Extracto
microseminoproteína-beta (MSMB,
MSMB
) es una proteína de secreción abundante aportado por la próstata, y está implicado como un cáncer de próstata (PC) biomarcador basado en observaciones de su menor expresión en células cancerosas en comparación con el epitelio de próstata benigna. Sin embargo, como la literatura actual sobre MSMB es inconsistente, se evaluó la expresión de MSMB en los niveles de proteína y mRNA en un amplio conjunto de diferentes etapas clínicas de la PC. La inmunohistoquímica utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales contra MSMB se utilizó para estudiar la expresión de proteínas en muestras de tejido que representa prostatectomías (n = 261) y en biopsias con aguja de diagnóstico de pacientes tratados con terapia de privación de andrógenos (ADT) (n = 100), y en la castración localmente recurrente PC -resistant (CRPC) (n = 105) y las metástasis CRPC (n = 113). Los niveles de transcripción de
MSMB
, receptores nucleares co-activador 4 (
NCOA4
) y
MSMB-NCOA4 sobre Fusion fueron examinados por QRT-PCR en muestras de prostatectomía y por ARN -sequencing en la hiperplasia prostática benigna, PC, y las muestras CRPC. También medimos los niveles MSMB suero y el genotipo de los polimorfismos de nucleótido único rs10993994 utilizando el ADN de la sangre de 369 pacientes y 903 controles de PC. MSMB expresión en PC (29% de las prostatectomías y el 21% de las biopsias con aguja) era más frecuente que en CRPC (9% de CRPCs de recidiva local y el 9% de las metástasis CRPC) (
p Hotel & lt; 0,0001). La detección de la proteína MSMB se correlacionó inversamente con la puntuación de Gleason en piezas de prostatectomía (
p = 0,024
). La lectura a través de
MSMB-NCOA4 Versión taquigráfica se detectó a niveles muy bajos en PC. MSMB niveles en suero fueron similares en los casos de PC y controles, pero se asociaron significativamente con el riesgo de PC cuando se ajusta por la edad al momento del diagnóstico y los niveles de PSA libre o total (
p Hotel & lt; 0,001). Los niveles séricos de MSMB en los pacientes y controles de PC se asociaron significativamente con el genotipo rs10993994 (
p Hotel & lt; 0,0001). En conclusión, la disminución de la expresión de MSMB es paralela a la evolución clínica de los niveles de PC y MSMB sérico ajustado están asociados con el riesgo de PC
Visto:. Sjöblom L, O Saramäki, Annala H, K Leinonen, Nättinen J, T Tolonen, et al. (2016) Expresión microseminoproteína-Beta en diferentes etapas del cáncer de próstata. PLoS ONE 11 (3): e0150241. doi: 10.1371 /journal.pone.0150241
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos |
Recibido: 30 Octubre, 2015; Aceptado: 2 Febrero de 2016; Publicado: 3 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Sjöblom et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. el trabajo fue apoyado por becas de la Agencia finlandesa de financiación para el programa de Tecnología y profesor distinguido de Innovación de Finlandia, la Academia de Finlandia, la Sociedad del cáncer de Finlandia, la Fundación Sigrid Juselius, el Fondo de Investigación médica del hospital Universitario de Tampere, el Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud (R01 CA160816, CA175491 R01); el Centro de Sidney Kimmel para los cánceres de próstata y urológicas; David H. Koch través de la Fundación del cáncer de próstata; el Instituto Nacional para la Investigación de la Salud (INDH) Programa de Investigación Biomédica Centro de Oxford; Centro de Oxford Cancer Research UK; la Sociedad Sueca del Cáncer (proyecto nº 14-0722.); y la Fundación Federico SA, así como por la Universidad de Tampere
Conflicto de intereses:. Hans Lilja tiene patentes de PSA libre (US 5.501.983), hK2 (Patente de Estados Unidos Nº US 5.614.372), y PSA intacto (patente de EE.UU. . Estados Unidos 7.872.104 B2) ensayos, y lleva el nombre de una solicitud de patente para un método estadístico para detectar el cáncer de próstata. Las patentes de ensayo y la solicitud de patente para el modelo estadístico se han autorizado y comercializado por OPKO y el Dr. Lilja cánones de las ventas de estas pruebas. El Dr. Lilja posee acciones en OPKO. Otros no revelan ninguna COIs.
