más común del sistema endocrino órganos, con el aumento de las tasas de incidencia de forma constante durante las últimas décadas. Más de 95% de los carcinomas de la tiroides se derivan de las células foliculares que tienen un espectro de diferenciación de los carcinomas comparativamente indolentes, incluyendo el carcinoma folicular de tiroides y carcinoma papilar de tiroides, carcinoma poco diferenciado y carcinoma indiferenciado de tiroides. Otra carcinoma de tiroides se origina en la célula C tiroidea es el carcinoma medular que se produce de forma esporádica o como parte de la hereditaria, autosómica dominante, la neoplasia endocrina múltiple (MEN) tipo 2A y tipo 2B [1].
El acuaporinas ( AQPs) son una familia de pequeñas proteínas de ~ 30 kDa /monómero) de membrana (que sirven como proteínas de los canales de agua que juegan un papel importante en el movimiento transcelular y transepitelial de agua [2] - [4]. La familia AQP se puede dividir en 3 subgrupos basándose en sus secuencias primarias: las acuaporinas (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 y AQP8) que sólo transportan el agua, aquaglyceroporins (AQP3, AQP7, AQP9 y AQP10) que son responsables de el transporte de agua, glicerol y otros solutos pequeños [5], y superaquaporins pertenecientes a una nueva subfamilia (AQP11 y AQP12) [6], [7].
acuaporina 3 (AQP3) es un típico aquaglyceroporin transporte de agua, glicerol y urea que juega un papel importante en la homeostasis de fluidos en los tejidos normales [8] - [10]. Actualmente, AQP3 se ha demostrado en muchas células epiteliales de la orina, digestivo y las vías respiratorias [11] - [14], renales [15] - [17], epidermis [18], [19], ojo [20], cerebro [17], páncreas [21], y de próstata [22], en estos tipos de células, de alta permeabilidad al agua está asociado con una función fisiológica se define en la reabsorción o la secreción. Recientemente, se ha informado de que la expresión de AQP3 puede estar relacionado con la tumorigénesis y la proliferación en los carcinomas de varios órganos, como la piel [23], [24], colon [25], el riñón [26], y ovario [27].
AQP4 es una proteína transmembrana que regula la entrada de agua dentro y fuera de las células específicas; que se expresa principalmente en el riñón y el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos [28]. La regulación a la baja de AQP4, que ha sido descrito anteriormente, da lugar a la supresión de edema cerebral en respuesta a la intoxicación por agua y accidente cerebrovascular que mejora los índices clínicos de la supervivencia y el estado neurológico [29], [30]. El nivel de expresión alto de AQP4 se ha informado en glioma [31]. glioblastoma [32], [33], y meningioma [34]. Sin embargo, el mecanismo de participación AQP4 en los tumores cerebrales es todavía bajo investigación.
A nuestro entender, la información es muy limitada disponible sobre la expresión o la importancia de AQP3 y AQP4 en los tejidos de la tiroides. Para aumentar nuestra comprensión de este mecanismo biológico básico en las células normales y enfermas de la tiroides, se analizó la expresión de acuaporina (AQP3 y AQP4) en condiciones normales, hiperplásico, y los tejidos tiroideos humanos neoplásicos en conjunción con varias líneas celulares de cáncer de tiroides mediante inmunohistoquímica y técnicas moleculares. También se discute la utilidad y las implicaciones de la expresión de acuaporina para el diagnóstico y el desarrollo de tratamientos para los tumores tiroideos
(A) La inmunofluorescencia doble tinción muestra AQP3. (FITC: verde) que expresa en las membranas citoplasmáticas de lo normal C humana las células que son positivas para la calcitonina (TRCR: rojo), pero no en las células foliculares. (B) tinción de inmunoperoxidasa también muestra que AQP3 es positiva sólo en las células C y no en las células foliculares. (C) El análisis de inmunofluorescencia exhibe proteína AQP4 (FITC: verde) en las membranas citoplasmáticas de las células foliculares. Los núcleos se tiñen por DAPI (azul). (D) positividad proteína AQP4 tiende a ser más fuerte en las células foliculares altos de pequeños folículos. células foliculares hiperplásicas en la enfermedad de Graves (E) y bocio multinodular (F) de visualización prominente de positividad AQP4 en sus membranas citoplasmática. (Ampliación: A, C, 1000x, B, D, E, F, 400x).
