Extracto
Con el fin de aprovechar todo el potencial de la terapia génica suicida cáncer que permite la expresión precisa del gen suicida en las células cancerosas, se utilizó un promotor específico de tejido epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) (EGP-2) que dirige la expresión del herpes simple transgén quinasa virus-timidina (HSV-TK) preferentemente en EpCAM sobre expresando células cancerosas. niveles EpCAM son considerablemente más altos en el retinoblastoma (RB), un cáncer de ojo infancia con expresión limitada en las células normales. El uso de la regulación de los genes miARN, junto a la utilización del promotor específico de tejido, proporcionaría la segunda capa de control para la expresión de los transgenes sólo en las células tumorales sin afectar las células normales. Para probar esta hipótesis hemos clonado let-7b miARN objetivos en la región 3'UTR del HSV-TK gen suicida impulsado por el promotor EpCAM porque let-7 miRNAs de la familia, incluyendo let-7b, se comprobó que estaban regulados en los tumores y RB líneas celulares. Utilizamos EpCAM sobre la expresión y let-7 hacia abajo regulada RB líneas celulares Y79, WERI-Rb1 (EpCAM
+ ve /let-7b
las reguladas), EpCAM el regulado, let-7 que expresan más de lo normal de la retina Müller línea celular glial MIO-M1 (EpCAM
-ve /let-7b
hasta reguladas), y EpCAM hasta el regulado, let-7b hasta reguladas línea celular normal de la tiroides N-Thy-Ori-3.1 (EpCAM
+ ve /let-7b
hasta reguladas) en el estudio. La proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT, la apoptosis se midió mediante el sondeo escindido Caspase3, EpCAM y expresión conocimientos tradicionales se cuantificaron por Western blot. Nuestros resultados mostraron que la EGP2-promotor HSV-TK (EGP2-TK) construir con 2 o 4 copias de let-7b miARN objetivos expresados gen TK sólo en Y79, WERI-Rb-1, mientras que el gen TK no expresó en MIO -M1. En resumen, hemos desarrollado un vector de control doble de tejidos específicos, regulados por el miARN, que expresa selectivamente el gen suicida en EpCAM sobre las células que expresan
Visto:. Danda R, G Krishnan, Ganapathy K, Krishnan UM, Vikas K, Elchuri S, et al. (2013) Dirigida Expresión del gen suicida por el Promotor de tejidos específicos y el Reglamento microARN para la terapia génica del cáncer. PLoS ONE 8 (12): e83398. doi: 10.1371 /journal.pone.0083398
Editor: Rajiv R. Mohan, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Junio, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: 31 de diciembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Danda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo indio de Investigación médica, Grant no /-BMS Nano 35/6/2010 para llevar a cabo la clonación, la transfección, y el análisis funcional. En parte, este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India, Grant sin TC /01 /CE1B /11 /V /16 para realizar el perfil de la familia let-7miRNA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los tratamientos convencionales como la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía son los medios más eficaces para el tratamiento de pacientes con cáncer [1]. Sobre la base de los estadios de la enfermedad, los métodos actuales de tratamiento para el retinoblastoma (RB) la neoplasia más frecuente del ojo en la infancia, incluyen la quimioterapia intensiva, la radiación, la consolidación con rescate autólogo de células madre hematopoyéticas y la resección quirúrgica. Sin embargo, los pacientes con diseminación vítrea de la retina, semillas submenús y las enfermedades avanzadas multifocales bilaterales son un reto importante con las opciones actuales de tratamiento [2], [3]. Reciente descubrimiento de las células madre de cáncer, un subconjunto de células cancerosas con propiedades de células madre que es en parte, responsables del crecimiento tumoral con diferentes propiedades en comparación con las células tumorales diferenciadas están aumentando la complejidad del tratamiento del cáncer [1]. Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de tratamiento para luchar contra el cáncer. Entre los diversos enfoques, la terapia de gen suicida podría ser una estrategia alternativa prometedora ya que la expresión gen suicida se puede regular a un tejido particular [4], [5]. terapia génica suicida implica el suministro intracelular de un gen que codifica para una enzima que transforma un profármaco en un producto citotóxico [6], [7]. El gen suicida más comúnmente utilizado es el virus herpes simplex tipo I timidina quinasa (HSV-TK). Varios estudios habían utilizado la terapia de gen suicida HSV-TK para tratar RB y otros cánceres [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. No expresión específica del gen suicida en las células normales es una limitación grave en las estrategias de gen suicida existentes para la terapia del cáncer.
