Extracto
Los pacientes con cáncer de páncreas se desarrollan típicamente invasión tumoral y metástasis en la primera etapa. Estos comportamientos malignos pueden ser originados a partir de células madre del cáncer (CSC), pero el objetivo es responsable de menos conocida sobre células madre cancerosas invisibles especialmente para la invasión y la metástasis. Hemos examinado anteriormente la actividad del proteasoma de células madre cancerosas y construimos un sistema de visualización en tiempo real para los CAC pancreáticos humanos. En el presente estudio, se encontró que los CAC eran altamente metastásico y predominantemente localizada en los márgenes del tumor invasor en un modelo de metástasis hepática. Microarrays y ensayos de selección de siRNA mostraron que doublecortin-quinasa 1 (DCLK1) se expresa predominantemente en la modificación de histonas en células madre cancerosas pancreáticas con potencial invasivo y metastásico. La sobreexpresión de DCLK1 llevó a morfología ameboide, que promueve la migración de células de cáncer de páncreas. Desmontables de DCLK1 profundamente suprimido en la metástasis hepática in vivo de células madre cancerosas pancreáticas. Clínicamente, DCLK1 se sobreexpresa en los tumores metastásicos en pacientes con cáncer de páncreas. Nuestros estudios revelaron que DCLK1 es esencial para las propiedades invasivas y metastásicas de células madre cancerosas y puede ser un prometedor y epigenética diana terapéutica en el cáncer de páncreas humano
Visto:. Ito H, Tanaka S, Akiyama Y, Shimada S, Adikrisna R, S Matsumura, et al. (2016) dominante Expresión de DCLK1 en las células madre del cáncer pancreático humano acelera la invasión tumoral y la metástasis. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10.1371 /journal.pone.0146564
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 17 Agosto, 2015; Aceptado: 18 de diciembre de 2015; Publicado: 14 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Ito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto para el Desarrollo de la investigación innovadora sobre la terapéutica del cáncer (P-directo), una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en Áreas innovadores, Investigación Científica (A), desafiando la investigación exploratoria del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia & amp; Tecnología de Japón, y un Health & amp; Ciencias del Trabajo de Ayuda de Investigación del Ministerio de Salud Laboral & amp; Bienestar de Japón. Número: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL:. Https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : CSC, cáncer de células madre; ODC, ornitina descarboxilasa; Gdeg, ZsGreen-etiquetado degron ODC; H3K4me3, la histona H3 lisina 4 tri-metilación; H3K9me3, histona H3 lisina 9 tri-metilación; H3K27me3, histona H3 lisina 27 tri-metilación; FACS, la clasificación de células activadas por fluorescencia; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción; QRT-PCR, RT-PCR cuantitativa; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Introducción
El cáncer de páncreas es el tipo común de cáncer más letal, ya que por lo general se diagnostica en una etapa avanzada y es resistente al tratamiento [1]. La tasa de supervivencia global a los 5 años después del diagnóstico es de aproximadamente 5-6%, que es la tasa más baja de cualquier tipo de cáncer [2]. A pesar de las técnicas quirúrgicas recién elaborados y de fármacos contra el cáncer, la eficacia del tratamiento para el cáncer de páncreas no ha mejorado significativamente en la última década debido a la tendencia a la invasión y la metástasis temprana [3]. Estas características altamente malignos son debido a la auto-renovación y diferenciación de una pequeña subpoblación de células cancerosas con propiedades madre-como, los llamados células madre del cáncer (CSC) [4, 5], que también se hace referencia a las células madre como metastásicos [6, 7]. Estudios recientes revelaron que el destino de células madre está determinada por los mecanismos epigenéticos incluyendo la modificación de histonas en células normales [8] o células madre cancerosas [9]. Más importante aún, se espera que la identificación de dianas moleculares de las CSC para acelerar el desarrollo de nuevas terapias dirigidas [10]. Aunque varios marcadores de superficie celular se han identificado como características de células madre cancerosas pancreáticas [5, 11], los objetivos terapéuticos del proceso invasivo y metastásico aún no están claros en el cáncer de páncreas [12, 13]. La evaluación de estrategias terapéuticas para apuntar células madre cancerosas es difícil debido a la complejidad de la reconstrucción de