Materiales y Métodos
Selección de casos
Se investigaron 164 quirúrgica Las muestras de pacientes con diversas lesiones tiroideas, incluyendo 12 casos de tiroides enfermedad de Graves, bocio multinodular 38, 20 adenomas foliculares, 52 carcinomas papilares, 10 carcinomas foliculares, carcinomas indiferenciados 10, y 22 carcinomas medulares. También se examinaron los tejidos tiroideos normales adyacentes a los tumores. tejidos renales humanos normales se obtuvieron de pacientes que fueron sometidos a nefrectomía subtotal o total para el carcinoma renal. Los tejidos se congelaron se almacenaron a -80 ° C antes del aislamiento posterior de su proteína.
inmunorreactividad de AQP3 es negativo en adenoma folicular (A), carcinoma folicular (B), y el carcinoma papilar (C). Por el contrario, AQP3 es claramente immunopositive en las membranas citoplasmáticas de las células de carcinoma medular (D). (Ampliación: 400x).
Todas las diapositivas recibido hematoxilina-eosina (HE) tinción, y las lesiones fueron diagnosticadas a través del diagnóstico patológico quirúrgica de rutina sobre la base de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud [1]. Los protocolos de estudio fueron aprobados por el Consejo de Ética Institucional de la Universidad de Yamanashi.
AQP4 es difusamente immunopositive en las células neoplásicas de los adenomas foliculares (A), carcinomas foliculares (B), y carcinomas papilares (C), pero negativa en el carcinoma medular (D). (Ampliación: 400x) guía empresas
Líneas celulares y cultivo celular
Se utilizó 8 tiroides humano líneas celulares derivadas de carcinoma:. KTC-1, TPC-1, WRO, 8305C, 8503C y TT se han descrito anteriormente [35], [36], y UA-1 y UA-2 se establecieron originalmente líneas celulares derivadas de carcinoma indiferenciado humana [37]. Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, EE.UU.) y suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), sulfato de estreptomicina (100 mg /L), y penicilina G sódica (100 mg /L). Las células se cultivaron en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera.
RT-PCR muestra mRNA AQP3 sólo en carcinomas medulares (MC), y ausente en los tejidos normales de la tiroides ( NT), bocio multinodular (MG), adenomas foliculares (FA), carcinomas papilares (PC), y carcinomas indiferenciados (UC). Por el contrario, AQP4 ARNm se demuestra en NT, MG, FA, y PC, y negativa en toda la UC y MC.
Las células TT se sembraron en una placa de 10 cm hasta 80% de confluencia y después de privación de suero durante 24 horas. Ellos se trataron a continuación en un medio con concentraciones graduadas de FBS (0%, 1%, 5% y 10%) durante 24 horas. Las células también se cultivaron en medio con FBS al 5% para variar los tiempos de 0, 4, 8, 12, 16, 24 y 36 horas. Se han tratado la línea celular TT con una serie de concentraciones de calcio (0, 0,1, 1 y 10 UM) (Wako, Tokio, Japón) y también con 10 M de calcio durante 0, 4, 8, 12, 16, y 24 horas .
(a) RT-PCR análisis muestra que AQP3 ARNm se identifica específicamente en la línea celular TT, mientras que AQP4 se detecta en las líneas derivadas de células foliculares (KTC-1, TPC-1, WRO, UA -1, UA-2, y 8505C). (B) transferencia de Western confirma que la proteína de AQP3 se ve en la línea de células TT y no en las otras líneas celulares. AQP4 proteína se identificó en cinco líneas celulares (KTC-1, TPC-1, UA-1, UA-2, y 8505C), mientras ausente en tres líneas celulares (TT, 8305C y WRO).
La inmunohistoquímica
Se realizó la tinción inmunohistoquímica en secciones de 3 micras de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina. Un protocolo detallado se ha descrito anteriormente [37], [38]. Brevemente, las secciones desparafinadas se incubaron con el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad para rata /humano AQP3 en 1:500 dilución [39] o el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad a AQP4 humana en 1:1000 dilución (Sigma, St. Louis, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar 3 veces con PBS, las secciones se incubaron con el polímero marcado (peroxidasa Envision /rábano picante, DAKO, Glostrup, Dinamarca) durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilizamos células normales /de tejido del conducto colector del riñón como un control positivo y omitió el anticuerpo primario para el control negativo. Las cantidades de la inmunorreactividad de AQP3 y AQP4 se evaluaron usando una escala de clasificación de 0 a 3+: 0, ninguna inmunorreactividad; 1+, inmunoreactividad focal (1% a 9% de células positivas); 2+, inmunoreactividad intermedia entre 1+ y 3+; 3+, inmunoreactividad difusa (más de 50% de células positivas).
