Extracto
El papel de los microRNAs en el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) es en gran parte desconocida. miR-34a se conoce como p53 supresor de tumores regulado microRNA en muchos tipos de cáncer. Sin embargo, su implicación terapéutica nunca ha sido estudiado en SCLC, un tipo de cáncer con disfunción frecuente de p53. Se determinó la expresión de un panel de 7 microARN (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, y let-7a) en 31 tumores SCLC, 14 líneas celulares de SCLC, y 26 células NSCLC líneas. Hemos observado significativamente más bajos de miR-21, miR-29b, y la expresión de miR-34a en líneas celulares de SCLC que en líneas celulares de cáncer. La expresión de los microRNAs 7 no estaba relacionado con las características clínicas de los pacientes con SCLC y no era ni de pronóstico en términos de supervivencia global o la supervivencia libre de progresión ni predictivo de la respuesta al tratamiento. La sobreexpresión o regulación a la baja de miR-34a no influyeron en la viabilidad celular SCLC. La expresión de estos microRNAs 7 también no predijo
in vitro
sensibilidad a cisplatino o etopósido en CEP líneas celulares. La sobreexpresión o regulación a la baja de miR-34a no influyeron en la sensibilidad a cisplatino o etopósido en CEP líneas celulares. En contraste con la regulación a la baja de la diana de miR-34a genes CMET y Axl por la sobreexpresión de miR-34a en líneas celulares de cáncer, la expresión intrínseca de CMET y Axl fue baja en las líneas celulares de SCLC y no fue influenciado por la sobreexpresión de miR-34a. . Nuestros resultados sugieren que la expresión de los microRNAs 7 seleccionados no son pronóstico en pacientes con CPCP, y miR-34a no está relacionada con el comportamiento maligno de las células de SCLC y es poco probable que sea una diana terapéutica
Visto: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham T, Wang Y, et al. Expresión (2011) microARN y los resultados clínicos de cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 6 (6): e21300. doi: 10.1371 /journal.pone.0021300
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 8 Febrero 2011; Aceptado: 25-may de 2011; Publicado: 22 Junio, 2011
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. El estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, programa intramuros del Instituto Nacional del Cáncer. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón microcítico (SCLC) representa aproximadamente el 10-20% de los casos de cáncer de pulmón y es conocido por su agresividad y mala tasa de supervivencia [1], [2]. A pesar del progreso logrado moderada en las últimas dos décadas, la tasa de supervivencia de los pacientes con CPCP sigue siendo muy pobres [2], [3]. En parte debido a la falta de biomarcadores moleculares adecuados para guiar el tratamiento de SCLC, los resultados clínicos de terapias moleculares dirigidas, como imatinib, gefitinib, bcl-2 inhibidores, y los inhibidores de mTOR en el tratamiento de pacientes de SCLC son decepcionantes [4].
expresión MicroARN correlaciona con características biológicas de cáncer, tales como la diferenciación celular, la agresividad, la invasión, la angiogénesis, y el comportamiento metastásico [5], [6], [7]. Por ejemplo, los miembros de la familia miR-34, miR-34a, miR-34b, 34c y miR-, son objetivos directos transcripcional de p53 y su expresión induce la detención del ciclo celular en líneas celulares de cáncer [8]. miR-29b actúa como un supresor de tumores microARN través de la restauración de un patrón normal de la metilación del ADN [9]. Clínicamente, microRNA perfiles se ha demostrado que ayuda en el diagnóstico de cáncer, así como la predicción de pronóstico y respuesta al tratamiento [6], [10]. Las funciones de los microRNAs en la biología del cáncer y la predicción del pronóstico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) han sido ampliamente estudiados. El aumento de miR-34a se asoció con un menor número de recaídas en un pequeño estudio retrospectivo de pacientes con CPNM resecado [11]. La sobreexpresión de let-7a, posiblemente a través de la supresión del oncogén RAS [12], ha demostrado estar relacionada con el aumento de la supervivencia global en pacientes con NSCLC [13], y también fue uno de los factores pronósticos de protección para prevenir la recurrencia en el CPNM resecado quirúrgicamente [14] . La sobreexpresión de "oncomiRs" miR-21 y miR-155 ha demostrado estar relacionada con una menor supervivencia global en pacientes con NSCLC [13], [15]. Sólo hay pocos datos sobre el papel de la expresión de microARN en el CPCP, y la función de varios microRNAs relacionados con el cáncer bien documentados en otros tipos de cáncer no se ha abordado en SCLC. Por ejemplo, aunque el SCLC se caracteriza por una disfunción frecuente p53 [16], el papel de miR-34a, una p53 supresor de tumores regulada microARN [8], [17], nunca ha sido estudiado en SCLC.
