Extracto
Antecedentes
Humano cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de los pacientes exhiben una alta propensión a desarrollar metástasis del esqueleto, lo que resulta en la actividad osteolítica excesiva. El //sistema RANKL RANGO OPG, que desempeña un papel fundamental en la remodelación ósea mediante la regulación de la formación y la actividad de los osteoclastos, es de interés potencial en este contexto.
Materiales y Métodos
La transcriptasa inversa en cadena de polimerasa de reacción, el Western Blot, y el análisis inmunohistoquímico se utilizaron para examinar la expresión de RANKL, RANK, y OPG en líneas celulares de NSCLC humanos con diferentes potenciales metastásicos, así como en 52 muestras de NSCLC primarios y 75 de NSCLC muestras de metástasis ósea. En pacientes con CPNM primarios, la expresión de estas proteínas se correlacionó con parámetros clínico. RANKL recombinante humana y transfectadas RANKL ADNc se añadieron a la línea celular PAA para evaluar la acción promotora de RANKL durante el proceso de metástasis
e in vitro
in vivo
.
resultados
Hasta reguladas RANKL, RANK, y la expresión de OPG y el aumento de RANKL: OPG relación se detectaron en líneas celulares de cáncer y en los tejidos tumorales con metástasis ósea, y se correlacionaron con mayor potencial metastásico. El potencial metastásico de NSCLC
in vitro
y
in vivo
, incluyendo la migración y capacidad de invasión, fue significativamente mejorada por RANKL humana recombinante y la transfección de RANKL cDNA, y se vio afectado después se añadió OPG . El aumento de la expresión de RANKL y OPG correlaciona con el estadio tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, y metástasis a distancia.
Conclusiones
La expresión diferencial de RANKL, RANK, y OPG se asocia con el potencial metastásico de humanos NSCLC de esqueleto, que plantea la posibilidad de que el sistema RANKL /RANK /OPG podría ser una diana terapéutica para el tratamiento de pacientes con CPNM metastásico
Visto:. Peng X, Guo W, Ren T, Lou Z, X Lu , Zhang S, et al. (2013) Expresión diferencial del RANKL /RANK /OPG se asocia con metástasis en los huesos en humanos de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (3): e58361. doi: 10.1371 /journal.pone.0058361
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2012; Aceptado: 6 Febrero 2013; Publicado: 13 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Peng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30973020 y 81001193). Http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) es la neoplasia maligna más comúnmente diagnosticado y la principal causa de muertes relacionadas con cáncer en poblaciones asiáticas y occidentales, con más de 150.000 personas que se espera que mueren anualmente por esta enfermedad [1] . El esqueleto representa el sitio más común de metástasis tumoral. Aproximadamente el 9% a 30% de los pacientes con cáncer de pulmón desarrollar metástasis en los huesos, que conducen a una morbilidad significativa de la compresión de la médula espinal, fracturas patológicas y dolor intratable [2], [3]. A pesar de la alta tasa de metástasis, los mecanismos moleculares subyacentes que regulan la capacidad de las células de cáncer de pulmón a proliferar e invadir siguen siendo poco conocidos y exitosos modalidades de tratamiento sigue siendo difícil.
Para desarrollar tratamientos eficaces para la metástasis ósea, es necesario aclarar los mecanismos moleculares que subyacen a los cambios inducidos por el tumor en el microambiente óseo. Normalmente, hay un equilibrio estrechamente coordinado en el que la resorción ósea mediada por los osteoclastos y la formación ósea osteoblástica mediada contrarrestan y contribuyen a la remodelación constante de la estructura ósea [4]. Cuando el cáncer de pulmón hace metástasis a los huesos, la alteración de este equilibrio puede conducir a un aumento de la resorción ósea, lo que resulta en la actividad osteolítica excesiva y la consiguiente enfermedad esquelética [5].