(A) Nivel de AQP3 mRNA se incrementa significativamente por 5% y 10% de FBS tratamientos. nivel (B) AQP3 ARNm es significativamente hasta regulado por la administración de calcio de una manera dependiente de la dosis. Las barras de error, desviación estándar. diferencia significativa, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & lt; 0,01
Immunohistofluorescence
También llevó a cabo el doble immunohistofluorescence en secciones de 3 micras de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina mediante un enfoque secuencial para anticuerpos primarios obtenidos de la misma especie. Las secciones tratadas se incubaron con el primer anticuerpo primario de anticuerpo policlonal de conejo a la rata /AQP3 humano a una dilución 1:500 a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, con porcina anti-conejo de isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una dilución de 1:20 (DAKO, Tokio, Japón) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de enjuagar 3 veces, las secciones fueron re-fijaron en formalina a temperatura ambiente durante 1 hora y se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo a la calcitonina humana (DAKO, CA, EE.UU.) a una dilución 1:5000 a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, con anti -rabbit fluoresceína rodamina a una dilución 01:40 (DAKO, Tokio, Japón) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los núcleos se contratiñeron con 4 ', 6-diamiono-2-fenilindol (DAPI). Hemos visualizado fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia epi-iluminante (BX50, Olympus, Tokio, Japón).
El aislamiento de proteínas y Western Blot
Cultivar las células y los tejidos renales se lisaron en un homogeneizador Polytron en una ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón de lisis con inhibidores de proteinasa (1 × solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1% Nonidet P40, desoxicolato de sodio 0,5%, 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 1 mmol /L fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 12 mg /ml de aprotinina, y ortovanadato de sodio 1 mmol /L).
cantidades iguales de proteína (30 mg) solubilizados en tampón de muestra se separaron sobre 10% de geles de SDS poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas. Las membranas se bloquearon en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,05% de Tween 20 y 5% de leche sin grasa seca durante 1 hora a temperatura ambiente y se sondaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche
.
Los anticuerpos primarios se utilizaron a las diluciones especificadas: anticuerpo policlonal de conejo anti-AQP3 en 1:2000 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) y el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad a AQP4 humana en 1:2000 (Sigma, St. Louis, EE.UU.) y el ratón monoclonal a la actina beta a dilución 1:5000 (Abcam, Cambridge, UK). Las membranas se lavaron tres veces durante 10 min cada uno en TBS que contiene 0,05% de Tween-20 y se incubaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) de cabra conjugado con anti-conejo o anticuerpo secundario anti-ratón a una dilución 1:2000 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.) durante 1 hora a temperatura ambiente. proteínas específicas se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido).
La extracción de RNA, síntesis de cDNA, RT-PCR cuantitativa y PCR en tiempo real
aisló el ARN total de tejidos de la tiroides a partir de secciones de 10 micras de fijado en formol e incluidos en parafina tejidos utilizando Recuperar kit de aislamiento All ™ total de ácidos nucleicos (Applied Biosystems, Nueva Jersey, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. El ARN total de las células cultivadas se aisló utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.), y se generó ADNc usando el kit de reactivos TaqMan transcripción inversa (RT) (Applied Biosystems, Nueva Jersey, EE.UU.). cebadores de PCR específicos dirigidos para AQP3, AQP4, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y PGK1 se diseñaron como se indica en la Tabla 1. GAPDH [40] y PGK1 [41] se utilizaron como controles internos. La amplificación se realizó utilizando ADN polimerasa HotStarTaq kit (Qiagen, Tokio, Japón). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: (1) 95 ° C durante 15 min; (2) 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C o 58 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 1 min; (3) 72 ° C durante 10 min; y (4) mantenimiento a 4ºC. Los controles negativos omitiendo RT o sin cDNA y controles positivos apropiados se incluyeron en cada reacción de PCR.
-PCR en tiempo real se llevó a cabo con MyiQ ™-solo color en tiempo real PCR sistema de detección (Applied Biosystems, CA, EE.UU. ). Aproximadamente 2,5 l de cDNA se amplificó en cada 25 l de mezcla de reacción PCR que contenía 12,5 l de 2X SYBR Green Master Mix (Qiagen), además de 0,75 l cada uno de los 10 mmol adelante y cebadores y 8,5 l de agua tratada con DEPC revertir. volumen total de reacción fue de 25 l. Empezamos amplificación a 95 ° C durante 15 min como el primer paso, seguido sucesivamente por 45 ciclos de PCR a 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 60 s. La cantidad de ARNm del gen diana se normalizó a la de GAPDH utilizando el método? Ct, como se describe en el protocolo del fabricante.