Promotores específicos de tejido diferente
Con el fin de controlar de manera eficiente la expresión de los transgenes sólo en células diana, varios estudios han utilizado [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Un tal promotor es /17-1A promotor epitelial glicoproteína-2 /EpCAM (EGP2) que mata selectivamente el EpCAM sobre las células que expresan en muchos tipos de cáncer mediante la expresión restringida de los conocimientos tradicionales (timidina quinasa) seguido de ganciclovir (GCV) de tratamiento [21], [ ,,,0],22]. EpCAM /CD326 es un tipo I glicoproteína transmembrana que se expresa en la membrana apical de las células cancerosas y muestra la expresión baso-lateral en las células epiteliales normales. Se ha informado que se expresa específicamente en el tejido epitelial, y sobre expresado en la mayoría de carcinomas epiteliales humanas, incluyendo colorrectal, mama, próstata, cabeza y cuello, carcinomas hepáticos y retinoblastoma [23], [24]. la expresión génica controlada en los tejidos diana es crucial para la terapia génica en particular en el contexto de la terapia génica suicida cáncer. A pesar de promotor específico de tejido terapia génica suicida impulsado mostró resultados prometedores, filtraciones expresión de los promotores específicos de tejido en células no objetivo ha informado [21]. Por lo tanto, las estrategias alternativas son esenciales, además de la regulación promotor específico de tejido de la terapia génica suicida
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes,. (& Gt; 1000 en células de mamíferos) que regulan diversas funciones celulares que van desde la división celular, la transducción de señales y el metabolismo. La regulación postranscripcional de la expresión génica a través de miARN mediada por ARN de interferencia (ARNi) es bien conocido [25]. miRNAs son conocidos para bloquear la traducción de ARNm o reducir la estabilidad del mRNA después de la perfecta unión de la hebra guía a los elementos miARN-reconocimiento (MRE) dentro del 3
Región luntranslated (UTR) de los genes diana [26], [27], [28], [29]. let-7 es una clase de miRNAs que están implicados en la regulación celular y la supresión de tumores. Estudios anteriores sobre la próstata, de pulmón y de mama, mostraron regulación a la baja de los miRNAs let-7 de la familia [30], [31]. Recientemente, Glial proteína ácida fibrilar (GFAP) promotor impulsado vectores de expresión de genes específicos de tejido a lo largo de las secuencias diana para el miARN desregulado (mir122a, mir31, mir127, mir143) se introdujeron en la región 3'UTR del transgén [32], [ ,,,0],33], [34], [35], [36]. Este enfoque ha permitido la expresión de los transgenes sólo en las células cancerosas de glioblastoma en cuestión sin ningún expresión en células de astrocitos normales del mismo linaje [34].
En este estudio, hemos construido un vector de expresión de células de mamíferos, que alberga promotor EpCAM (EGP2) gen suicida impulsado HSV-TK regulado por la expresión de los niveles de miARN desregulados. El objetivo es para expresar el gen suicida sólo en EpCAM
+ ve células con muy mínima o ninguna expresión en las células normales del mismo linaje. El miARN let-7b está bajo expresadas en Y79, WERI-Rb-1 líneas celulares de cáncer. Hicimos EGP2-TK construcción de 2 y 4 copias de let-7b miARN secuencias diana. La expresión de gen TK se limita a líneas celulares de cáncer, tales como Y79, WERI-Rb-1, MDA-MB-453, MCF-7 y mientras que los conocimientos tradicionales de la expresión génica es mínima en la línea celular MIO-M1. Hemos demostrado por primera vez el uso del promotor EpCAM impulsado miARN gen suicida conocimientos tradicionales regulada en EpCAM positivo y let-7 celdas hacia abajo regulados. Esta estrategia ofrece un control de nivel dos niveles del transgén que puede dar lugar a una expresión del transgen selectiva en las células cancerosas sin ninguna expresión en las células normales.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
muestras de tumores del retinoblastoma se obtuvieron de bolas de los ojos enucleados como parte de la terapia y utilizados para fines de investigación, un consentimiento general por escrito se obtuvo de los padres /tutores de la enucleación paciente que se somete. El estudio se llevó a cabo después de obtener la aprobación del Subcomité (Institutional Review Board) Ética de Sankara Nethralaya hospital de ojos [Éticos de limpieza no: 147 (A) -2009-P].