Introducción
El cáncer de próstata (PC) es el segundo cáncer más común entre los hombres en todo el mundo [1]. Las mediciones de antígeno prostático específico (PSA) en la sangre son ampliamente utilizados para detectar los hombres en PC-riesgo y controlar los hombres con PC. Debido a la baja especificidad de ensayo a niveles moderadamente elevados, el uso indiscriminado de los resultados de pruebas de PSA en gran número de biopsias innecesarias y sobre-diagnóstico con el consiguiente riesgo de sobretratamiento [2,3]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de biomarcadores adicionales que pueden proporcionar una mayor especificidad para la detección temprana de formas agresivas y letales de la enfermedad.
microseminoproteína-beta (
MSMB
, MSMB también conocido como MSP, PSP94) es una de las tres proteínas más abundantes secretadas por la próstata, junto con PSA y la fosfatasa ácida prostática (PAP) [4]. Varios estudios han demostrado una mayor expresión MSMB en el tejido normal y benigna de próstata que en el tejido canceroso [4-7]. Las observaciones de más alta expresión MSMB en el tejido prostático benigno llevaron a algunos investigadores a sugerir que MSMB tiene un papel supresor tumoral en PC [8]. Los estudios funcionales
in vivo
y
in vitro
también sugieren un papel supresor tumoral para MSMB [9]. Los niveles de MSMB en el suero y en la orina también se han demostrado ser menor en los pacientes de PC que en los controles [10]. expresión MSMB positiva se ha informado a asociarse con un pronóstico favorable en biopsias con aguja [11] y la pérdida de tinción MSMB se ha demostrado que se asocia con el tiempo más corto para la recurrencia bioquímica en PC clínicamente localizado [7]. Por el contrario, el aumento de expresión MSMB en piezas de prostatectomía se ha sugerido que se asocia con resultados de la enfermedad desfavorables [12]. Por lo tanto, el significado pronóstico de la expresión MSMB en tejido de la próstata sigue siendo controvertido.
Se ha demostrado que el nivel sérico de MSMB está asociada con un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en rs10993994 en la región promotora de
MSMB
, el gen que codifica para MSMB [13,14]. El alelo T del SNP rs10993994 también se ha asociado con el riesgo de PC [15,16], que ha sido replicada en múltiples estudios [17-19]. Sin embargo, hay evidencia de una asociación entre los niveles bajos de MSMB en el suero y el aumento del riesgo de PC, independientemente del genotipo rs10993994 [20].
Los datos publicados sobre la regulación de los
MSMB
expresión andrógenos son inconsistentes. Algunos estudios han demostrado que la expresión MSMB es independiente de los andrógenos [21,22]. Sin embargo, Dahlman y co-autores [23] encontró que el
MSMB Versión taquigráfica y la proteína MSMB fueron tanto redujo significativamente después de la terapia de privación de andrógenos a corto plazo (ADT). Potenciador de zeste homólogo-2 (EZH2), un conocido silenciador epigenética de la expresión génica, se ha sugerido para silenciar
MSMB
expresión en PC avanzada [24]. EZH2 También se ha demostrado que se sobreexpresa en la fase tardía de la PC [25].
El
MSMB
gen se localiza en el cromosoma 10q11.2 [26]. Una transcripción de la fusión lectura a través de la combinación de
MSMB
con el gen adyacente receptor nuclear coactivador 4 (
NCOA4
) Recientemente se ha demostrado por Nacu et al. [27] y confirmado en el tejido PC y el tejido normal de la próstata por Lou et al. [28]. También informaron de que el
MSMB-NCOA4
gen de fusión incluye elementos de respuesta a andrógenos (ARE) lo que sugiere que el gen de fusión podría ser regulada por andrógenos.