poblaciones mixtas con progenie diferenciada de una manera jerárquica [14, 15]. Un sistema de control basado en las funciones de CSC-específicos podría ser una solución a estas dificultades, y que utiliza la actividad del proteasoma baja de células madre cancerosas para crear un sistema de este tipo. fueron diseñados células de mama y el cáncer de glioma humano para expresar de forma estable fluorescencia verde fusionada a la degron de la ornitina descarboxilasa (Gdeg), que resultó en la acumulación intracelular de la proteína verde fluorescente Gdeg como consecuencia de la baja actividad de la proteasoma 26S [16, 17] . Mediante el uso de esta propiedad, que previamente construido un sistema de visualización en tiempo real para los CAC de hígado humano y se demostró su alta capacidad metastásica con el nicho de la formación [18]. Nuestro sistema de visualización se utilizó también para aclarar las características altamente malignos de células madre cancerosas pancreáticas humanas [19]. En el presente estudio, hemos identificado doublecortin-quinasa 1 (DCLK1) como una proteína que se expresa predominantemente en células madre cancerosas invasivas y metastásicas. El gen se asocia con cambios epigenéticos incluyendo H3K4me3 y modificación de las histonas H3K27me3. DCLK1 se había informado anteriormente a ser un marcador de células madre candidato normal en el intestino [20, 21]. Sin embargo, Nakanishi
et al
. experimentos linaje de rastreo utilizado y mostraron que DCLK1 marca las células madre tumorales que producen continuamente la progenie del tumor [22]. Además, Westphalen
et al
. se utiliza la misma estrategia e informó de la relación entre las células y la iniciación del cáncer de colon [23] DCLK1-positivas vivido largo. Según el reciente informe de Bailey
et al
., Neoplasias de páncreas en ratones que expresan DCLK1 contienen morfológica y funcionalmente distintas subpoblaciones con propiedades CSC-como [24]. Usando el sistema de visualización de arriba y cánceres de páncreas metastásico, nuestros estudios revelaron que DCLK1 es altamente expresado en células madre cancerosas pancreáticas humanas y en muestras clínicas y puede representar una diana terapéutica.
Materiales y Métodos
transducción retroviral del reportero degron en células de cáncer de páncreas humanos
la secuencia degron de ornitina descarboxilasa (ODC) es reconocido directamente por los proteasomas, lo que conduce a la destrucción inmediata de la proteína implicada [16]. El vector de expresión retroviral pQCXIN-ZsGreen-CODC, que contiene fluorescencia verde ZsGreen marcado degron ODC (Gdeg), fue proporcionado amablemente por el Dr. Frank Pajonk (Jonsson Comprehensive Cancer Center de la UCLA, CA, EE.UU.). El vector se transfectó en células de empaquetamiento retrovirales platino [25], y el retrovirus recogida del sobrenadante se utilizó para infectar células de cáncer pancreático. Se seleccionaron transfectantes estables con G418 (geneticina; Promega, Madison, WI, EE.UU.), y la acumulación de proteína ZsGreen-degronODC (Gdeg) se controló por microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (canal FITC). Para verificar la transfección estable, las células fueron expuestas al inhibidor de proteasoma MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.) durante 12 horas. La microscopía de fluorescencia se realizó utilizando AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania), y las imágenes fueron adquiridas digitalmente usando el software AxioVision (Carl Zeiss).
in vitro de migración celular y la invasión ensayos
La doble -chamber ensayo de migración se llevó a cabo mediante el uso de una cámara transwell [26] (placa de 24 pocillos, de 8 micras poros; BD Biosciences, Canaan, Connecticut, EE.UU.). Para el ensayo de invasión, transwells (BD Biosciences) matrigel recubierto (0,1 mg /ml) se prepararon por incubación en medio libre de suero durante 2 horas a 37 ° C en una placa de 24 pocillos. La cámara inferior se llenó con 0,8 ml de medio de cultivo sin antibióticos. Entonces, DCLK1 de alta expresión, de tipo salvaje, Gdeg
alta, y Gdeg
células tumorales de alto siDCLK1 (8 × 10
4 en 0,3 ml de medio libre de suero) se sembraron en la cámara superior y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas. Las células tumorales en la superficie superior del filtro se retiraron mediante el uso de un bastoncillo de algodón. Las células fueron fijadas con metanol al 100% y se tiñeron con solución de Giemsa, y el número de células que migran o invasores en la superficie inferior se contó en tres campos de gran aumento seleccionados al azar (100 ×) para cada muestra. Cada experimento se realizó por triplicado.