Los informes recientes han sacado a la luz un nuevo sistema receptor-ligando que pertenece con el factor de necrosis tumoral (TNF) superfamilia: el receptor activador del factor nuclear (NF) -KB (RANK), su ligando (RANKL), y el osteoprotegrin proteína (OPG) [6], [7]. RANKL, una proteína unida a la membrana expresado principalmente en la superficie de los osteoblastos y las células estromales de médula ósea, se une a RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos, estimulando su diferenciación en osteoclastos maduros [8] - [10]. OPG, un receptor señuelo de RANKL que también se produce por células de osteoblastos /estromales, puede prevenir la destrucción ósea mediante el bloqueo de la unión entre RANKL y RANK, inhibiendo de este modo la diferenciación de osteoclastos y la activación [6], [11]. La desregulación del sistema de RANKL /RANK /OPG se ha detectado en varios tumores, como el cáncer de mama [12], [13], cáncer de próstata [14], los tumores malignos de hueso (por ejemplo, mieloma múltiple, tumores de células gigantes de hueso, y condroblastoma) [15] - [17], carcinoma de células escamosas [18], y la enfermedad de Hodgkin [19]. Estudios anteriores han demostrado que RANKL es necesario para el desarrollo de lesiones osteolíticas en el hueso [20]. Además, mediante el bloqueo de la interacción RANKL-RANK, lesiones osteolíticas se han inhibido con éxito en varios tipos de cáncer, incluyendo el mieloma múltiple y el cáncer de próstata [21] - [23].
En el cáncer de pulmón, el RANKL /sistema RANK /OPG se ha detectado tanto en la presencia y ausencia de metástasis óseas. los niveles séricos elevados de RANKL soluble y OPG se han reportado en pacientes con cáncer de pulmón con metástasis óseas [24]. Recientemente, se informó de que RANKL también desencadena la migración de células tumorales humanas que expresan RANK [25]. Además, RANK-Fc, una proteína quimérica que inhibe la interacción RANK-RANKL, se ha demostrado que resistir la osteoclastogénesis [26]. En consecuencia, la hipótesis de que la expresión de RANKL /RANK /OPG puede correlacionar con la progresión del NSCLC. En este estudio, la expresión de RANKL, RANK, y OPG se examinaron en varias líneas celulares de cáncer de pulmón humano con diferentes potenciales metastásicos. Recombinante RANKL humano y transfectadas RANKL ADNc se añadieron a una línea celular de NSCLC para evaluar la acción promotora de RANKL en el proceso de metástasis. El análisis inmunohistoquímico se llevó a cabo para evaluar la expresión de RANKL, RANK, y OPG en los tumores de NSCLC primarios, así como en el hueso tejidos metastásicos de NSCLC. La expresión de estas proteínas se correlacionó con parámetros clínico de NSCLC primario.
Materiales y Métodos
Los pacientes
El presente estudio investigó las muestras de biopsias quirúrgicas de 127 pacientes con CPNM, incluyendo 52 casos de CPCNP recién diagnosticado y 75 casos de metástasis ósea del NSCLC. Todos los pacientes fueron tratados en el Hospital Popular de la Universidad de Pekín y no recibieron ninguna terapia en el momento de la recogida de muestras. Los datos clínicos detallados con respecto a estos pacientes se presentan en la Tabla 1. Los pacientes con CPNM El se organizaron de acuerdo a la clasificación TNM de la Sociedad Torácica Americana, y se clasificaron histológicamente como sea así, moderada o pobremente diferenciados. El estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de Pekín Hospital Popular de la Universidad. Los comités de ética aprobados este procedimiento. El consentimiento informado para el uso experimental de muestras quirúrgicas se obtuvo de todos los pacientes en forma escrita de acuerdo con las normas éticas del hospital.
líneas celulares de cáncer de pulmón humano
Cultivo de células y reactivos PG- BE1, PG-LH7, y PAA se adquirieron en el Instituto de Patología de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud (Pekín, china). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Gibco). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. RANKL recombinante humana y la proteína OPG fueron adquiridos de Prospec Biotechnology Inc. (Prospec, Ness Ziona, Israel, Cat No: CYT-334 y CYT-633). Los anticuerpos generados contra RANK, RANKL y OPG se adquirieron de Abcam Inc. (Abcam, MA, EE.UU., Cat No: ab12008, ab9957 y ab73400). β-actina de anticuerpos fue adquirido de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU., Cat No: sc-130065).