Las muestras tumorales y detalles patológicos
para este estudio se utilizaron 10 tumores del retinoblastoma frescas, detalles Clinocopathological para los tumores estaban basados en el grupo de trabajo internacional de estadificación del retinoblastoma (IRSWG) [37], [38] y se dan en la tabla S1. Agrupado retina adulta de 50-55 (n = 3) se utilizaron años de edad como control y se obtuvieron de los ojos de cadáveres donados al Banco de Ojos CU Shah, Sankara Nethralaya.
Cultivo de células
La retinoblastoma Y79 línea celular, WERI-Rb1 y celulares de cáncer de mama líneas MDA-MB-453, MCF-7 se obtuvieron de Bio RIKEN Centro de recursos (Japón). línea de células gliales de retina humana Müller MIO-M1 derivados de la retina neural estaba dotado de G. A. Miembro, Instituto de Oftalmología del UCL, Londres, Inglaterra [39]. tiroides humana de células del epitelio folicular Nthy-ori 3-1 estaba dotado de Dr.Omer Ugur, Instituto Hacettepe de Oncología [40], [41]. MIO-M1, MDA-MB-453, MCF-7 se cultivaron en la modificación de medio de Eagle (DMEM) que contiene glutamina, suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS), penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina de Dulbecco (100 IU /ml). Nthy-ori 3-1 y Y79, WERI-Rb1 se cultivaron en RPMI1640 suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal de ternera, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, y 4,5% de dextrosa y se cultivaron en suspensión a 37 ° C en una incubadora de CO 5%
2-humidificado.
in vitro
expresión del transgen análisis
(EGP2-TK) fue proporcionado amablemente por el Dr. MG putrefacciones, Departamento de modulación gen terapéutico, Centro Universitario de Farmacia, Universidad de Groningen, Países Bajos. El vector de expresión pUT649 que contiene un gen de resistencia a zeocina y que lleva el gen HSV-TK bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV-TK) [generado por el profesor G.Tiraby (Universidad de Toulouse), Cayla, Francia] se transfectaron transitoriamente en Y79 , WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1 utilizando Lipofectamine TM 2000 transfección reactivo (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
clonación de los genes miARN objetivos en el plásmido EGP2-TK
Para construir los plásmidos con let-7 miARN secuencias diana, EGP2-TK se utilizó como una red troncal que contiene HSV-TK en el aguas abajo del promotor EGP2. Para la construcción de los genes miARN objetivos, los oligonucleótidos fueron diseñados con objetivos let-7b (secuencia complemento perfecto de let-7b miARN fue tomado de miRBase adhesión sin MIMAT0000063) seguido de
KpnI
que se designan como T1A (teniendo blancos perfectos revertir complementaria a la let-7b miARN) y T1B (perfectamente complementaria a T1A) fueron recocidos y se ligó entre los
NotI
y
BstBI
sitios de restricción que resulta en EGP2-TK-2T tener 2 copias de los objetivos let-7b. La
KpnI
/
BstBI
fragmento se digirió con las enzimas respectivas y se ligó con los oligonucleótidos que tienen dos copias de las secuencias diana más let-7b. Que se designa como T2A (que tiene objetivos perfecta complementaria de let-7b miARN) y T2B (perfectamente complementaria a T2A), respectivamente. Estos fueron recocidos y ligado resultante en EGP2-TK-4T tiene 4 copias de secuencias diana let-7b. Los objetivos de control C1A, C1B y C2A, C2B se generaron mediante la adopción de la perfecta inversa complementaria de la let-7b genes miARN objetivo. A lo largo del manuscrito EGP2-TK con 2 copias de los objetivos de let-7b serán mencionados como EGP2-TK-2T y 4 copias de los objetivos de let-7b como EGP2-TK-4T. En la forma misma EGP2-TK con 2 copias de la secuencia de control de let-7b se hará referencia como EGP2-TK-2C y 4 copias de la secuencia de control se denotan como EGP-TK-4C. Las construcciones de plásmidos de ensayo de luciferasa (luc) reportero se generaron mediante la sustitución del gen HSV-TK con el
Guassia luciferasa
gen. Las construcciones de luciferasa fueron nombrados como se mencionó anteriormente reemplazando los conocimientos tradicionales con luc. La Tabla 1 muestra los oligonucleótidos utilizados en el estudio.