Análisis de microarrays
Para el análisis de la expresión génica, 2 × 10
5
KLM1 células recién ordenados Gdeg altos y Gdeg
eran bajas usado. El ARN total se extrajo de cada tipo de célula con QIAZOL, un Kit RNeasy Micro, y QIAshredder columnas de centrifugación (Qiagen, Hilden, Alemania). La integridad del ARN obtenido se evaluó con un espectrofotómetro NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EE.UU.), un 2100Bioanalyzer, y un kit de RNA6000Pico (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE.UU.). De acuerdo con el Kit GeneChip®3'IVT Express, protocolo P /N702646 Rev.7 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), ADN complementario se preparó a partir de 100 ng de ARN total mediante el uso de objetivo de etiquetado de un ciclo y un kit de reactivo de control (Affymetrix). Se realizó la detección de la hibridación y la señal de 2,0 arrays (Affymetrix) HG-U133 Plus. Los conjuntos de datos de microarrays de Gdeg
y pilas de gran Gdeg
bajas se normalizaron y anotado con la expresión Console ™ Software (Affymetrix). Estimación de los niveles de expresión de genes se obtuvieron como valores log2-transformado. Los genes fueron excluidos del análisis si la llamada detección fue "marginal" o "ausente" en ambos Gdeg
células bajas y altas Gdeg
.
El silenciamiento y la sobreexpresión de
DCLK1
ARN interferente pequeño (ARNip) dirigidas a los genes candidatos y revueltos (siRNAs) siScr que no coincidan con los genes humanos se adquirieron de Invitrogen. Recién ordenados Gdeg
pilas de gran (tanto KLM1 y BxPC3) se sembraron a una densidad de 2,0 x 10
5 células por pocillo en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de cultivo. A partir de entonces, la transfección con siRNA se realizó utilizando RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante [27]. Después de la transfección con diversas concentraciones (10 nM, 20 nM), las células se incubaron durante 48 horas a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera. El número de células viables y no viables se contó por una máquina de recuento automático de células mediante el uso de exclusión de colorante azul de tripano (CYTORECON; Hirata, Tokio, Japón). En el punto de tiempo de 48 horas después de siRNA transfección, las células se separaron de cada placa de usar para experimentos adicionales. Las secuencias diana siRNA fueron los de las pantallas de RNAi en todo el genoma de alto contenido [28]. Para construir el vector de expresión de shRNA (pSilencer
TM 2.1-U6 puro; Invitrogen) [29], las células KLM1-Gdeg (2.0 × 10
5) se transfectaron con 2,5 g de plásmido con Lipofectamine2000 (Invitrogen). El medio se cambió cada 2 días, y los transfectantes estables se aislaron por incubación en medio que contiene 400 mg /ml de puromicina. Para crear células tumorales que sobreexpresan transitorios DCLK1, se utilizó pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF
TM clones de ADNc y PrecisionShuttle
TM Vector System, OriGene Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). células KLM1 fueron transfectadas utilizando Lipofectamine2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la incubación a 37 ° C durante 48 horas, se clasificaron las células GFP-positivas para experimentos adicionales.