se ha demostrado recientemente, mediante el uso de una reacción en tiempo real en cadena de polimerasa (PCR) basada en Plateform, que los perfiles de expresión de un grupo de siete microARNs asociados con el cáncer (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR 155, y let-7a) no son ni predictivo ni pronóstico en pacientes con CPNM recibir a base de platino quimioterapia adyuvante [18]. Sin embargo, en el cáncer pancreático resecado utilizando el mismo panel de microRNAs, mostramos que la baja expresión de miR-21 se asoció con un aumento de la supervivencia después del tratamiento adyuvante en dos cohortes independientes de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático [19], lo que sugiere que la expresión de microARN y su implicaciones pronósticas y predictivos es probable que sean específicos del tumor. En el presente estudio, hemos explorado el papel de los microRNAs para la predicción del resultado, tanto el pronóstico y el tratamiento de CPCP con muestras de pacientes y líneas celulares de SCLC. A continuación, estudiamos cómo la expresión de miR-34a afecta el comportamiento maligno de las células de SCLC.
Resultados
expresión de microARN en tumores SCLC y líneas celulares de cáncer de pulmón
La Tabla 1 resume la las características de los principales pacientes, y el cuadro S1 representa la expresión de microARN en relación con variables clínicas. Se observaron tendencias a favor de una mayor expresión let-7a en las mujeres y en los pacientes más jóvenes (p = 0,07 y 0,13, respectivamente, por Wilcoxon la suma de rangos). No se observaron correlaciones significativas entre la expresión de microRNAs y características clínicas. Se comparó la expresión de los microRNAs 7 entre las líneas celulares de SCLC y líneas celulares de cáncer. Bajo la expresión de miR-21, miR-29b y miR-34a se encontró en líneas celulares de SCLC que en líneas celulares de cáncer (p & lt; 0,001 para los tres microRNAs, Figura S1), que está de acuerdo con un informe anterior [20] . Además, realizó
In situ
hibridación de miR-34b en una muestra del tumor SCLC y observó expresión citoplasmática de miR-34b y la expresión nuclear de ARN nucleolar U6 como se esperaba (Figura S2).
microARN no se correlaciona con la supervivencia de los pacientes con SCLC
La mediana de supervivencia global y la supervivencia libre de progresión de esta cohorte del estudio fueron 49,1 y 35,7 semanas, respectivamente. Como era de esperar, ya se observó la supervivencia global en pacientes con CPCP con enfermedad limitada y los pacientes que lograron una respuesta completa después del tratamiento (Tabla 1 y Tabla S2). Entre los 7 microRNAs estudiados, no hubo diferencia en la supervivencia entre los pacientes con expresión alta y baja microRNA, definida por la mediana de expresión de cada microRNA en muestras de tumor (Tabla 2). Esto fue cierto en los dos pacientes con enfermedad limitada y extensos (Tabla S3).
expresión de la proteína p53 no está relacionada con el miR-34a /b /c expresión en tumores SCLC
Como miR 34a, miR-34b y miR-34c son objetivos directos transcripcional de p53 [8] y Bcl-2 es un objetivo de miR-34a [21], se exploró si la expresión de p53 afecta a la expresión de miR-34a /b /cy si la expresión de Bcl-2 está relacionada con miR-34a. El uso de muestras de la misma cohorte de estudio, Dingemans
et al
demostró que la expresión de proteína de p53 no está relacionada con la supervivencia de los pacientes de SCLC y no está relacionada con la expresión de proteínas de bcl-2, así como [22]. Hemos observado que la expresión de la proteína de p53 en tumores SCLC no estaba relacionado con la expresión de miR-34a, 34b-MIR, y miR-34c (Figura S3 A, B y C). Además, la expresión de miR-34a no estaba relacionado con la expresión de Bcl-2 en tumores SCLC (Figura S3D).