NCOA4 (
aka
ARA70)
codifica una proteína de AR-asociado que aumenta la actividad transcripcional de AR en células de la próstata [29]. Se ha sugerido que
MSMB-NCOA4
fusión podría tener un papel en el PC debido a las importantes funciones de
MSMB
en el tejido de la próstata y de
NCOA4
como un potenciador de AR actividad [27].
Debido a los datos inconsistentes sobre la expresión tisular de MSMB /
MSMB
en la próstata hemos querido evaluar la expresión de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica (IHC) en cohortes completas de PC que representa la enfermedad hormona-naïve localizada y avanzada, así como resistente a la castración PC localmente recurrente (CRPC) y las metástasis CRPC. Además, los niveles de transcripción de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
fueron estudiados para evaluar la importancia de la transcripción de la fusión de lectura a través. Por último, los niveles séricos de MSMB, así como el genotipo rs10993994 se analizaron en una cohorte de pacientes y controles de PC.
Materiales y Métodos
muestras tumorales clínicas
prostatectomía, la biopsia con aguja y las muestras de tejido de recidiva local CRPC, así como las muestras de suero se obtuvieron a partir hospital Universitario de Tampere (TAUH). Las muestras se aplica el anonimato y se analizaron de forma anónima. El uso de las muestras recogidas de forma prospectiva fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Universitario de Tampere y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes. La aprobación para el uso de la colección retrospectiva de muestras de tejido sin el consentimiento informado se obtuvo de la Autoridad Nacional de Asuntos médico-legales de acuerdo con la legislación finlandesa. El uso de metástasis CRPC fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Medicina Johns Hopkins, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los sujetos. Todas las muestras utilizadas para IHC se fijan-formalina, muestras incluidas en parafina (FFPE). microarrays de tejidos (TMA) portaobjetos se crea a partir de la prostatectomía y muestras CRPC.
prostatectomías.
MSMB expresión se evaluó con IHC en 261 pacientes sometidos a prostatectomía. Las características de la cohorte se muestran en la Tabla S1. Las mismas piezas de prostatectomía han sido previamente analizadas para Ki-67 y EZH2 [25]. progresión de la enfermedad se definió de acuerdo con el nivel de PSA en la sangre, con la recurrencia bioquímica (BCR) se define como un nivel de PSA ≥ 0,5 ng /ml en sangre de dos juegos consecutivos.
muestras de biopsia de aguja.
La cohorte de biopsia con aguja consistió en 99 biopsias con aguja de diagnóstico de los pacientes que posteriormente recibieron ADT primario. La puntuación de Gleason y el tratamiento de información se presentan en la Tabla S2. Las mismas muestras de orina se han analizado para Ki-67- y EZH2-inmunohistoquímica [30]. progresión de la enfermedad fue definida por los niveles de PSA en la sangre de dos empates consecutivos siendo el 25% por encima del punto más bajo con un aumento absoluto de ≥ 2 ng /ml por encima del nadir o el desarrollo de nuevas metástasis [30,31].
muestras CRPC localmente recurrente .
la resección transuretral de la próstata (RTUP) muestras de 105 hombres con evidencia de progresión de la enfermedad durante el ADT. Información sobre el tratamiento se muestra en la Tabla S2.
metástasis CRPC.
Ciento trece metástasis CRPC se obtuvieron de 32 pacientes que murieron de CRPC y se sometieron a autopsia rápida. Todos los pacientes habían sido tratados con ADT. Las mismas metástasis también han sido analizados para Ki-67 y EZH2 [25].
prostatectomía cohorte de QRT-PCR análisis.