Animales
Seis semanas de edad con inmunodeficiencia combinada severa macho ( ratones SCID) que pesaban 20-25 g se utilizaron para este estudio. El estudio en animales fue aprobado por las juntas de revisión institucional de Pekín Hospital Popular de la Universidad. Los animales se obtuvieron del Centro de Investigación modelo animal de la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, que se encuentra en condiciones libres de patógenos de acuerdo con las directrices del NIH utilizando un protocolo de animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo en la universidad.
RT-PCR y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído de PG-BE1, PG-LH7, y las células PAA por un método de una sola etapa usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, la Jolla, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el ARN fue posteriormente a transcripción inversa en ADN complementario. Los cebadores específicos usados para la amplificación de DNA se resumen en la Tabla 2. El producto de PCR amplificado se fraccionó a través de electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, se fotografiaron bajo luz ultravioleta, y se analizaron por densitometría. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un sistema de detección de secuencias ABI Prism7300 (Applied Biosystems, Beverly, MA, EE.UU.) utilizando un kit A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El perfil térmico fue de 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 58 ° C durante 30 s. La expresión de mRNA RANKL /RANK /OPG se analizó usando el 2
- Método (ΔΔCt) (línea celular PAA como calibrador) basado en los valores de Ct para ambos genes diana y de referencia. La cantidad de cada transcripción se normalizó contra una cantidad conocida de deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y β-actina. Cada experimento se realizó por triplicado. Resultados del análisis de PCR en tiempo real se dan como media ± el error estándar de la media (SEM). parcelas disociación térmica se examinaron para determinar las curvas de fusión bifásica, indicativo de si dímeros de cebadores u otros productos no específicos podrían estar contribuyendo a la señal de amplificación.
Western blot
Western blot se realizado como se describe anteriormente [27]. Brevemente, las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 10% y se transfirieron a una membrana de PVDF. inmunotransferencias individuales se realizaron con anticuerpos primarios dirigidos contra RANK (1:500), RANKL (1:1000), OPG (1:500), y β-actina (1:1000). Las membranas se bloquearon en TBS-T que contiene 5% de leche en polvo sin grasa, y después se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios de rábano picante y conjugado con peroxidasa (Santa Cruz, CA, EE.UU.) durante 1 h. Se utilizó el reactivo ECL (GE Healthcare, NJ, EE.UU.) para la detección de proteínas. Cada experimento se realizó por triplicado.
Inmunohistoquímica
secciones de parafina se hicieron reaccionar con anticuerpos policlonales de conejo anti-RANKL (1:500 dilución), anticuerpos anti-RANK policlonales de ratón (dilución 1:200) o anticuerpos anti-conejo de OPG (1:100 de dilución), como se describe anteriormente [27]. Secciones teñidas con el conejo no inmune o suero de ratón (dilución 1:200) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en lugar de anticuerpo primario sirven como controles negativos. Para evaluar RANKL, RANK, y la tinción de OPG, las células cancerosas exhiben tinción positiva en las membranas celulares y en el citoplasma se contaron al menos 10 campos representativos (400 aumentos) y se calculó el porcentaje medio de células cancerosas positivas. Casos en los que la proporción de las células cancerosas positivas fue ≥50% se definieron como positivos, y los que contienen & lt; se definieron las células cancerosas positivas 50% como negativo. La inmunotinción fue evaluada por dos patólogos independientes cegados a las características clínicas y los resultados.