expresión de miR-34a no está relacionado con la viabilidad de SCLC
in vitro
para explorar el papel de la expresión de microARN en el comportamiento maligno de SCLC, nos centramos en el miR-34a porque el miR-34a se informó a ser un factor predictivo de supervivencia pronóstico [11] y que es uno de los pocos candidatos para la sustitución de microARN La terapia en NSCLC [23], [24]. Nos sobre-expresa o reguladas por el miR-34a en las células de SCLC. El uso de un precursor de miR marcado con Cy3 o inhibidor para evaluar la eficacia de la transfección, se encontró que 24 horas después de la transfección, la eficacia de la transfección de miR-precursor o inhibidor en células NCI-H82 SCLC era casi 100% (Figura S4). eficacia alta de transfección también se observó en NCI-H146, NCI-N592, GLC4, A549, y las células NCI-H1299 (datos no mostrados). Hemos observado mayor madurar la expresión de miR-34a en las células transfectadas con el precursor de miR-34a e inferior madurar la expresión de miR-34a en las células transfectadas con el inhibidor de miR-34a en comparación con las células transfectadas con el precursor de control e inhibidor, respectivamente (Figura 1A). Mientras que la sobreexpresión de miR-34a induce G1 detención en varias líneas celulares de cáncer [8], la detención de G1 no se observó en las células NCI-H82 SCLC transfectadas con precursor de miR-34a (Figura 1B). Regulación a la baja de miR-34a en las células NCI-H146, que expresaron mayores niveles de miR-34a en comparación con el nivel medio de expresión de las 14 líneas celulares de SCLC (Tabla S4), y en células NCI-N592, que expresaron el nivel inferior del MIR -34a, no influyó en la viabilidad de las células de SCLC (Figura 1C y D). En contraste con el efecto supresor de tumor generalmente aceptada de miR-34a, la sobreexpresión de miR-34a en NCI-82 células fallaron para atenuar el crecimiento celular (Figura 1E), mientras que se observó atenuación de crecimiento celular en células NCI-H1299 NSCLC (Figura S5 ), como se ha demostrado en un informe anterior [23]. A diferencia de Wiggins
et al.
Quien demostró que la transfección repetitivo y largo plazo de incubación de miR-34a disminuye la viabilidad celular del cáncer del NCI-H226 NSCLC [23], pero no hemos podido observar el efecto de la transfección repetitivo de miR-34a en la disminución de la viabilidad celular en las células NCI-N592 (Figura 1F).
(a) la expresión de miR-34a en las células NCI-N592 y células NCI-H82 transfectadas con precursor de miR-34a o inhibidor. El valor Ct delta-delta se calibró con el valor Ct delta del miR34a en las células transfectadas con el control de precursores de miR o inhibidor, respectivamente. (B) la distribución del ciclo celular de las células NCI-H82 transfectadas con el control de precursores MIR, precursor de miR-34a, controlar inhibidor MIR, y el inhibidor de miR-34a. (C y D) ensayo de crecimiento celular de NCI-H146 (C) y las células transfectadas con un inhibidor de miR-34a o controlar inhibidor de miR NCI-N592 (D). (E) ensayo de crecimiento celular de las células NCI-H82 transfectadas con precursor de miR-34a o controlar precursor de miR. (F) La viabilidad celular de las células NCI-N592 después de la transfección repetitivo de control de los precursores de miR o precursor de miR-34a. Las células se contaron y se transfectaron de nuevo cada tres días. Las barras de error indican la desviación estándar. los valores de p se calcularon de acuerdo con la viabilidad celular 5 días después de la transfección con la excepción de precursor microRNA en células NCI-N592, que se calculó de acuerdo con el número de células contadas 9 días después de la primera transfección.
expresión de microARN no influye en la sensibilidad al fármaco de las células de SCLC
primero probamos la correlación entre la expresión de microARN y la sensibilidad de los 14 CEP líneas celulares a cisplatino y etopósido. No es sorprendente que la sensibilidad de las células de SCLC al etopósido se correlaciona con la sensibilidad al cisplatino (coeficiente de correlación = 0,74, p = 0,004). Se observó que la expresión de los microRNAs 7 no se asoció con la quimiosensibilidad de las células de SCLC a cualquiera de los agentes (Tabla 3).