miARN análisis de la expresión
El kit TaqMan ® Micro RNA transcripción reversa y la mezcla maestra TaqMan PCR Universal sin AmpErase® UNG de Applied Biosystems (CA, EE.UU.) se utilizó para la detección y cuantificación de miARN maduro. La cuantificación se realiza de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando 1 g de muestra total de ARN. Utilizamos RNU6 miRNA (ensayo de ID, 001,093) como un control. TheTaqMan® microARN (Applied Biosystems) ensayos individuales fueron utilizados para las siguientes estimaciones: miARN hsa-let-7a (ID ensayo, 000377), hsa-let-7b (ID ensayo, 2619), hsa-let-7c (ID ensayo, 000379), hsa-let-7d (ID ensayo, 002283), hsa-let-7e (ID ensayo, 2406), hsa-let-7F (ID ensayo, 000382), y hsa-let-7 g (ID ensayo, 0002282 ) y hsa-let-7i (ID ensayo, 002221). Los datos se normalizaron usando los valores de Ct para el mantenimiento de la casa U6 gen en cada muestra. Para calcular las cantidades relativas de los genes miARN, el valor promedio Ct del ARN U6 se resta del de los miARN objetivo de obtener el cambio en el valor de Ct. Después se determinó el cambio de veces en la expresión de genes como unidades relativas log2. Los productos de PCR se detectaron con un ABI PRISM 7500 secuencia sistema de detección y se analizaron con el software SDS ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems).
ensayo de gen indicador
Se utilizó luciferasa ensayo de gen indicador para el promotor análisis de la resistencia y el estudio de la regulación de los genes miARN en la expresión del transgen. plásmido que contiene la construcción pGluc -luciferase promotor CMV impulsada se adquirió de (New England Biolabs, MA, EE.UU.). El promotor EGP2 fue clonado en frente de un gen de la luciferasa (EGP2-luc) reemplazando el promotor CMV. Los 2 y 4 copias de las secuencias diana let-7b se clonaron en la región 3'UTR del constructo (EGP2-luc). La transfección se llevó a cabo de forma transitoria con los siguientes plásmidos CMV-luc, EGP2-luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C y EGP2-luc-4C. Después de 48 h de la transfección con la construcción de luciferasa, las células se lavaron con PBS y se cultivaron en medio fresco durante 24 horas adicionales. Se recogieron las células y se analizó la actividad de luciferasa y β-galactosidasa de acuerdo con los protocolos del fabricante (New England Biolabs).
Análisis de transferencia Western
Con el fin de analizar la expresión de los conocimientos tradicionales y EpCAM proteínas, extractos de células totales se prepararon por lisis de las células en el tampón de lisis [10 mM Tris-HCl pH 7.2 inhibidores, 2% ditiotreitol SDS, 10 mM, 1% de proteasa y de fosfatasa cóctel (Sigma Aldrich, MO, EE.UU.)]. La concentración de proteínas se estimó por el método de Lowry. Los lisados celulares se mezclaron con tampón de carga de Laemmli 5X y se hirvió durante 5 min. Cantidades iguales (50? G) de proteína se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 12% y electro-transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las manchas de transferencia de membrana se bloquearon durante 1 h con 5% de leche desnatada en TBS que contiene 0,1% de Tween-20 y después se incubó durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. El HSV-TK (proporcionado por el Dr. William C. Summers, Universidad de Yale) y anticuerpos EpCAM (Señalización celular, MA, EE.UU.) se utilizaron en la dilución de 1:100 y 1:150, respectivamente. Las transferencias se lavaron y se incubaron con rábano picante apropiada anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (anti-conejo 1:5000; anti-ratón 1:2000 (Señalización celular) durante 3 horas a temperatura ambiente y se visualizaron con tetrametil bencidina peróxido /hidrógeno (TMB /H
2O
2, Bangalore Genei, India) reactivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. las membranas fueron despojados utilizando glicina 100 mM, pH 2, durante 40 minutos, bloqueado, y volvieron a sondar para β-actina (Sigma). las manchas se escanearon con un sistema UVP imágenes BioDoc-IT (CA, EE.UU.) y el análisis densitométrico de las imágenes digitalizadas se realizó con el software ImageJ (NIH). la intensidad de cada banda se normalizó a la intensidad de la correspondiente banda de β-actina después de la normalización de fondo.