análisis de imagen asistida por ordenador de la inmunohistoquímica
La inmunotinción de todos los anticuerpos se analizó cuantitativamente mediante el uso de un sistema de análisis de imagen asistido por ordenador . En pocas palabras, las imágenes de las secciones teñidas fueron capturadas con una cámara digital Leica y se procesan utilizando Image Pro Plus análisis de software (versión 6.0; medios de comunicación cibernética, Rockville, MD, EE.UU.). El umbral se fijó por la determinación de la tinción positiva de las secciones de control y se utilizó para analizar automáticamente todas las imágenes grabadas de todas las muestras que se tiñeron en la misma sesión en condiciones idénticas. El área de regiones inmuno fue calculado automáticamente por el software en cada campo microscópico. número de píxeles del producto de inmunorreacción se calculan automáticamente y se les dio como la densidad total de la inmunotinción integrado sobre un área determinada de las secciones. Esto refleja la cantidad relativa de las proteínas detectadas por los anticuerpos en las secciones del tumor. La proporción de RANKL /OPG se calcula a partir de las densidades de inmunotinción integrados de RANKL y OPG en cada grupo
RANKL cDNA transfección
RANKL humano ADNc de longitud completa.: Se insertó (RefSeq NM_033012.2) en el vector eucariota pCMV6-XL5 (adquirido de OriGene Technologies, Inc. Cat No: SC305532). células PAA fueron transfectadas con el plásmido recombinante o el vector solo (transfectantes simulacros) usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) como se describe por el fabricante, y se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% de FBS y 500 g /ml G418 (AMRESCO, OH, EE.UU.). RANKL transfectantes estables (con nombre PAA-RANKL) y transfectantes falsos (PAA llamado de forma simulada) se establecieron y mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB y 250 mg /ml de G418.
in vitro
ensayos de migración e invasión
migración y la invasión ensayos se realizaron mediante la siembra de 3 × 10
5 células en 200 l RPMI1640 en la parte superior de insertos de cultivo celular Transwell que contienen una membrana de tereftalato de polietileno pre-recubiertas con Matrigel o que carecen de ( insertos de 24 pocillos, 8,0 micras de tamaño de poro; Coster, Corning Inc., Corning, NY, USA). La cámara inferior se llenó con 0,8 ml RPMI1640, con o sin RANKL recombinante humano agregado y con o sin OPG recombinante humano. Después de la incubación durante 24 h, las células no migran se rasparon y las membranas se fijaron y se tiñeron utilizando el kit de tinción Diff-Quik (Sysmex Co., Hyogo, Japón). Las células que habían migrado a través de las membranas se cuantificaron por determinación del número de células en tres campos visuales elegidos al azar en 200 × magnificación.
Tibial implantación de células de cáncer de pulmón
Un modelo de inyección intratibial murino de se utilizó la metástasis ósea para crear lesiones osteolíticas en este estudio [28] - [30]. Las células de cáncer de pulmón (5 x 10
5 células) se suspendieron en 10μl de PBS 1% y se mezcla con 10μl de matrigel (BD biociencias , San Jose, CA) para cada inyección tibial. 20μl de la mezcla de células y matrigel se inyectó en la tibia proximal de ratones SCID de 6 semanas de edad tal como se publicó anteriormente [29], [31]. Brevemente, los ratones se anestesiaron usando isoflurano (1,5-2%) y oxígeno. La piel que recubre se preparó de manera estéril con 70% de etanol y betadine. Se hace una incisión longitudinal 3-mm se hizo el ligamento rotuliano con una hoja de bisturí número 12, y luego una incisión longitudinal de 2 mm se hizo a lo largo del borde medial de la ligamento rotuliano a la meseta tibial. Una aguja de calibre 26 1/2 se introdujo a través de la meseta tibial proximal y 20μl de células de cáncer de pulmón y la mezcla de Matrigel se inyectaron en la cavidad medular. La herida se cierra con una sola 5-0 Vicryl (Ethicon Inc.).
grupos de estudio Animal
En este estudio, los ratones SCID macho cincuenta sometió a la implantación de la tibia con células de cáncer de pulmón y eran igualmente divididos en cinco grupos de estudio. I (PAA), los animales del grupo recibieron la inyección de las células intratibial PAA solo. Grupo II (PAA-Mock) tibias recibieron células PC-3 que se transfectaron con un vector vacío de control para la transfección. Grupo III (PAA-RANKL) los animales recibieron células PAA que se transfectaron con un vector de expresión de RANKL sobre cDNA. Tibias en el Grupo IV (PAA-RANKL + OPG) fueron implantados con células y animales PAA-RANKL fueron tratados posteriormente con OPG. OPG se utilizó en dosis de 10 mg /kg disueltos en un 100 pl de solución salina tampón fosfato (PBS) y se inyectó por vía subcutánea tres veces a la semana a partir del día de la implantación tibial de las células cancerosas y se continuó durante un total de 8 semanas. Grupo V (PAA-RANKL + PBS) tibias fueron implantados con células PAA-RANKL y los ratones fueron tratados con 100 pl de PBS, que también se inyecta por vía subcutánea tres veces a la semana durante 8 semanas.