Los estudios in vivo de tumorigenicidad y metástasis
Ratones hembra NOD.CB17-PRkdcScid /J, edad 5-6 semanas, fueron adquiridos de Charles River Laboratory (Kanagawa, Japón). La cirugía se realizó bajo anestesia proporcionada por inhalación de isoflurano ojiva. Diversas cantidades de células clasificadas (1 × 10
2 a 1 × 10
5 Gdeg
de alta KLM1 y Gdeg
bajo KLM1; 1 × 10
2 a 1 × 10
4 Gdeg
de alta BxPC3 y Gdeg
bajo BxPC3) se mezclaron con matrigel y 100 l se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de los ratones. La formación de tumores a continuación, se monitorizó cada 4 días para un máximo de 10 semanas. El volumen del tumor se calculó usando la siguiente ecuación: volumen = (longitud) x (anchura)
2/2. Cada grupo constaba de 4-6 ratones. Para el análisis de la metástasis del hígado, la piel y el músculo abdominal, aproximadamente 5 mm de longitud, se practicará una incisión justo al lado de la línea media. El bazo se exteriorizó a través de la incisión mediante la aplicación de una tracción suave, y las células clasificadas (Gdeg
de alta KLM1, Gdeg
bajo KLM1 y Gdeg
de alta KLM1-shDCLK1, Gdeg
de alta BxPC3 y Gdeg
bajo BxPC3; n = 6), suspendida a 1 × 10
6 células por 100 l de PBS, se inyecta debajo de la cápsula del polo inferior mediante el uso de una jeringa de tuberculina con una aguja de calibre 30 . La hemostasia se obtiene aplicando una presión suave (con un bastoncillo de algodón) en el sitio de inyección. A continuación, el bazo se devolvió a la cavidad peritoneal, y el abdomen se cerró usando dos suturas de seda de 6-0 a través de la piel y el músculo al mismo tiempo [30, 31]. Hemos observado estos ratones durante 8 semanas, y luego se investigó si se había producido metástasis [32]. Todos los procedimientos in vivo en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Tokio la Universidad Médica y Dental (permiso No.0150044A).
Pacientes y muestras
Se incluyó a los pacientes que se sometieron primario y metastásico (hígado y pulmón) la resección del tumor de adenocarcinoma ductal pancreático en el hospital de la Universidad médica y Dental de Tokio entre 2005 y 2013. las muestras pareadas se utilizaron para el análisis inmunohistoquímico. tejido resecado se fijó en solución de formaldehído al 10% y embebidos en parafina para el análisis histopatológico de acuerdo con las reglas generales para el estudio clínico y patológico del cáncer pancreático primario. Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Tokio Médica y Dental (Permiso No.1080) y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes.
El análisis estadístico
Todos los valores se presentan como la media ± SD a menos que se indique lo contrario. la prueba t de Student de dos colas (para la comparación entre grupos) o el análisis de varianza de una sola vía (para la comparación de tres o más grupos) seguido de Dunnett
post-hoc
pruebas se utilizaron para los análisis estadísticos. Se utilizó el programa SPSS versión 21.0 (SPSS, Chicago, IL). La significación estadística se definió como p. & lt; 0,05
Resultados
células madre cancerosas pancreáticas visualizados son especialmente capaces de metástasis hepáticas
La transfección estable del reportero Gdeg en dos células de cáncer pancreático humano líneas con diferentes potenciales oncogénicas de la metástasis; KLM1 como células de alta capacidad con KRAS mutado, y BxPC3 como las células de baja capacidad con KRAS no mutado [33-35]. Los CCC marcadas por el reportero demostraron una Gdeg
alta población que representó aproximadamente el 1.0% del número total de células (Figura S1). En el ensayo para la formación de esfera [36], el número de esferas (& gt; 50 micras de diámetro) derivado de Gdeg
pilas de gran fue significativamente mayor que la de Gdeg
células bajos (p & lt; 0,01, Fig 1A y 1B). El aumento de la tumorigenicidad in vivo también se ha utilizado como un elemento de prueba crítica de la existencia de [4] CSC. Por lo tanto, una población seleccionada de Gdeg
células bajas o altas Gdeg
se inyecta por vía subcutánea en ratones NOD /SCID. Para Gdeg
pilas de gran derivadas tanto de las líneas celulares KLM1 y BxPC3, se confirmó el potencial altamente maligno (S2 figura). Tanto en las líneas celulares KLM1 y BxPC3, Gdeg
pilas de gran tuvieron una mayor capacidad de migrar e invadir a Gdeg
baja células en un ensayo de doble cámara (p & lt; 0,01, Figura 1C y 1D). Para investigar si las células Gdeg median metástasis in vivo, Gdeg
se inyectaron células bajas o altas Gdeg
en el bazo de los ratones NOD /SCID (n = 6). Después de 8 semanas, se confirmó visualmente la presencia de tumores en el bazo y contó el número de metástasis hepáticas. Encontramos significativamente más hepáticos tumores metastásicos en el Gdeg
alta grupo que en el Gdeg
grupo de bajos (p & lt; 0,05; Gdeg
pilas de gran-KLM1, 5.3 ± 3.4 tumores frente a Gdeg
de baja células KLM1, 0 ± 0 tumores, P & lt; 0,01; Gdeg
pilas de gran-BxPC3, 13,6 ± 5,1 tumores frente a Gdeg
baja células-BxPC3, 2.2 ± 2.8 tumores) (figura 2A y 2B, 2F y 2G ). También observamos algunos micro-metástasis en el hígado de Gdeg
grupos de alto (figura 2C) y 2H, pero observamos que no hay tumores metastásicos se observaron en los ratones inyectados con Gdeg
bajo KLM1 células. El análisis de inmunofluorescencia reveló claramente Gdeg
pilas de gran que se localizan en los márgenes del tumor (Figura 2D y 2I). La proporción de Gdeg
células secundarias de la zona del margen del tumor (MA; 200 micras) fue mucho mayor que en la zona central del tumor (CA) (Gdeg
de alta KLM1 tumoral; 26,1 ± 4,2% frente a 4,1 ± 2,5%, Gdeg
tumor de alto BxPC3, 21,0 ± 1,9% frente a 4,1 ± 0,2%, p & lt; 0,01) (Fig 2E y 2J). Al igual que en un estudio anterior [11], nuestros resultados sugieren que la células madre cancerosas tienden a invadir más fuera del tumor.