Medición de la sensibilidad a ganciclovir (GCV)
el Y79, WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1cells se sembraron en una placa de 24 y 96 h antes de la transfección a una densidad de 10.000 células por pocillo para determinar la viabilidad celular. la transfección se llevó a cabo de forma transitoria con plásmidos que contienen el CMV-TK, EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK 2C, EGP2-TK-4C y se incubaron durante 48 h. Las células se trataron con diversas concentraciones (1, 10, 50.100 M) de GCV para 24 h. La sensibilidad a GCV se evaluó usando el ensayo MTT colorimétrico. Un escáner de múltiples pocillos (BioTek, VT, EE.UU.) se utilizó para medir la absorbancia a 570 nm de longitud de onda. Los controles sin tratar no transfectadas se les asignó un valor de 100%. La supervivencia celular se calculó mediante la ecuación:. Prueba de DO /DO del control x 100%
Immunofluorscence
Las siguientes líneas celulares transfectadas MIO-M1, Nthy-ori-3-1, WERI-Rb1 , las células Y79 se lavaron con 1 x PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y luego se permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 durante 5 min. Las células se bloquearon con suero bovino fetal al 5% durante 30 min, se incubaron con anticuerpos anti- (señalización celular) exfoliados caspasa 3 (Señalización celular) y el anticuerpo anti-Bcl2 durante 3 horas, luego con FITC (verde) y TRITC (rojo) conjugado Los anticuerpos secundarios (Jackson Immunoresearch, PA, EE.UU.) durante 2 h. Las células de la tinción se visualizaron utilizando un microscopio Zesis Axio vison sistema invertida con objetivo de 10X. Para asegurar la especificidad de la tinción, las imágenes se obtuvieron utilizando la configuración en la que no fluorescencia fue detectable en los controles negativos con anticuerpos secundario solo (datos no mostrados).
El análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± SD de 3 experimentos con cada experimento realizado por triplicado. La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student y un valor de p ≤ 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
Restringido conocimientos tradicionales de expresión por el promotor EGP2
Se analizó la expresión selectiva del transgén por el promotor EGP2 en Y79, WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1 líneas celulares. Western blot mostró expresión de la proteína EpCAM en Y79, WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1 células y su expresión no se observó en la línea celular MIO-MI (Figure1A). Por lo tanto, el Y79, WERI-Rb1, 3-1cells Nthy-ori se consideraron como EpCAM positivo (EpCAM
+ ve) y MIO-IM como EpCAM negativo (EpCAM
-ve) para la expresión de la proteína EpCAM. Para evaluar el promotor EGP-2 por su capacidad para regular la expresión de HSV-TK en el EpCAM células que expresan, transfectadas transitoriamente las células con promotor EGP2 impulsado constructo HSV-TK (EGP2-TK). El impulsado por CMV-promotor HSV-TK (CMV-TK) construcción se usó como control positivo. En CMV-TK células transfectadas transitoriamente, la proteína de los conocimientos tradicionales se expresó en todas las líneas celulares (Nthy-ori 3-1, Y79, Weri-Rb1 y MIO-M1) (Figura 1B). En EGP2-TK células transfectadas de forma transitoria, la expresión de los conocimientos tradicionales se ha visto en Nthy-ori 3-1, células Y79 y WERI-Rb1. Por otra parte, la expresión de la proteína conocimientos tradicionales era baja en las células MIO-M1 (Figura 1C). Esto podría ser debido a la falta de estanqueidad del promotor EGP2 como se informó anteriormente en otros promotores [34], [35]. En tiempo real los experimentos de PCR del gen TK impulsado promotor de CMV mostró expresión constante en todas las líneas celulares (Figura 4 1D). EGP2-TK transfectadas Nthy-ori 3-1, líneas de células Y79 y WERI-Rb1 mostraron expresión significativa los conocimientos tradicionales más alta en comparación con el CMV-TK transfectadas líneas celulares. Sin embargo, el promotor EpCAM redujo significativamente la expresión de gen TK en la línea celular MIO-MI (Figura 1D). ensayo de gen indicador mostró que la transfección de CMV-luc exhibieron una expresión significativa del gen mayor en comparación con las células no transfectadas. La transfección EGP2-luc en el 3-1, Y79, y líneas de células WERI-Rb1 Nthy-ori mostró significativamente mayor de expresión de luciferasa en comparación con el CMV-luc células transfectadas excepto en MIO-M1 donde la expresión de la luciferasa es significativamente menor en EGP2- luc transfección (Figura 1E). Estos resultados muestran que el promotor EpCAM se activa selectivamente en EpCAM líneas celulares positivas Y79, WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1, y no en EpCAM línea celular negativa MIO-M1.