Preparación de radiotrazadores
el fluoruro iónico se produce utilizando O-18 del agua y el protón bombardeo usando un ciclotrón RDS (CTI). ion
18F-fluoruro se produjo a actividades específicas de aproximadamente 1000 Ci /mmol y
18 F-FDG se sintetizó en actividades específicas de aproximadamente 5.000 mCi /mmol tal como se publicó anteriormente [30].
Micro PET /CT imágenes de protocolo
Animales en los subgrupos de imágenes se realizó una tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografías computarizadas micro a las 8 semanas en la institución del autor de acuerdo con un protocolo previamente publicado [30]. Brevemente, los ratones fueron anestesiados con isoflurano (1,5 a 2%) y oxígeno en las cámaras de inducción. Los ratones fueron inyectados directamente con aproximadamente 250 Ci de
18 F-FDG vía vena de la cola usando una aguja de calibre 27 roscado a un catéter de polietileno. Los animales se les administró anestesia de mantenimiento con 2% de isoflurano en el sistema de lecho de aislamiento durante el período de captación del radiotrazador. Vejigas se expresaron de forma manual 5 min antes de la imagen y los animales fueron colocados en un sistema de lecho multimodalidad portátil que consiste en una cámara de lucita con los puertos de anestesia y se criaron plataforma. exploraciones de todo el cuerpo se realizaron con un tiempo de adquisición de 10 minutos utilizando un sistema MicroPET® FOCUS 220 (CTI Concorde Microsystems LLC). Inmediatamente después, se utilizó una mejorada sin contraste estudio micro CT usando Microcat® II sistema de imagen (IMTEK Inc.) para escanear animales con un tiempo de adquisición de 10 minutos. PET escanear imágenes fueron reconstruidas usando proyección filtro de espalda. MicroPET y Microcat® imágenes fueron luego se fusionaron para el análisis para su uso con el software AMIDE®.
Análisis cuantitativo de PET micro /CT datos
PET y datos de TC fueron analizados y cuantificados por AMIDE® ( Una imagen médica Data Examiner) versión 0.7.154 según lo publicado anteriormente [30].
captación de 18F-FDG se correlaciona con el metabolismo de la glucosa celular y se utilizó en formación de imágenes PET micro para la detección y el seguimiento longitudinal de la carga tumoral. En pocas palabras, las regiones de interés (ROI) se extrajeron utilizando una herramienta ROI sobre mesetas tibiales bilaterales que estaban en tres dimensiones reconstruida para confinar todas las captaciones de señales perceptibles. El uso de cajas de retorno de la inversión del mismo tamaño, las herramientas de análisis de datos se utilizaron para calcular el máximo y la intensidad de la señal en ambas tibias implantado tumorales y las tibias no inyectadas contralaterales significar. La tibia contralateral se usó como un control interno para cada animal. Para cuantificar el tamaño del tumor, ROI isocontorno 3D fue dibujado en la tibia tumor usando la intensidad máxima de señal de FDG en la tibia contralateral como el umbral, y (3 mm
) a continuación, se calculó el volumen de la señal de FDG en las tibias implantado tumorales. Micro CT imágenes fueron utilizados para identificar y cuantificar las lesiones osteolíticas.
mediciones de la carga tumoral
Los animales se sacrificaron después de micro PET /TC a 8 semanas, y sus tumores en las extremidades posteriores fueron cosechadas por suave -tissue medición. La carga tumoral de tejido blando se calculó utilizando la fórmula tal como se publicó anteriormente [29], [32].
El análisis estadístico
Los datos del análisis de imágenes de las secciones se expresan como media ± el error estándar de la media (SEM) de cada grupo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
t-test
y el análisis de la varianza (ANOVA), con
p-valores
& lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado de Pearson para determinar la correlación entre la expresión de OPG RANGO RANKL //y los parámetros clínico-patológicos. Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.).