se muestran (A) imágenes microscópicas representativos de las esferas. Gdeg
de alta KLM1 y Gdeg
células de alta BxPC3 formaron esferas completas, pero Gdeg
Gdeg
células de baja BxPC3 bajo KLM1 y no lo hicieron. Barra de escala, 50 micras. (B) El número de esferas (& gt; 50 micras de diámetro) observada en cada pocillo (n = 6). Los datos son la media ± SD. ** P & lt; 0,01 en comparación con Gdeg
alta. Se utilizó la prueba t de Student de dos caras para comparar dos grupos independientes. (C y D) La migración celular y la invasión se analizaron con un ensayo de doble cámara usando Gdeg
de alta KLM1, Gdeg
bajo KLM1, Gdeg
de alta BxPC3, y Gdeg
bajo BxPC3 Células. Se muestran imágenes microscópicas representativas. La cuantificación de la migración y la invasión se presenta como la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. ** P & lt;. 0.01 en comparación con Gdeg
pilas de gran
(A y F) del hígado Representante tumores metastásicos se muestran en ratones de 8 semanas después de la inyección. (B y G) histograma muestra el número promedio de tumores en el hígado (n = 6; media ± SD). Para ambas líneas celulares, se encontró una diferencia significativa entre los Gdeg
alto y Gdeg
células bajas. * P & lt; 0,05 en (B) y ** p & lt; 0,01 en (G). (C y H) Imágenes microscópicas de hígados que fueron resecados, seccionadas y teñidas con H & amp; E se muestran. Algunos microorganismos tumores estaban presentes en el hígado. Barra de escala, 1000 m. (D e I) imágenes microscópicas fluorescentes del tumor principal se muestran. Para ambas líneas celulares, Gdeg
pilas de gran fueron localizados preferentemente en las márgenes tumorales invasoras. Barra de escala, 200 micras. Se muestran imágenes ampliadas de las regiones en caja. Barra de escala, 20 micras. (E y J) El gráfico muestra que la proporción de Gdeg
pilas de gran fue significativamente mayor en la zona marginal (MA) que en la zona central (CA; media ± SD). ** P & lt; 0,01. Contamos con tres áreas diferentes para cada región.