expresión de EpCAM fue evaluada por el oeste el análisis de transferencia y β-actina se utilizó como control de carga (a). La expresión del transgén impulsada por EGP2 y promotor CMV fue evaluada por transfección transitoria de CMV-TK, EGP2-TK, CMV-Luc, y EGP2-luc. Después de 2 días de expresión de la proteína transfección conocimientos tradicionales impulsado por el promotor CMV se evaluó mediante Western blot y los resultados se normalizaron en contra de la β-actina (B). expresión de la proteína conocimientos tradicionales impulsado por el promotor EGP2 se evaluó mediante análisis de transferencia Western y los resultados se normalizaron en contra de la β-actina (C). La cuantificación de proteínas se cuantificó mediante el uso de software y la proteína de expresión ImageJ se expresó en valores de intensidad de señal relativa. los niveles de mRNA de los conocimientos tradicionales fueron cuantificados por PCR en tiempo real, los niveles de mRNA se normalizaron en contra de la GAPDH y se expresaron en unidades relativas de cambio veces (D). análisis de la expresión de luciferasa se realizó mediante la cuantificación de la luciferasa Gaussia secretada. Los resultados se normalizaron frente a las células transfectadas de las Naciones Unidas y se expresaron en unidades relativas de luz (E). niveles normalizados de expresión de luciferasa como porcentaje muestran como media ± S.D. (n = 3). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 vs. Control, + p & lt; 0,05, ++ P & lt; 0,01, +++ p & lt;. 0.001 vs. CMV-luc
EGP-2 promotor controla la muerte celular selectiva mediante la expresión restringida de los conocimientos tradicionales
con el fin de evaluar los aspectos funcionales de la expresión de gen TK, diferentes concentraciones (1, 10, 50, 100 M) del tratamiento con GCV se realizó durante 24 horas sobre el CMV-TK o TK-EGP2 líneas celulares transfectadas transitoriamente como Y79, WERI-Rb1, Nthy-ori 3-1, MIO-M1. La concentración de 10 mM de tratamiento con GCV mostraron casi el 50-60% de la viabilidad celular en el todo el CMV-TK transfectadas líneas celulares estudiadas. El porcentaje de viabilidad celular disminuyó al aumentar la concentración de GCV en Nthy-ori 3-1, Y79, y las células WERI-Rb1 (Figura 2A, 2C, 2D). En estas líneas celulares, la viabilidad celular se redujo bajo el promotor regulado EpCAM conocimientos tradicionales en comparación con la de los conocimientos tradicionales regulado promotor CMV en EpCAM
+ ve células. En las células MIO-MI, la tasa de viabilidad celular es de un 60% bajo la regulación del promotor CMV de TK /GCV (Figura 2B) y el 90% bajo la regulación del promotor del gen EpCAM. Por otra parte, la viabilidad celular disminuyó de manera significativa en los conocimientos tradicionales promotor regulado EpCAM en Y79, WERI-Rb1, 3-1 células Nthy-ori. Estos resultados sugieren promotor EGP2 está expresando gen TK en EpCAM
+ ve y no en los EpCAM
líneas celulares -ve.
ensayo de viabilidad celular por MTT se evaluó mediante la transfección de la EGP2-TK y CMV plásmidos TK en las líneas celulares. Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 (C), WERI-Rb1 (D). Después de 48 horas de la transfección, seguido por tratamiento con GCV a diferentes concentraciones (1, 10, 50, 100 mM) durante 24 horas. Los resultados se normalizaron frente a las células transfectadas de las Naciones Unidas y se expresaron en porcentaje de la viabilidad celular. La viabilidad celular se muestra como porcentaje de la media ± SD (n = 3).