Resultados
expresión de RANKL, RANK, y OPG en líneas celulares de cáncer de pulmón humano
En primer lugar, se determinó el potencial metastásico de PG-BE1, PG-LH7, y las células PAA. células PG-BE1 penetraron más fuerte en el filtro de las otras líneas celulares, y el número de células migradas PAA fue mínima (
p
& lt; 0,05; Figura 1A, B). Además, el nivel de la metaloproteinasa-9 (MMP9) mRNA matriz observado a través del análisis RT-PCR fue similar al nivel observado con Transwell inserta (
p
& lt; 0,05; Figura 1C). Todo lo anterior indica que estas tres líneas celulares tenían diferentes potenciales metastásicos. A continuación, la expresión de RANKL, RANK, y OPG se evaluó en las tres líneas celulares a nivel de la transcripción y de proteínas utilizando cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot. Las tres líneas celulares de cáncer exhiben diferentes niveles de RANKL, RANK, y la expresión de OPG. De las tres líneas de células, las células PG-BE1 (que tenía el mayor potencial metastásico) demostraron la expresión más fuerte de RANKL, RANK, y OPG (
p Hotel & lt; 0,05 frente a otras líneas celulares; las figuras 2 y 3 ). células PAA, que eran los menos invasiva, exhibidos solamente RANKL mínima, RANK, y la tinción de OPG. La inmunocitoquímica confirmó la expresión de RANKL, RANK y OPG observada con cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot. Además, una RANKL significativamente mayor: se observó relación de densidad OPG en las células con mayor potencial metastásico (
p
& lt; 0,05; figuras 2D y 3D)
El potencial metastásico de tres NSCLC. líneas de células se determinó en primer lugar usando un ensayo de migración in vitro de (a, B). expresión diferencial MMP9 en tres líneas celulares de NSCLC se analizó adicionalmente por RT-PCR (C). Los resultados se expresan como la media ± el error estándar de la media (SEM) de tres experimentos separados. **
p Hotel & lt; 0,05 para PG-BE1 frente PG-LH7. *
p
. & Lt; 0,05 para PG-LH7 frente PAA
RT-PCR se realizó para detectar RANKL, RANK, y los niveles de ARNm de OPG en PG-BE1, PG-LH7 y células PAA (A). Cuantitativa en tiempo real PCR reveló la expresión relativa de RANKL, RANK, y el ARNm de OPG en tres líneas celulares de cáncer utilizando el
2 - método (ΔΔCt) (línea celular PAA como calibrador). GAPDH y β-actina se utilizaron como la referencia interna (B, C). Siguiente, la relación de RANKL: OPG expresión de ARNm en las tres líneas celulares de NSCLC se calculó basándose en los valores de Ct para tanto objetivo y referencia gen (D). Las barras representan la media ± el error estándar de la media (SEM) de tres experimentos diferentes. **
p Hotel & lt; 0,05 para PG-BE1 frente PG-LH7. *
p
. & Lt; 0,05 para PG-LH7 frente PAA
Se realizó un análisis de Western blot para detectar RANKL, RANK, y los niveles de proteína OPG en PG-BE1, PG-LH7 y células PAA. Banda intensidades se normalizaron a ß-actina (A-C). Siguiente, la relación de RANKL: expresión de la proteína OPG se calculó en tres líneas celulares de NSCLC (D). Las barras representan la media ± el error estándar de la media (SEM) de tres experimentos diferentes. **
p Hotel & lt; 0,05 para PG-BE1 frente PG-LH7. *
p Hotel & lt; 0,05 para PG-LH7 frente PAA
recombinante RANKL estimula la migración y la invasión PAA
in vitro
Con el. bajo potencial metastásico y la expresión de RANKL menos, el bajo número de células migradas PAA se incrementó en tres veces en presencia de RANKL humano recombinante (
p Hotel & lt; 0,05). Este efecto fue bloqueado por la adición de OPG humana recombinante de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B). invasión estimulada también aumentó al doble cuando se añadió RANKL recombinante a las células PAA. Del mismo modo, la OPG produjo una reducción dependiente de la dosis en la invasión de células PAA. Estos resultados indicaron que el sistema de RANKL /RANK /OPG era funcional en células de cáncer de pulmón.