Seguidamente, evaluó si la sobreexpresión o regulación a la baja de miR-34a en las células de SCLC influirían se informó de la sensibilidad de la quimioterapia, como la expresión de miR-34a estar relacionada con la resistencia a la quimioterapia en una línea celular de cáncer de próstata [25]. células NCI-H82, que llevan una mutación silenciosa TP53 (Tabla S4) fueron transfectadas con el control de precursores MIR, precursor de miR-34a, controlar inhibidor de miR y el inhibidor de miR-34a, y posteriormente tratados con cisplatino o etopósido. IC
50 valores por tratamiento cisplatino fueron 0,9 ± 0,02 M, 1,19 ± 0,3 M, 0,83 ± 0,15 m, y 0,79 ± 0,13 M, respectivamente (p = 0,1 por ANOVA de una vía) (Figura 2A y B). El IC
50 valores por tratamiento etopósido fueron 0,28 ± 0,05 M, 0,31 ± 0,04 M, 0,54 ± 0,40 m, y 0,58 ± 0,07 M, respectivamente (p = 0,24) (Figura 2C y D). Para GLC4 células, que llevan K132E mutación en el gen TP53 (Tabla S4), el IC
50 valores por tratamiento cisplatino fueron 3,03 ± 0,87 M, 2,56 ± 0,85 M, 1,87 ± 0,30 m, y 1,92 ± 0,61 mM, respectivamente (p = 0,14) (Figura S6A); la IC
50 valores por tratamiento etopósido fueron 0,19 ± 0,03 M, 0,28 ± 0,01 M, 0,20 ± 0,03 m, y 0,19 ± 0,06 M, respectivamente (p = 0,08) (Figura S6B). En resumen, la sobreexpresión transitoria o regulación a la baja de miR-34a en las células de SCLC no afectó la sensibilidad al cisplatino o etopósido, independientemente de la condición de TP53.
Las células fueron transfectadas con los oligonucleótidos indicados. Las barras de error indican la desviación estándar de los ensayos por triplicado.
La expresión de los genes diana de miR-34a se diferencia entre las líneas celulares de cáncer de
Se evaluó la expresión de miR-34a-objetivo genes seleccionados en líneas celulares de SCLC y NSCLC. Los genes seleccionados se cumplieron [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], y Axl [27]. Se observó una correlación inversa entre el miR-34a y c-MET, pero no Bcl-2 expresión en 5 CEP líneas celulares (Figura S7a y B). A pesar de la expresión relativamente baja de miR-34a en líneas celulares de SCLC (Figura S1), no observamos comparativamente mayor expresión de c-MET en líneas celulares de SCLC que en líneas celulares de cáncer (Figura S7a). Hemos observado sin embargo una disminución de la expresión de la proteína de cMet en A549 y líneas de células NCI-H1299 transfectadas con NSCLC precursor miR-34a (Figura 3A). Dado que la expresión Cmet en NCI-H82 fue indetectable, la expresión ectópica de miR-34a o de control de precursores no tuvo ningún efecto sobre la expresión de cMet, como se esperaba. Se observó una disminución de bcl-2 expresión de proteínas en células NCI-N592 transfectadas con precursor miR-34a (Figura 3A). Ya que sólo la MAP2K1 pero no el gen map2k2 es el objetivo de miR-34a, que no detectó expresión de la proteína reducida de MEK1 /2 en las células transfectadas con el precursor de miR-34a; esto es presumiblemente debido a redundante funciones de MAP2K1 y 2. Transfección de miR-34a precursor downregulated la expresión de ARNm del gen AXL en A549 y las células NCI-H1299 NSCLC en más de un 70% (cambio de delta Ct en más de 1,7), mientras la expresión de ARNm del gen AXL en células NCI-H82 y NCI-N592 de SCLC era demasiado bajo para ser detectado por tiempo real de ensayo de PCR (Figura 3B). En resumen, hemos demostrado que la expresión ectópica de miR-34a puede regular a la baja de miR-34a-objetivo genes en las células que expresan los objetivos
.
(A) expresión de la proteína de los objetivos de miR-34a en líneas celulares de cáncer transfectadas con precursor de control (C) o precursor miR-34a (M). expresión (B) de ARNm del gen AXL en células de cáncer transfectadas con precursor de control o precursor miR-34a. ARN se recogió 24 horas después de la transfección. La expresión del gen en las células NCI-H82 y NCI-N592 fueron indetectables (UD).
Discusión
A continuación mostramos la expresión de microRNAs 7 asociadas al cáncer conocidos en SCLC tumores y líneas celulares, así como en líneas celulares de NSCLC. Se observó que la expresión de estos microRNAs no estaba relacionado con las características clínicas y la evolución de los pacientes con SCLC. La expresión de estos microRNAs no estaba relacionado con la sensibilidad de las células de SCLC a cisplatino o etopósido. Por otra parte, la sobreexpresión o regulación a la baja de miR-34a no influyeron en la viabilidad celular SCLC o sensibilidad a cisplatino y etopósido. Asimismo, observó que la expresión de los genes diana de miR-34a puede diferir entre las líneas celulares de SCLC y NSCLC.