Presencia de let-7 miARN familia de Retinoblastoma por PCR en tiempo real cuantitativa
Se ha informado de que , let-7 miRNAs son apoptóticas de la familia, y muy conservadas entre especies en la secuencia y la función y la desregulación de let-7 de la familia conduce al cáncer [25]. Se analizó el perfil de expresión de let-7 en la familia (n = 10), los tumores primarios y retinoblastoma Y79, WER-Rb1, MIO-M1, las líneas celulares 3-1 Nthy-ori (Figura 3). La familia let-7 se regula hacia abajo en tumores primarios en comparación con el de la retina normal del adulto. let-7a se regula altamente abajo, entre los miembros de la familia let- 7 en tumores primarios (Figura 3A, B). let-7c y 7d let-altamente descenso regulado en Y79 y WERI-Rb1, respectivamente, en comparación con la línea MIO-M1cell (Figura 3C). En Nthy-ori línea celular de 3-1, todos los miARN fueron hasta reguladas en comparación con MIO-M1 (Figura 3C). Por otra parte, let-7b mostró regulación a la baja constante, tanto en las líneas de células de retinoblastoma, en comparación con otros miembros de la familia let-7 y mostró alta regulación en Nthy-ori 3-1. Por lo tanto, este (let-7b) fue elegido para clonar secuencias de los genes miARN objetivo en nuestras construcciones de plásmidos.
La expresión de let-7 miRNAs se cuantificaron usando PCR en tiempo real. Se evaluó el análisis de la expresión de let-7 miRNAs familiares en los tumores primarios del retinoblastoma. Los resultados se normalizaron en contra retina adulto normal y se expresaron en valores de cambio de veces en relación con retina normal del adulto (A, B). Se evaluó el análisis de la expresión de let-7 miRNAs en líneas celulares de la familia de retinoblastoma. Los resultados se normalizaron en contra MIO-M1 y se expresaron en valores de cambio de veces en relación con MIO-M1 (C). miARN cambio veces se calculó utilizando 2
-▵▵CT método.
in vitro
ensayo de luciferasa En mediada por pCMV /EGP2-
luc
vectores
La transfección de EGP2-TK y construcciones EGP2-luc en la línea celular negativa EpCAM mostró una expresión significativa de los conocimientos tradicionales y los genes de luciferasa (Figura 1 C, e). A citotoxicidad significativa tras el tratamiento GCV observado en EpCAM línea celular negativa MIO-M1 en EGP2-TK transfección con el tratamiento GCV (Figura. 2B) podría ser debido a la expresión de fugas promotor EGP2 en líneas celulares negativas EpCAM. Se observó una expresión agujereada similar del promotor GFAP en astrocitos normales [34]. Para regular la expresión no específica de transgén impulsada por el promotor EGP2, hemos clonado objetivos let-7b en la región 3'UTR del constructo EGP2-luc (Figura 4A). Las células se transfectaron con el EGP2-luc, EGP2-luc-2T EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, EGP2-luc-4C construcciones de plásmidos y la expresión del gen de la luciferasa se analizó después de 24 h. Se observó una reducción significativa en la actividad de la luciferasa con EGP2-luc-2T y EGP2-luc-4T en comparación con EGP2-luc en MIO-M1 (EpCAM
-ve /let-7b
hasta regulado) y Nthy -ori 3-1 (EpCAM
+ ve /let-7b
hasta reguladas) células (Figura 4B). Se observó una reducción significativa adicional en la actividad de la luciferasa en EGP2-luc-2T en comparación con EGP2-luc-4T en células MIO-M1. Sin embargo, en Y79 y WERI-Rb1 (EpCAM
+ ve /let7
reguladas por) las células, que no observaron una reducción significativa en la actividad luciferasa de EGP2-luc-2T y EGP2-luc-4T en comparación con la EGP2-luc (Figura 4B). Estos resultados hace hincapié en la necesidad de que la regulación de los genes miARN de la expresión de los transgenes junto con el promotor específico de tejido para la expresión dirigida de transgén.