Estadísticas
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. La significación estadística se fijó en
p Hotel & lt; 0,05. Los datos fueron analizados con el programa SPSS versión 13.0 para Windows (SPSS Inc., Tokio, Japón).
Resultados
AQP3 y expresión de proteínas en la tiroides AQP4 Tejidos
Los resultados inmunohistoquímicos de AQP3 y AQP4 utilizando tejidos de la tiroides humanos se presentan en la Tabla 2. en los exámenes inmunohistoquímicos, se encontró proteína de AQP3 en la membrana citoplasmática de las células normales de tiroides C que fueron positivos para la calcitonina, mientras que era completamente negativa en las células foliculares (Fig. 1A y SEGUNDO). Tampoco se pudieron immunopositivity demostrada de AQP3 en las células foliculares hiperplásicas de tiroides enfermedad de Graves y bocio multinodular.
Por el contrario, AQP4 fue positiva en la membrana citoplasmática de las células foliculares tiroideas normales y negativo en las células C (fig. 1C). AQP4 tendía a ser positivo en las células foliculares altos de folículos pequeños y negativos en las células foliculares planas de folículos grandes (Fig. 1D). células foliculares hiperplásicas en la mayor parte de tiroides enfermedad de Graves y bocio multinodular fueron positivos para AQP4 en sus membranas citoplasmáticas; la frecuencia positiva fue del 92% en las tiroides enfermedad de Graves (Fig. 1E) y 97% en el bocio multinodular (Fig. 1F).
En los tejidos neoplásicos tiroides, la inmunorreactividad de AQP3 se demostró con frecuencia en la membrana citoplasmática de células de carcinoma medular (Fig. 2D). La frecuencia global positiva de AQP3 en los carcinomas medulares fue del 91% (20/22). Entre 20 carcinomas medulares positivos para AQP3, los patrones de distribución de células AQP3-positivas variaron: 55% (11/20) en difusa, 40% (8/20) en el compuesto intermedio, y 5% (1/20) en los carcinomas medulares focales . AQP3 no fue identificado en los tumores derivados de células foliculares (Fig. 2A-C).
Por el contrario, hemos observado con frecuencia AQP4 en las células de adenomas foliculares (100% de los casos), carcinomas foliculares (90% de los casos), y carcinomas papilares (85% de los casos) (Fig. 3A-C). La mayor parte de los tejidos neoplásicos, AQP4-positivas exhibieron intermedio o distribución de células positivas difusa. No se observó AQP4 en las células de carcinomas indiferenciados o carcinomas medulares (Fig. 3D).
AQP3 y Expresión AQP4 mRNA en tejidos tiroideos
Como se muestra en la Figura 4, los análisis de RT-PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos revelaron que todas las muestras normales y de hiperplasia de la tiroides examinadas expresaron una banda sugestivo de AQP4, mientras que AQP3 no fue identificado.
en los tejidos tiroideos neoplásicas, hemos identificado la expresión de ARNm AQP3 sólo en los carcinomas medulares. Hemos identificado la expresión de ARNm AQP4 en los adenomas foliculares y carcinomas papilares, pero no en los carcinomas indiferenciados o carcinomas medulares. Estos resultados apoyan los resultados de nuestro análisis inmunohistoquímico.
AQP3 y Expresión AQP4 de tiroides Carcinoma de Líneas Celulares
Hemos examinado mRNA perfiles de expresión de AQP3 y AQP4 en líneas celulares de carcinoma de tiroides y ocho mediante RT-PCR (Fig. 5A). Se observó específicamente la expresión de mRNA AQP3 en la línea celular TT que se estableció a partir de carcinoma medular humano. Por el contrario, hemos visto la expresión de mRNA en AQP4 KTC-1, TPC-1, WRO, UA-1, UA-2, y células 8505C líneas, pero no en las líneas de células TT y 8305C.