Aunque microRNAs han sido ampliamente estudiado en varios tipos de cáncer, hay sólo unas pocas publicaciones que abordan la función de microARN en el comportamiento maligno de SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko
et al.
Expresión de microARN comparación entre el CEP líneas celulares y tejidos de los pulmones libres de tumor de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica [28]. Du
et al.
Comparó el patrón de expresión de microARN entre el 9 y el SCLC 7 líneas celulares de cáncer, y una línea de células de mesotelioma [20], y Guo
et al.
Comparó una línea de células de SCLC, NCI-H69, con su sublínea doxorrubicina resistentes [30]. Ranade
et al
informó el único estudio utilizando muestras de tumores SCLC [29].; 16 microRNAs se estudiaron para el análisis de la supervivencia en 25 pacientes, y miR-92a-2 * se identificó como un potencial marcador de mal pronóstico.
Aunque la expresión de los microRNAs 7 en nuestro estudio se evaluó en muchos tipos de cáncer
in vitro
,
in vivo
, y en las muestras de tumor, no han sido evaluadas antes en relación con la supervivencia del paciente en el CPCP. Aunque nuestro estudio es retrospectivo y la cohorte de pacientes es pequeño, esto es, con mucho, la mayor cohorte de pacientes SCLC y colección de líneas celulares de SCLC investigación de la expresión de microARN en este tipo de tumor. En línea con nuestro informe anterior, un análisis post hoc de un ensayo aleatorizado prospectivo de gran tamaño en NSCLC [18], la expresión de los microRNAs 7 de pronóstico no era ni tampoco se correlacionan con los resultados del tratamiento en pacientes con CPCP. No podemos excluir la posibilidad de que los microARNs que no sean los 7 microRNAs que aquí se presentan pueden ser importantes para el CPCP, y por lo tanto más estudios puede justificarse en SCLC para evaluar el valor pronóstico de los microARN no incluidos en este estudio
.
miR 34a es un microRNA supresor de tumores ampliamente estudiado que media la apoptosis, la detención del ciclo celular, inhibición de la proliferación, senescencia, y la inhibición de la invasión y la migración en diversos tipos de cáncer (revisión por Hermeking
et al
. [31]). El efecto supresor de tumores de miR-34a en las células cancerosas, sin embargo, puede ser tipo específico de tumor; mientras que el miR-34a regula a la baja el crecimiento de fibroblastos IMR-90 [8], así como varias líneas celulares de cáncer [23], Li
et al.
mostró que la sobreexpresión de miR-34a no afecta ni la proliferación celular, la distribución del ciclo celular, ni la apoptosis en una línea celular de carcinoma hepatocelular [32], y Pang
et al.
demostrado que la sobreexpresión de miR-34a no tiene ningún efecto sobre la proliferación de líneas celulares de cáncer de cuello uterino Hela y SiHa, así como coriocarcinoma JAR línea celular [33]. miR-34a es una diana transcripcional directa de p53 [8], y las mutaciones del gen TP53 se han encontrado en más de 75% de las muestras de SCLC [16]. Una tendencia que favorece una menor expresión de miR-34a en líneas celulares de SCLC en comparación con el tejido pulmonar libres de tumor se ha observado anteriormente [28]. De acuerdo con nuestra conclusión de que la expresión de miR-34a ectópico no abajo-regular el crecimiento celular o inducir la detención de G1, la expresión de miR-34a no se correlacionó con el estado de la enfermedad (Tabla S1) y la progresión (Tabla 2) de los pacientes con CPCP. Curiosamente, todas las líneas celulares de SCLC probados en este estudio expresaron bajo nivel de CMET y Axl, dos genes diana de miR-34a. Es plausible que el efecto de la supresión del crecimiento de miR-34a puede ser de tejido y específicos de la enfermedad, posiblemente, dictada por el nivel de expresión de miR-34a-gen diana intrínseca en el que las células con bajos niveles de miR-34a-objetivo expresión génica, tales como células de SCLC, pueden hacer que el miR-34a funcionalmente impotentes.