La sobreexpresión de DCLK1 en asociación con la modificación de histonas es responsable por el potencial invasivo de células madre cancerosas de páncreas
Para aclarar los marcadores invasivas y metastásicas de páncreas los CCC, se compararon los patrones de expresión génica entre Gdeg
y pilas de gran Gdeg
células de baja por hibridación de microarrays (S1 datos). El análisis de dispersión de los 25.572 sondas de lo que requieren detección fue de "presente" mostró que 483 genes se upregulated y 1.138 genes fueron regulados a la baja en más de 2 veces en Gdeg
pilas de gran-KLM1 en comparación con Gdeg
bajo KLM1 Células. Basándose en la clasificación veces el cambio en las Gdeg
pilas de gran (Tabla 1), la detección de genes candidatos siRNA se evaluó de acuerdo a los efectos inhibitorios sobre Gdeg
alta migración celular y la invasión utilizando el ensayo de doble cámara. En consecuencia, sólo el siRNA contra DCLK1 disminuyó significativamente la migración celular y la invasión en comparación con los controles tanto en KLM1 y BxPC3 Gdeg
células altas (p & lt; 0,01, Fig 3A y 3B). DCLK1 fue identificado como una molécula diana que se sobreexpresa en Gdeg
pilas de gran con la migración y capacidad invasiva en comparación con Gdeg
células bajos. QRT-PCR y análisis de transferencia Western reveló que DCLK1 ARNm y proteína se sobreexpresa en Gdeg
pilas de gran pero no en Gdeg
baja células (Fig S3). El análisis inmunocitoquímico mostró proteína DCLK1 fue localizada principalmente en el citoplasma (Fig 4A y 4B), y la reducción de expresión de DCLK1 se confirmó por el uso de siRNA (S3 Fig, figura 4C y 4D). A continuación, examinó los aspectos epigenéticos de
DCLK1
expresión mediante la realización de inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), análisis de tres marcadores de metilación de histonas clave, H3K4me3, H3K9me3, y H3K27me3, en ambas líneas celulares Gdeg. Como se muestra en la figura 4E, Gdeg
pilas de gran expresaron niveles más altos de H3K4me3, que se asocia con los promotores activos, que H3K27me3, que se asocia con los promotores silenciados. Gdeg
baja células fueron casi bivalente. Estos resultados implican que
DCLK1
expresión en líneas celulares Gdeg fue regulada por la modificación de histonas H3K4 y de H3K27. No se encontraron diferencias en los niveles de H3K9me3 entre Gdeg
alto y Gdeg
baja en estas líneas celulares.
(A) ensayo de doble cámara de la migración y la invasión de las dos Gdeg
líneas celulares de alta después del tratamiento. Se muestran imágenes microscópicas representativas. (B) El número de la migración y la invasión de las células en comparación con el control fue suprimido notablemente en ambos Gdeg
líneas de células-siDCLK1 altas. #no significativo, ** p & lt;. 0.01, mediante el análisis unidireccional de varianza seguido de pruebas de comparación múltiple de Dunnett
(A y B) análisis inmunocitoquímico de DCLK1 en ambas líneas celulares (aumento original × 200) se muestran. Gdeg
pilas de gran expresan la proteína DCLK1, que se localiza en el citoplasma, pero Gdeg
baja células mostraron única expresión débil. Barra de escala, 10 micras. (C y D) Inmuno análisis de las células tratadas con
DCLK1
siRNA específico de que se muestra (aumento original × 200). expresión de la proteína DCLK1 se redujo en Gdeg
pilas de gran después de la transfección con siDCLK1. Barra de escala, 20 micras. se muestra (E) Chip análisis. Ambos Gdeg
líneas celulares altas fueron fuertemente enriquecido para H3K4me3 comparación con H3K27me3 en el
DCLK1
región promotora. Histona H3 e IgG se utilizaron como controles positivos y negativos para el análisis de chip, respectivamente.
DCLK1 promueve cambios morfológicos, la migración y la invasión de células de cáncer de páncreas humano
Para investigar el papel de DCLK1 en células de cáncer de páncreas humano, adoptamos una estrategia de ganancia de función mediante el uso de células KLM1 que transitoriamente sobre-expresan DCLK1 GFP-etiquetados. Como se informó anteriormente para las líneas de células neuronales, análisis de inmunofluorescencia de KLM1-DCLK1-GFP demostró superposición de patrones de expresión DCLK1 con los microtúbulos mediante el uso de un anticuerpo α-tubulina [37] (Fig 5A). La función de DCLK1 en células de cáncer de páncreas humano puede ser por tanto para controlar la acción de los microtúbulos. El movimiento y los cambios morfológicos que incluyen pseudópodos de estiramiento se observaron claramente en las imágenes microscópicas con lapso de tiempo (figura 5B). Durante un período de observación de 15 horas, la distancia de migración de las células KLM1-DCLK1-GFP era más larga que la de las células KLM1 de tipo salvaje (P & lt; 0,01, Fig 5C). En el ensayo de doble cámara, el número de la migración y la invasión de células KLM1-DCLK1-GFP fue mayor que la de las células KLM1 de tipo salvaje (P & lt; 0,01, Fig 5D). Por otra parte, las células KLM1-DCLK1-GFP trans-localizados a través de rapidez alternando ciclos de expansión y contracción morfológica llamados migración ameboide (S1 Vídeo) [38].