Setenta y seis piezas de prostatectomía recién congelados que contienen un mínimo de 70% se utilizaron células cancerosas para el análisis de QRT-PCR. Las características de la cohorte se presentan en la Tabla S1. TRI-reactivo (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, EE.UU.) se utilizó para aislar el ARN total de las muestras clínicas recién congelados y líneas celulares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
ARN-secuenciación de cohortes.
los datos del material tumoral recién congelado del 12 hiperplasia prostática benigna (HPB) muestras, 28 muestras de hormonas ingenuo de prostatectomía y 13 CRPCs [32], así como 301 muestras, incluyendo 251 muestras cancerosas y 45 muestras de tejidos normales adyacentes de la Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) - cohorte, se utilizaron para evaluar los niveles de expresión de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
la inmunohistoquímica.
Todos los FFPE-muestras se tiñeron con un anticuerpo monoclonal MSMB (ab19070; Abcam, Cambridge, Reino Unido), y el prostatectomy- y CRPC-muestras también se tiñeron con un anticuerpo policlonal MSMB (4) .Para la tinción , Power Vision
+ kit de poli-HRP IHC (inmunológicas, AD, Duiven, Países Bajos) fue utilizado según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras fueron desparafinados primero y tratados térmicamente en un pH de 6 citrato trisódico-tampón, que contenía 0,05% de Tween. Las secciones se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario diluido. Para el anticuerpo MSMB comercial derivado de ratón, las muestras fueron bloqueadas en solución post-bloqueo y luego se incubaron con poli-HRP-solución. Sistema de detección de UltraVision (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.) se utilizó para la visualización del anticuerpo primario ligado. Control negativo sin el anticuerpo primario se incluye en todas las coloraciones. Las láminas fueron escaneados con un escáner Aperio ScanScope XT (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, EE.UU.). La puntuación se lleva a cabo de una manera ciega usando un microscopio virtual (http://jvsmicroscope.uta.fi). Se evaluó la intensidad y el porcentaje de la zona del tumor manchada. La expresión de MSMB se considera alta cuando el 20% o más del tejido tumoral estaba manchada con una intensidad de al menos 1 en una escala de intensidad de 0-3. Los valores medios de Ki-67 definen baja y alta expresión de Ki-67. expresión EZH2 se definió como alto cuando & gt; 50% de las células tumorales se tiñeron
QRT-PCR para
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4. Opiniones y secuenciación de los
MSMB-NCOA4
el ensayo SYBR Green (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE.UU.) se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante para detectar la expresión del ARNm niveles de
MSMB
,
NCOA4
y el
MSMB-NCOA4 sobre fusion. Las secuencias para los cebadores se obtuvieron de Lou et al. [28]. ciclos térmicos fueron los siguientes:.. 95 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 10 s, temperatura de hibridación de 59 ° C (por
MSMB
), 62 ° C (por
NCOA4
) y 59,5 ° C (por
MSMB-NCOA4
) durante 30 segundos. y 72 ° C durante 20 seg. El gen que codifica la caja TATA-proteína de unión (
TBP
) se utilizó para la normalización. Finalmente, -productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 1% para confirmar la especificidad de la reacción. El
MSMB-NCOA4
producto de fusión se secuenció para confirmar la presencia de la fusión. Para la secuenciación, -productos de PCR se extrajeron del gel y se purificaron con un kit QIAquick (QIAGEN Inc., Valencia, CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Purificado producto de PCR fue clonado utilizando un kit de clonación TOPO-TA (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Un kit de secuenciación BigDye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) se utilizó para las reacciones de secuenciación. En los análisis de los datos, los valores medios fueron utilizados como un límite entre la alta y la baja expresión de los niveles de mRNA de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
.