En conclusión, la expresión de microRNAs 7 asociados con el cáncer no se correlacionó con los resultados clínicos de los pacientes con SCLC. la expresión de miR-34a tampoco se relaciona con el comportamiento maligno de las células de cáncer de SCLC y es por lo tanto poco probable que sea un objetivo terapéutico candidato para esta enfermedad.
Materiales y Métodos
Pacientes y ética declaración
Treinta y un fijadas con formalina, (FFPE) muestras tumorales incluidas en parafina de pacientes que se incluyeron en un estudio de fase III del grupo norte de Holanda Oncología [22] se obtuvieron del Centro Médico de la Universidad VU en Amsterdam, Holanda , con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional [22]. consentimientos informados escritos se obtuvieron de todos los participantes.
Las líneas celulares
Un panel de 14 SCLC y 26 líneas celulares de cáncer fueron estudiados y se enumeran en los materiales S1. Todas las líneas celulares de cáncer se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), con la excepción de NCI-H792, que se mantuvo en DMEM suplementado con 10% FBS. La mutación del gen TP53 en líneas de células se determinó mediante la búsqueda en el sitio web p53 (http://p53.free.fr/), la base de datos IARC TP53 (http://www-p53.iarc.fr/), y el COSMIC base de datos (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).
extracción de RNA
el ARN total fue extraído de muestras FFPE utilizando el aislamiento total de ácidos nucleicos RecoverAll kit (Ambion, Austin, TX) y el ARN total de las líneas celulares se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
La expresión de miRNAs maduros, incluyendo el miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, y let-7a, se evaluó mediante análisis de QRT-PCR como se describe anteriormente [18] . RNU6B snRNA se utilizó como control endógeno. Cada ensayo microRNA se realizó por triplicado. La expresión de microRNAs se informó como delta valor Ct (Ct valor de RNU6B - valor de Ct de la meta microARN). Se definieron los grupos de tumores o células con expresión alta o baja en función del valor medio de expresión de cada microRNA.
Expresión del gen AXL se realizó mediante el uso de ensayo de la expresión de genes Taqman (Applied Biosystems) y se informó como delta valor de Ct. gen GAPDH se utilizó como control endógeno.
La transfección de microRNA precursores o inhibidores
precursor de miR-34a e inhibidor, así como el control marcado con Cy3 precursor de miR y el inhibidor fueron adquiridos de Ambion. La transfección de miR-precursor o inhibidor se llevó a cabo utilizando SIPORT ™
NeoFX
™ transfección agente (Ambion) siguiendo las recomendaciones del fabricante a una concentración de oligonucleótido final de 30 nM.
El crecimiento celular análisis
Para determinar el efecto de la transfección sobre el crecimiento celular, 5.000-10.000 células transfectadas con el precursor microRNA indicado o inhibidor se sembraron en placas de 96 pocillos. El crecimiento celular se determinó por CellTiter 96 Solución AQueousOne Ensayo de proliferación celular (Promega Corp. Madison, WI) cada 24 horas durante 5 días sucesivos. Los resultados se presentan como la densidad óptica (valor de DO) de la absorbancia a 490 nm.
TransFectin repetitiva de células N592
100.000 células NCI-N592 de SCLC se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con el miR precursor -34a o precursor control. Se recogieron las células, se contaron, y se transfectaron de nuevo con los respectivos miRNAs cada 72 horas.
ensayos de inhibición de crecimiento
cisplatino y etopósido se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MI). 10.000 células fueron sembradas en placas de 96 pocillos de fondo plano, transfectadas con precursor indicado o inhibidor microRNAs, cultivadas durante 24 horas antes de la adición de varias concentraciones de cisplatino y etopósido, y se incubaron durante una 72-hora adicional. Los efectos citotóxicos de cisplatino y etopósido se determinaron por CellTiter 96 Solución AQueousOne Ensayo de proliferación celular. Los experimentos se realizaron por triplicado. Se determinó el porcentaje de viabilidad celular se determinó dividiendo los valores de absorbancia de las células tratadas por los de las células no tratadas, y la concentración de cisplatino o etopósido resulta en la inhibición del crecimiento del 50% (IC
50).
La inmunohistoquímica estudio
estudio inmunohistoquímico de p53 y Bcl-2 en tumores SCLC se realizaron y se informó anteriormente [22].