target miARN secuencias de dos copias o cuatro copias como se detalla en la Tabla 1. El gen indicador de luciferasa bajo el promotor CMV fue clonado en el constructo de EpCAM-TK mediante la eliminación de gen TK y la inserción del gen de la luciferasa. miARN objetivos fueron clonados en la región 3 'UTR del vector de expresión que contiene el gen Gluc bajo el promotor EpCAM (A). La expresión de luciferasa se cuantificó mediante la luciferasa Gaussia secretada. El plásmido construye EGP2-luc, EGP2-luc-2T, EGP2-luc-4T, EGP2-luc-2C, y EGP2-luc-4C se transfectaron en MIO-M1, Nthy-ori 3-1, Y79, WERI-Rb1 líneas celulares. Después de la incubación durante 48 horas los resultados se normalizaron a las células de la ONU transfectadas y se expresaron en unidades relativas de luz (B). los niveles de luciferasa se expresan como porcentaje de la media ± S.D. (n = 3). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001 frente a EGP-2-luc-2T
Cell citotoxicidad específica mediante transfección de doble control vectorial con tratamiento con GCV fue mayor que ETK solo
Se evaluó la citotoxicidad específica inducida por el tratamiento con GCV en EGP2-TK-2T y transfección EGP2-TK-4T en comparación con los controles EGP2-TK, EGP2-TK-2C y EGP2-TK-4C en todo las 4 líneas celulares. Las líneas de células normales Nthy-ori 3-1 (Figura 5A) y MIO-M1 (Figura 5B) transfectadas con EGP2-TK-2T y EGP2-TK-4T construye con el tratamiento con GCV dio lugar a la muerte celular significativa menor en comparación con el EGP2- los conocimientos tradicionales. Estas líneas celulares mostraron menos significativa citotoxicidad mediada por EGP2-TK-2T en comparación con el constructo EGP2-TK-4T. En líneas celulares de retinoblastoma Y79 (Figura 5C), WERI-Rb-1 (Figura 5D) transfectadas con EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C y EGP2-TK-4C construye, seguido por tratamiento con GCV mostraron ninguna diferencia significativa en la muerte celular. Estos resultados muestran que las células citotoxicidad específica mediada por HSV-TK tras el tratamiento con fármaco GCV fue regulada por genes miARN objetivos let-7b en las líneas celulares normales.
ensayo de viabilidad celular por MTT se evaluó por transfección de la EGP2-TK , EGP2-TK-2T, EGP2-TK-4T, EGP2-TK-2C, EGP2-TK-4C plásmidos en las líneas celulares, Nthy-ori-3-1 (A), MIO-M1 (B), Y79 ( C), WERI-Rb1 (D). Después de 48 horas de la transfección, seguido por tratamiento con GCV a diferentes concentraciones (1, 10, 50, 100 mM) durante 24 horas, las lecturas se midieron a 570 nm usando un espectrofotómetro. Los resultados se normalizaron a las células no transfectadas. La viabilidad celular se muestra como porcentaje medio ± S.D. (n = 3). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001 frente a control
EpCAM promotor y la secuencia diana let-7b median la expresión del marcador de apoptosis en células de retinoblastoma
Para controlar el reportado filtraciones expresión del gen TK en las células que no son dirigidos normales (Figura 1 & amp; 2), transfectadas EGP2-TK, EGP2-TK-2T, EGP2-TK-2C construye en las siguientes líneas celulares : N-Thy-Ori-3.1, MIO-M1, Y79 y WERI-Rb-1. Puesto que, se observó EGP2-TK-2T mostró un efecto significativo en el control de la expresión del transgen, elegimos solamente EGP2-TK-2T para el análisis de marcadores de apoptosis después del tratamiento con GCV. El constructo EGP2-TK fue altamente expresado en EpCAM
+ ve líneas celulares, Nthy-ori 3-1 (Figura 6A, carril 1), Y79 (Figura 6A, carril 3), WERI-Rb-1 (Figura 6A, carril 4), en comparación con EpCAM
-ve MIO-M1cell línea (Figura 6A, carril 2). La transfección de constructo EGP2-TK-2T restringe la expresión conocimientos tradicionales sólo en líneas de células de retinoblastoma (Figura 6B, carril 3, 4) y no en las líneas celulares normales tales como MIO-M1 y Nthy-ori 3-1 incluso en presencia de proteína EpCAM. Las líneas de células de retinoblastoma transfectadas EGP2-TK-2T tratados con fármaco GCV mostraron el marcador de apoptosis, activada Caspase3 y marcador necrótico PARP-1 de expresión (Figura 6C, carriles 3, 4), pero no en líneas normales de células (Figura 6C, carriles 1, 2). A fin de validar la expresión de marcadores de apoptosis, hemos realizado experimentos immunofluroscence donde se observaron resultados similares, lo que apoya la expresión de marcadores de apoptosis en el western blot (Figura S1). En lugar de PARP se utilizó Bcl-2, que es un marcador de apoptosis contra.
El análisis de transferencia Western se realizó para determinar la presencia de la proteína de los conocimientos tradicionales, EGP2-TK se transfectó en Nthy-ori-3-1, MIO-M1 , Y79 y líneas de células WERI-Rb-1 (A).