genotipificación el rs10993994 SNP en el ADN de la línea germinal y la medición de los niveles séricos MSMB
la medición de los niveles séricos MSMB y genotipado de rs10993994 se realizaron a partir de 369 pacientes con CP y 903 adultos varones de igual edad (± dos años) sujetos de control referidos al Departamento de Urología, sin evidencia de PC. Las características de los casos se presentan en la Tabla S3. El rs10993994 SNP se genotipo de las muestras de ADN utilizando el sistema en el Instituto de Medicina Molecular de Finlandia (FIMM) Sequenom MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, EE.UU.). mediciones de inmunoensayo de MSMB se llevaron a cabo en el sistema de inmunoensayo automático AutoDELFIA 1235 (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.) en el laboratorio del Dr. Lilja en los Laboratorios de Investigación Wallenberg, Departamento de Medicina traslacional, Universidad de Lund, Hospital Universitario de Skåne, Malmö, Suecia, como se ha descrito anteriormente [20,33,34]. PSA libre y total se midió utilizando el doble de etiqueta total de DELFIA Prostatus /PSA libre-ensayo (PerkinElmer, Turku, Finlandia) [35], calibrado frente a la OMS 96/670 (PSA-OMS) y la OMS 68/668 (PSA-libre OMS) estándares. Todas las mediciones de ensayos se realizaron con muestras ciegas al resultado.
Los análisis estadísticos
La prueba exacta de Fisher, la prueba de Chi-cuadrado, la prueba de Mann-Whitney U-test y prueba t no pareada se utilizaron para analizar la asociación entre MSMB,
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
expresión y diferentes variables clínico-patológicas y de expresión. pruebas t pareadas se utilizaron para analizar las diferencias entre los niveles de expresión de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión para analizar la importancia pronóstica de la expresión MSMB en diferentes cohortes con la prueba de Mantel-Cox. La prueba exacta de Fisher y el test de Kappa se aplicaron cuando se comparan los resultados obtenidos utilizando el anticuerpo MSMB comercial y los obtenidos con nuestro anticuerpo policlonal MSMB. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para comparar los niveles séricos de PSA y MSMB entre los pacientes y los controles de PC. Los datos se analizaron con el análisis de covarianza (ANCOVA) para examinar la asociación de los niveles de PC y MSMB suero, ajustado por edad al momento del diagnóstico y el PSA libre o PSA total. Ambas variables MSMB y PSA fueron transformados log. Se realizó un análisis de regresión logística, también con SPSS, para estudiar la asociación entre el riesgo a nivel de MSMB suero y PC indicada por la puntuación de Gleason y el estadio de PC. correlación de Spearman se utilizó para estudiar la correlación entre los niveles de PSA libre, total y libre total y el nivel MSMB en la sangre de los pacientes y controles. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para analizar las asociaciones entre el nivel MSMB suero y el genotipo del SNP rs10993994. correlación de Spearman se utilizó para analizar la correlación entre el nivel sérico MSMB y la edad al momento del diagnóstico.
Resultados
Comparación de los anticuerpos monoclonales y policlonales MSMB
muestras CRPC
prostatectomía y localmente recurrente se tiñeron tanto con un anticuerpo policlonal de conejo MSMB como se describe por Abrahamsson et al. [4] y un anticuerpo monoclonal comercial MSMB (ab19070, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Tanto intensidad de la tinción y el área de tejido canceroso se evaluaron en la puntuación con la expresión MSMB definida como positiva cuando 20% o más del área del tumor tenía intensidad de la tinción de 1 a 3. Los resultados de la tinción con el anticuerpo monoclonal y los anticuerpos policlonales fueron similares. El ochenta por ciento de las muestras de prostatectomía se manifiestan bajo nivel de expresión MSMB teñidas con el anticuerpo policlonal MSMB también mostró expresión MSMB nivel bajo cuando se tiñen con el anticuerpo monoclonal (κ = 0,559,
p Hotel & lt; 0,0001; Tabla 1). En las muestras CRPC, los resultados de la tinción fueron aún más consistente entre anticuerpos policlonales y monoclonales (MSMB kappa = 0,77,
p
& lt; 0,0001; Tabla 1). Debido a la naturaleza consistente de la tinción, todas las demás muestras se tiñeron solamente con el anticuerpo monoclonal.
prostatectomía y muestras CRPC localmente recurrentes se tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo MSMB (33) y un anticuerpo monoclonal MSMB comercial ( ab19070, Abcam, Cambridge, Reino Unido).