Western blot
células NCI-N592 y A549 transfectadas con el precursor de miR-34a o control de los precursores se incubaron durante 48 horas. Se recogieron las células, se prepararon lisados, y Western blot se realizó como se ha descrito anteriormente [34]. Los anticuerpos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (actina), Santa Cruz Biotechnology Inc (c-MET), Cell Signaling Technology (MEK1 /2), y Dako (bcl-2). Las intensidades de c-MET y bcl-2 se evaluaron utilizando software GeneTools (SynGene), normalizado por la intensidad de la actina, y calibrados para el nivel de expresión en A549 y células NCI-H146, respectivamente
ciclo celular. análisis por citometría de flujo
48 horas después de la transfección, se recogieron las células, se lavaron con PBS frío, se fijaron con etanol 70% frío en PBS durante al menos 24 horas, y se marcaron con yoduro de propidio antes de contar las células. Después de la tinción, las células se contaron en FACScalibur usando el software Pro Cellquest (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). fracciones del ciclo celular fueron analizados utilizando el software v3.0 Modfit.
In situ
hibridación de microARN
In situ
hibridación de miR-34b se realizado como se describe anteriormente [18]. Nucleolar U6 RNA se utilizó como control positivo.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 17.0 (SPSS, Chicago, IL). La supervivencia se calculó utilizando el método de Kaplan-Meier. La comparación de la supervivencia entre los diferentes grupos se determinó mediante la prueba de log-rank. Las diferencias en la expresión de microARN entre grupos se analizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. La correlación entre la sensibilidad a los fármacos y la expresión de microARN se analizó mediante la correlación de rangos de Spearman. Comparación de la sensibilidad a los fármacos de las células transfectadas con diversos oligonucleótidos se llevó a cabo por análisis de una vía de las varianzas (ANOVA de una vía). Todos los valores de p fueron de dos lados y valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos.
Apoyo a la Información
Figura S1.
expresión de microRNAs en SCLC frente en líneas celulares de cáncer. Un valor Ct delta de -15 indica que la expresión del microARN en la celda es demasiado bajo para ser detectado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s001 gratis (TIF)
figura S2.
In situ
hibridación de microRNAs en un tumor SCLC. Nucleolar U6 ARN y miR-34b se detectaron usando un sistema basado en tiramida biotinil con Vector NovaRed como sustrato (marrón). Las muestras para el control negativo scramble y miR-34b se co-teñidas con hematoxilina de Mayer (azul)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
Correlación de la expresión de p53 y (A) miR-34a, (B) miR-34b, y (C) miR-34c, y (D) la correlación de la expresión de miR-34a y Bcl-2. La expresión de p53 y Bcl-2 se presenta como porcentaje de células teñidas por inmunohistoquímica. El coeficiente de correlación (r) y el valor p se determinaron por el método de Spearman
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s003 gratis (TIF)
figura S4.
células NCI-H82 transfectadas con inhibidor de microARN (A) marcado con Cy3 y (B) marcado con Cy3 precursor de microARN.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s004 gratis (TIF)
Figura S5. ensayo de crecimiento celular Red de células NCI-H1299 NSCLC transfectadas con miR-34a o precursor de control. Las barras de error se refieren a las desviaciones estándar
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s005 gratis (TIF)
Figura S6. ensayo de inhibición
crecimiento de las células GLC4 tratados con cisplatino (A) y etopósido (B). Las células fueron transfectadas con los oligonucleótidos indicados. Las barras de error indican la desviación estándar de los ensayos por triplicado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s006 gratis (TIF)
Figura S7. La expresión de proteínas Red de c-MET y Bcl-2 en SCLC 5 y 3 líneas celulares de cáncer. (B) Correlación entre el miR-34a y la expresión de c-MET, así como Bcl-2 en 5 CEP líneas celulares.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s007 gratis (TIF)
Tabla S1.
microARNs y covariables clínicos.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s008 gratis (DOC) sobre Table S2.
Efecto de las covariables clínicos sobre la supervivencia libre de progresión (SLP).
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s009 gratis (DOC) sobre Table S3.
efecto de la expresión de microARN en la supervivencia libre de progresión (PFS, semanas) en pacientes con CPCP estratificados por enfermedad limitada o enfermedad extensa.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s010 gratis (DOC) sobre Table S4.
estado de TP53 y la expresión de miR-34a en líneas celulares de SCLC.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s011 gratis (DOC)
Materiales S1. líneas celulares de cáncer
.
doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s012 gratis (DOC)