(A) Inmuno análisis mostró que era predominantemente DCLK1 co localizada con α-tubulina en las células KLM1-DCLK1-GFP. Barra de escala, 20 micras. imágenes ampliadas de las regiones encuadradas se muestran en la segunda fila. Barra de escala, 10 micras. No se observaron (B) Células Cuatro KLM1-DCLK1-GFP con el tiempo la fotografía de lapso de 15 horas. Ellos adoptaron una morfología ameboide a medida que avanzaban. Barra de escala, 20 micras. Una imagen ampliada de las regiones en caja se muestra en la esquina. Las flechas blancas marcan estiramiento pseudópodos. Barra de escala, 10 micras. Se midieron sus pistas (que se muestran como líneas de puntos rojos). (C) El histograma muestra la distancia media de la migración de las células de tipo salvaje KLM1 (células de control) y células KLM1-DCLK1-GFP (n = 4 cada uno, con una media ± DE). células KLM1-DCLK1-GFP migran significativamente más largo que las células de control. ** P & lt; 0,01. (D) El número de la migración y la invasión de células KLM1-DCLK1-GFP también fue mayor que la de las células control. ** P & lt;. 0,01
DCLK1 caída conduce a una reducción en la capacidad metastásica de las células madre cancerosas pancreáticas
Para confirmar el análisis in vivo de la pérdida de la función, desmontables estable de DCLK1 se evaluó en células Gdeg-KLM1 utilizando
DCLK1
shRNA. La calidad de la transfección fue confirmada por QRT-PCR, Western Blot y inmuno análisis (Figura 6A-6C). La población de shDCLK1-Gdeg
células de alta KLM1 fue inferior al 0,5% del número total de células (Figura S1). Hemos inyectado shDCLK1-Gdeg
células de alta KLM1 recién ordenados en el bazo de los ratones NOD /SCID (n = 6). metástasis hepáticas significativas se detectaron después de la inyección de control de Gdeg
pilas de gran, pero, curiosamente, no hay lesiones metastásicas fueron identificados después de la inyección de shDCLK1-Gdeg
pilas de gran, según lo determinado por exámenes macroscópicos y microscópicos (Figura 6D). Estos resultados implican que DCLK1 juega un papel esencial en la metástasis de hígado en el cáncer de páncreas humano.
(A y B)
DCLK1
específico de shRNA (shDCLK1) disminuyó significativamente DCLK1 ARNm y la expresión de proteínas en Gdeg
pilas de gran-KLM1. ** P & lt; 0,01. (C) una marcada disminución en DCLK1 inmunoreactividad se observó después de la transfección con shDCLK1 comparación con Gdeg
alta (control). Barra de escala, 20 micras. (D) Algunos tumores a lo largo del borde del hígado eran visibles en el grupo de alto KLM1 Gdeg
, pero no se observaron tumores en el shDCLK1-Gdeg
grupo alto. El número medio de tumores en el hígado (n = 6 ratones) se muestra (media ± DE). Se observó una diferencia significativa entre el grupo control y el grupo shDCLK1. * P & lt;. 0,05
dominante expresión de DCLK1 en tumores metastásicos está reconocido clínicamente en pacientes con cáncer de páncreas
Entre los 135 pacientes con cáncer de páncreas que se sometieron a resección quirúrgica 2005-2013 en nuestro hospital, seis tumores metastásicos se resecaron sincrónica o metacrónicamente. Estas se evaluaron seis pares de tumores primarios y metastásicos para la expresión de DCLK1. Los tumores primarios y metastásicos fueron resecados de forma sincrónica en tres casos, y los tumores primarios y metástasis distantes metacronos fueron resecados por separado en los otros tres casos (Tabla 2). Curiosamente, las células cancerosas que se tiñeron positivamente para la proteína DCLK1 fueron raramente detectada en los tumores primarios, pero estaban claramente detectados en los tumores metastáticos (Fig 7A-7F), y en todos los casos, la puntuación de tinción fue mayor en los tumores metastásicos que en tumores primarios (Fig 7G). En los casos 5 y 6, en particular, los tumores primarios fueron completamente resecados y no se produjo recurrencia local. Sin embargo, a pesar de que estos pacientes fueron tratados con quimioterapia adyuvante, apareció metástasis a distancia. En estos dos casos, la expresión DCLK1 fue mucho mayor en el tumor metastásico que en el tumor primario. Estos resultados sugieren que los tumores metastásicos son resistentes a la quimioterapia convencional y que DCLK1 es un marcador de los tumores metastásicos.