análisis de transferencia Western demostró mayor expresión de la proteína RANKL en células PAA-RANKL en comparación con células de PAA y PAA-Mock (A). RANKL recombinante estimuló la migración celular de PAA, y el efecto de la administración RANKL se bloqueó mediante la adición de OPG al medio de cultivo de una manera dependiente de la dosis. *
p
& lt; 0,05 para 300 ng /ml RANKL recombinante versus el control y muestras de 200 ng /ml de OPG tratados (B). Aumento de la migración de las células PAA-RANKL in vitro se demostró, y podría ser bloqueada por la adición de OPG al medio de cultivo. *
p Hotel & lt; 0,05 para PAA-RANKL en comparación con PAA, PAA-Mock y 200 ng /ml de las muestras tratadas con OPG (C). Los resultados se presentan como la media ± el error estándar de la media (SEM) de los ensayos por triplicado.
RANKL cDNA transfección estimula la migración y la invasión PAA
in vitro
y
in vivo
para aclarar aún más las funciones biológicas del sistema RANKL /RANK /OPG en el CPNM, se utilizó la técnica de transfección para regular específicamente la expresión génica en células de RANKL PAA. células PAA fueron transfectadas con ADN de plásmido que codifica el gen RANKL de longitud completa. Después de la selección de G418 durante varias semanas, se estableció la línea celular transfectante estable PAA-RANKL. RANKL expresión fue significativamente hasta reguladas en esta línea celular en comparación con la línea PAA original y el transfectante maqueta con pCMV6-XL5 vector (PAA-Mock) (
p Hotel & lt; 0,05; Figura 4A).
a continuación, se investigó el efecto de la sobre regulación de la expresión de RANKL en el comportamiento metastásico de células tumorales por transwell ensayo. El número de células que migraron era más de dos veces mayor en las células PAA-RANKL que en las células PAA y PAA-Mock; el número de células invadidas también fue dos veces mayor. Ambos efectos fueron bloqueados por la adición de OPG al medio de cultivo en una forma dependiente de la dosis (Figura 4C)
Para investigar más a fondo el papel de RANKL en NSCLC in vivo., Establecimos modelo de xenoinjerto en ratones mediante inyección intratibial de PAA células o células PAA-RANKL en los ratones SCID. Después de 8 semanas, se observó que el volumen de tumor derivado de las células PAA-RANKL fue significativamente mayor que el derivado de células de PAA (Tabla 3). análisis Micro PET también reveló diferencia significativa del tamaño de la lesión ósea entre el Grupo (PAA) y el grupo (PAA-RANKL) (Tabla 3; Figura 5). Además, con OPG inyectada por vía subcutánea tres veces a la semana, tanto el volumen del tumor y
18 F-FDG tamaño de la lesión ósea del Grupo (PAA-RANKL + OPG) fueron significativamente más pequeños que Grupo (PAA-RANKL) y el grupo (PAA-RANKL + PBS) (Tabla 3;. Figura 5)
A-Plain radiografía; B-micro CT (Vista transversal); C-micro PET /CT superposición (vista transversal). Radiografía simple y micro PET /CT demostró un aumento en la destrucción ósea (flechas blancas) y
18 F-FDG captación en grupo (PAA-RANKL) y el grupo (PAA-RANKL + PBS) a 8 semanas después de la inyección intratibial de las células tumorales, mientras que el aumento fue inhibido en el grupo (PAA-RANKL + OPG).
en conjunto, estos datos anteriores demostraron que el sistema RANKL /RANK /OPG juega un papel crucial en las metástasis óseas de NSCLC in vivo. Estos resultados son consistentes con los estudios in vitro y los datos clínico-patológicas.