En el Western Blot análisis, se detectó la proteína AQP3 sólo en la línea celular TT pero no hay otras líneas celulares, mientras que, la proteína AQP4 fue identificado en las líneas celulares de KTC-1, TPC-1, UA-1, UA-2, y 8505C no, pero en TT. Tampoco se observó AQP3 ni AQP4 en las líneas celulares WRO o 8305C (Fig. 5B).
suero bovino fetal (FBS) y de calcio regula la expresión de mRNA AQP3 en células TT
Después de haber decidido que AQP3 se detecta específicamente en las células TT, se analizó el efecto estimulante de concentraciones variables del medio de FBS en los niveles de AQP3 de ARNm utilizando una serie de concentraciones de FBS (0%, 1%, 5% y 10%) de más de 24 horas (Fig. 6A) . los niveles de mRNA AQP3 fueron significativamente superiores en un 5% y un 10% de SFB tratamientos en comparación con el no tratamiento de FBS (
P Hotel & lt; 0,01).
A continuación, se analizó el efecto del tiempo de estimulación (0, 4, 8, 12, 16, 24, y 36 horas) en las células TT cultivadas con 5% de FBS. los niveles de mRNA AQP3 a los 12, 16 y 24 horas se incrementaron significativamente (
P Hotel & lt; 0,05 frente al control de la hora 0), alcanzando un pico a las 24 horas (
P Hotel & lt; 0,01) .
Como se muestra en la Figura 6B, las células se trataron con diferentes dosis de calcio (0, 0,1, 1, 10 y 100 uM). expresión AQP3 mRNA fue significativamente hasta reguladas por la administración de calcio de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control (
P
& lt; 0,05). Hemos observado la expresión de ARNm AQP3 más alto en 10 M de calcio, lo que representa un aumento de 6 veces en comparación con el control (0 uM de calcio).
Se examinó el efecto de los tiempos de estimulación (0, 4, 8, 12 , 16, y 24 horas) con un tratamiento con calcio 10 uM en las células TT y encontraron un incremento significativo en la expresión de mRNA AQP3 con el tiempo; que alcanzó un pico a las 12 horas (
P Hotel & lt; 0,01).
Discusión
AQP3 es un transportador de membrana de agua y glicerol expresado en las membranas plasmáticas de las células para mantener un equilibrio del metabolismo de fluido. AQP3 expresión ha sido reportado en varios órganos de ratas y ratones [11], [12]. En los tejidos normales /células de los seres humanos, Mobasheri et al. [42] reportaron una fuerte expresión de AQP3 en las membranas basolateral de la nefrona distal (colector medular conductos), colon distal, epitelio de la vía aérea superior, epitelio transicional de la vejiga urinaria, la tráquea, los bronquios y el epitelio nasofaríngeo y células epiteliales escamosas estratificadas de la esófago y ano. Nuestro estudio inmunohistoquímico reciente utilizando una gran serie de tejidos humanos reveló células /tejidos adicionales que producen AQP3 tales como células de la pituitaria, células epiteliales del timo, células de la glándula fúndica del estómago, células de los islotes del páncreas, las células de espermatogénesis del testículo, células de las glándulas sudoríparas, células de las glándulas sebáceas, y las células de las glándulas apocrinas de la piel [39].
AQP4 es una de las isoformas selectivo de agua en la familia AQP. Se informa que esta proteína de canal de agua que se expresa principalmente en el tejido cerebral incluyendo las limitans glia, forro ependimarias, cerebelo, hipocampo gyrus denate, y en los núcleos supraóptico y paraventricular del hipotálamo [28]. Además, la expresión baja pero significativa AQP4 también se ha encontrado en el neocórtex, las áreas del hipocampo CA1-CA3, el núcleo de los terminales de la estría, y el núcleo habenular medial [31] - [33].
Para nuestro conocimiento , expresión AQPs 'en la tiroides no se ha informado hasta este punto. En este estudio mediante inmunohistoquímica, hemos demostrado la expresión de AQP3 y AQP4 en los tejidos normales de la tiroides humanos. Curiosamente, AQP3 se expresó estrictamente en las células C, demostradas por doble tinción para AQP3 y calcitonina. En contraste, la expresión AQP4 se demostró en las células foliculares, pero no en las células C. En general, se sabe que las células las células C, produciendo de calcitonina y foliculares producen T3 y T4 se derivan de diferentes orígenes; células C se originan a partir de células asociadas a la cuarta o quinta bolsa faríngea, que contribuye a que el cuerpo ultimobranquial y las células foliculares se derivan principalmente de la endodermo en la base de la lengua. Por lo tanto, es concebible que la expresión diferencial de AQP3 en células C y las células foliculares podría estar asociada con su origen y /o la función del desarrollo.