(A, C, y E) En las lesiones primarias, algunas células de cáncer fueron positivos para DCLK1, y la tinción intensidad era débil (izquierda; 100 ×, a la derecha; 400 ×). (B, D y F) En las lesiones metastásicas (hígado o el pulmón), el número de células que expresan DCLK1 fue mayor que en los tumores primarios, y la intensidad de la tinción fue más fuerte (a la izquierda; 100 ×, a la derecha; 400 ×). (G) La comparación de las puntuaciones de inmunotinción entre las lesiones primarias y las lesiones metastásicas. En las seis muestras clínicas, DCLK1 fue más altamente expresado en la lesión metastásica que en la lesión primaria.
Discusión
DCLK1 consiste en un extremo N-terminal que es 65 % similar a doublecortin (DCX) a lo largo de toda la longitud de DCX, pero DCLK1 también contiene un adicional de 360 aminoácidos en el dominio C-terminal, la creación de un Ca putativo
2 + /calmodulina dependiente de la proteína quinasa.
DCLK1
se encuentra en la región del cromosoma 13q13.3 [37]. El
DCX
gen, que se encuentra en el cromosoma Xq23 región, es una proteína asociada a los microtúbulos necesaria para la migración de las células progenitoras neurales de la corteza cerebral.
Las mutaciones en DCX dar lugar a defectos de laminación cortical en el cerebro en desarrollo que se llama heterotopia banda subcortical en las mujeres y en los hombres clásicos lissencephalies [39]. Un estudio previo del ratón en el que DCLK1 y /o DCX fue eliminado puesto de manifiesto que ambas proteínas tienen papeles genéticamente compensatorios en la migración neuronal; es decir, los
DCLK1
funciones de genes en una vía parcialmente redundante con DCX en la formación de proyecciones axonales a través de la línea media y la migración de las neuronas corticales [40]. Se encontró que sobreexpresa DCLK1 promueve la migración y la invasión en líneas celulares, y la caída suprime estas habilidades. Hemos considerado cuidadosamente cómo nuestros resultados con respecto a DCLK1 ajuste con los resultados anteriores con respecto a una función neuronal para DCLK1. Existe cierta evidencia de la posible participación de los genes guían a los axones en la carcinogénesis pancreática [41], y estos resultados son consistentes con nuestra conclusión de que expresa altamente DCLK1 está estrechamente relacionado con la invasión y la metástasis en el cáncer de páncreas. control epigenético de la expresión genética juega un papel importante en la determinación del destino celular. En particular, la estructura de la cromatina de orden superior está emergiendo como un importante regulador de la diferenciación de células madre [8], incluyendo el desarrollo, incluso de páncreas [42]. Durante la inducción de la pluripotencia, se requiere remodelación de la cromatina apropiado para la expresión de genes específicos de células madre. Además, varios estudios sobre tumores cerebrales, carcinoma hepatocelular y cáncer de mama han demostrado que la modificación de las histonas es responsable de la estructura jerárquica que comprende células madre de cáncer en el ápice [43-45]. Rheinbay
et al
. informó la pérdida de H3K27me3 activa una vía de señalización requerida para el mantenimiento y la tumorigenicidad de las células madre cancerosas de glioblastoma [43]. Desmontables de H3K20 PR-metiltransferasa SET7 en el hígado inducida por el desarrollo espontáneo de carcinoma hepatocelular con propiedades de células madre del cáncer [44]. Westcott
et al
. informó una subpoblación epigenetically distinta de las células tumorales de mama con una mayor capacidad de invadir colectivamente [45]. En este estudio, el análisis reveló que el chip
DCLK1
sitio de inicio de transcripción en ambas líneas celulares de alta Gdeg
fue más fuertemente marcados con la modificación de histonas para la activación de genes (H3K4me3) que la represión (H3K27me3).