Expresión de proteínas de RANKL, RANK, y OPG en las lesiones con CPNM primarios y metástasis
A continuación, se utilizó la inmunotinción para examinar RANKL, RANK y los niveles de proteína OPG en muestras de tejido de NSCLC humanos. De 75 de NSCLC metástasis en los huesos, incluidos en el presente estudio, 60 casos (80%) y 54 casos (72%) mostraron expresión de RANKL y RANK, respectivamente, mientras que 62 casos (82,7%) mostraron expresión de OPG (Tabla 4). RANKL y RANK tinción se observaron principalmente en la membrana celular y el citoplasma de las células cancerosas. los tejidos óseos no neoplásicas mostraron débil y focal RANKL, RANK, y la tinción de OPG, y la intensidad de la tinción de las tres proteínas era más fuerte en las interfaces de células de cáncer /hueso que en el centro de los nidos de células de cáncer (Figura 6A). En comparación, en 52 cánceres primarios solamente el 53,8% y el 59,6% de los casos expuestos RANKL y RANK expresión, respectivamente, y el 63,5% de los casos demostrado la expresión de OPG (
p Hotel & lt; 0,05; Tabla 4). se observó inmunotinción significativamente más fuerte para las tres proteínas en las metástasis óseas que en las células tumorales en el sitio primario. Este hallazgo fue confirmado por el análisis cuantitativo de la densidad de la inmunotinción de las proteínas en cada grupo.
La inmunocitoquímica para RANKL, RANK, y OPG se realizó en secciones de tejido de lesiones de NSCLC primarios y metástasis de hueso procedentes de NSCLC, y el se evaluaron las intensidades de tinción (A). Siguiente, la relación de RANKL: densidad inmunotinción OPG se calculó en las lesiones de NSCLC primarios y metástasis de hueso procedentes de NSCLC (B). Los resultados se expresan como la media ± el error estándar de la media (SEM) de tres experimentos separados. *
p Hotel & lt; 0,05
RANKL
A continuación, para evaluar con mayor precisión los resultados de inmunotinción, se calculó:. OPG proporciones mediante la medición de la densidad óptica de los tejidos de NSCLC primaria y metástasis óseas NSCLC. El análisis reveló significativamente mayor RANKL:. Ratios de OPG en las metástasis óseas en comparación con los tejidos de NSCLC primario (Figura 6B) guía
Correlación de RANKL, RANK, y la expresión de OPG con parámetros clínico de cáncer de pulmón
Varios características clínico-patológicas de los pacientes con CPNM primarios se compararon sobre la base de los niveles de expresión de RANKL, RANK, y OPG. Como se muestra en la Tabla 1, RANKL, la expresión de RANK, y OPG no se asociaron con la edad, el sexo biológico, historia de tabaquismo, o histotype. Sin embargo, se establecieron correlaciones claras entre RANKL y OPG expresión y el estadio tumoral, metástasis en los ganglios linfáticos, y metástasis a distancia. Por lo tanto, se observaron mayores RANKL (78,6%, 71,4% y 88,9%) y la expresión de OPG (64,3%, 76,2% y 77,8%) en los tumores metastásicos más avanzados (
p Hotel & lt; 0,05; Tabla 1 ). Cerca de tres cuartas partes (71,4%) de la etapa T3 /4 muestras de tumor se tiñeron positivas para RANK, en comparación con el 39,5% de las muestras T1 /2 tumor en estadio (
p
& lt; 0,05; Tabla 1). No se encontró asociación significativa entre la expresión de RANK y metástasis en los ganglios linfáticos o metástasis a distancia. Finalmente, los pacientes con mal grado histológico diferenciada exhibieron expresión RANKL mucho más alto que aquellos con el grado histológico bien diferenciado (90,9% vs. 43,9%,
p
& lt; 0,05); no se observó una asociación significativa con respecto a RANK o OPG.
Discusión
Las metástasis óseas que se originan en el cáncer de pulmón y otros tumores malignos se asocian con complicaciones esqueléticas severas, y la metástasis del cáncer de pulmón de restos óseos en una fuente importante de morbilidad, con pocas opciones de tratamiento con éxito. La mayoría de las metástasis a hueso con CPNM se caracterizan típicamente como osteolítica de acuerdo a la apariencia radiográfica [20], [33], [34]. En el hueso normal, hay un equilibrio dinámico entre la resorción ósea por osteoclastos regulada y la formación ósea osteoblástica reguladas [4].