En los tejidos de la tiroides hiperplásicas tales como tiroides con enfermedad de Graves o bocio multinodular, nuestros análisis inmunohistoquímicos revelaron la proteína AQP4 en la mayoría de los tejidos: una frecuencia positiva de 92% en tiroides enfermedad de Graves y 97% en bocio multinodular. Pero no hemos podido demostrar la proteína y el ARNm AQP3 en los tejidos hiperplásicos. Estos hallazgos sugieren que AQP4 puede jugar un papel importante en la homeostasis de fluidos en las células foliculares hiperplásicas, así como células foliculares normales.
Nuestro trabajo reciente describe inmunoreactividad difusa de AQP3 en una amplia variedad de tejidos humanos, tales como carcinoma de células escamosas de la piel, el esófago y el cuello uterino endometrial, carcinoma urotelial, carcinoma salival, etc. carcinomas medular de tiroides también se han reportado como positivo para AQP3 [39]. En este estudio, hemos demostrado que AQP3 fue positivo en la mayoría de carcinomas medulares de tiroides y negativo en los tumores derivados de células foliculares mediante inmunohistoquímica en conjunción con RT-PCR. Además, encontramos la expresión AQP3 en la línea celular TT que se origina en el carcinoma medular humana. Por lo tanto, sugerimos que AQP3 puede estar asociada con la naturaleza biológica de las células de carcinoma medular de tiroides humanos.
Sobre la base de esta expresión específica de AQP3 en las células TT, hemos demostrado que los niveles de mRNA AQP3 aumentaron significativamente con el tratamiento de FBS. FBS es un componente común de los medios de cultivo de células animales; varios tipos de células tumorales se estimulan usando FBS [43], [44]. Esto nos sugiere que ciertos componentes en FBS están involucrados en la regulación de la expresión AQP3, pero el mecanismo molecular biológica exacta aún deben aclararse. También se encontró que AQP3 mRNA fue inducida por calcio de una manera dependiente de la dosis en las células TT. La homeostasis del calcio in vivo está regulada tanto por la calcitonina y hormona paratiroidea [45]. Nuestros datos sugieren que AQP3 podría estar involucrado en el metabolismo del calcio en células de carcinoma medular de tiroides
expresión AQP4 ha informado de una serie de tumores cerebrales tales como glioma, glioblastoma y astrocitoma [31] - [33].. Nuestro estudio es el primer informe que muestra que AQP4 expresa en los tumores de la tiroides; tumores derivados de células foliculares, excepto carcinoma indiferenciado, con frecuencia producen AQP4. La frecuencia positiva de AQP4 era 100% en adenomas foliculares, 90% en los carcinomas foliculares, y 85% en los carcinomas papilares. Resultados Nuestros RT-PCR para ARNm AQP4 totalmente compatible con estos análisis de inmunohistoquímica; identificamos AQP4 mRNA en líneas celulares de carcinoma de células derivadas foliculares. Por lo tanto, se sugiere que el metabolismo del agua mecanismo de AQP4 se mantiene bien durante la transformación neoplásica. En cuanto al papel de AQPs en tumores humanos, varios investigadores han informado de que AQPs pueden relacionarse con la migración, invasión y proliferación de células tumorales [46] - [49]. Desde este punto de vista, es concebible que la expresión de AQP3 y /o AQP4 puede contribuir el comportamiento biológico de los tumores de tiroides.
También debería considerar la posibilidad de otros AQPs en el carcinoma indiferenciado de tiroides en los que ni AQP3 ni AQP4 se expresó. Estos resultados nos dan pistas de que otros subtipos AQP pueden estar involucrados en el movimiento del agua en los carcinomas tiroideos diferenciados, y se alienta un mayor estudio.
En conclusión, nuestros resultados sugieren que las expresiones diferenciales de AQP3 y AQP4 siempre son representativas de lo biológico las células de la naturaleza y /o función de lo normal, hiperplásico, y de tiroides neoplásica y, además, tienen algún valor para el diagnóstico de tumores de tiroides.
Reconocimientos
nos gustaría reconocer a la siguiente para que nos proporciona líneas celulares de cáncer de tiroides: KTC-1, TPC-1, el Dr. S Yamashita (Nagasaki University Graduate School de Ciencias biomédicas, Nagasaki, Japón); WRO, el Dr. J Fagin, (Universidad de Cinicinnati, Cincinnati, OH) y establecido por el Dr. G. Juillard (Universidad de California, Los Ángeles, CA); UA-1, UA-2, Dr. T Kondo (Universidad de Yamanashi, Yamanashi, Japón).