piezas de prostatectomía
MSMB se expresó de forma heterogénea en el citoplasma del epitelio maligno de próstata con diferencias de intensidad distintos observados en las glándulas tumorales separadas de la misma muestra. glándulas benignas comúnmente se tiñeron con alta intensidad, mientras que las glándulas cancerosas sólo en raras ocasiones mostraron una alta intensidad de tinción y la expresión MSMB era comúnmente bajo (figura 1). MSMB se expresó en un nivel alto en el 29% (75/261) del tejido canceroso en piezas de prostatectomía. lesiones cancerosas tenían intensidad de la tinción de 0 en el 89% (166/186) de los pacientes sometidos a prostatectomía, que se definió como bajo nivel de expresión de MSMB. MSMB expresión tiende a estar asociado inversamente con la puntuación de Gleason, pero no con el grado de Gleason (
p = 0,0544
y 0,1669, respectivamente, Tabla 2). se observó expresión alta MSMB en 52/178 casos (29%) de las muestras de pT2 y 21/82 casos (26%) en las muestras de pT3 (Tabla 2). No hubo asociación entre la expresión de PSA y MSMB de diagnóstico o los niveles de expresión entre MSMB y edad (
p = 0,8248
; 0,2563, respectivamente; Tabla 2).
(A) de alta, media y baja tinción MSMB en el tejido prostático normal. (B) de alta, media y baja tinción MSMB en el tejido de cáncer de próstata.
Estos resultados se basan en IHC-análisis de diferentes cohortes.
A pesar de que no hubo significativa asociación entre la expresión y la expresión MSMB EZH2, la expresión EZH2 tendió a ser mayor en las muestras que expresan bajos niveles de MSMB (
p
= 0,1040; Tabla 2). No hubo asociación entre la expresión de MSMB y la expresión del marcador de proliferación Ki-67 (
p = 0,2208
; Tabla 2) o con el tiempo hasta la recurrencia bioquímica (
p = 0,8997
; S1 figura ).
muestras de biopsia de aguja
las secciones de tejido de las muestras de biopsia con aguja de diagnóstico representan una cohorte de pacientes de mayor edad y /o una enfermedad más avanzada al momento del diagnóstico de la cohorte de prostatectomía y que recibieron ADT primario. Veintiuno de los 99 (21%) de las muestras de biopsia expresaron MSMB en un nivel alto (Tabla 2), con ninguna asociación entre la expresión MSMB y la puntuación de Gleason o T-etapa (
p = 0,7869
; 0,8097, respectivamente; Tabla 2). Del mismo modo, no hubo asociación entre la expresión MSMB y la expresión de la EZH2 o Ki-67 (
p = 0,4849
y 0,4055, respectivamente; Tabla 2). Además, los casos con alta en comparación con baja expresión MSMB no mostraron ninguna diferencia en el tiempo hasta la progresión bioquímica mediante el análisis de Kaplan-Meier (
p = 0,5621
; S1 figura).
especímenes CRPC localmente recurrente
expresión MSMB fue alta en sólo el 9% (9/105) de las muestras CRPC de recidiva local (Tabla 2), con ninguna asociación entre la expresión de MSMB y EZH2 o Ki-67 expresión (
p
= 0,1024; 0,1545, respectivamente;. Tabla 2)
se observó metástasis CRPC
la expresión de alto MSMB en el 9% de los casos (3/32) (Tabla 2). Uno de estos tres pacientes tenían una expresión de alto MSMB en 1 de 2 de sus metástasis. Otro paciente tuvo expresión MSMB alta en 3 de 5 de las metástasis, y la tercera paciente en 3 de 4 de las metástasis. MSMB se expresó a un alto nivel en 6% (7/112) de todas las metástasis (Tabla 2). MSMB expresión no se asoció con la expresión de Ki67 o con EZH2 (
p = 0,2412
y 0,3295, respectivamente; Tabla 2).
MSMB
,
NCOA4 Opiniones y
MSMB-NCOA4 sobre fusion
En primer lugar, las transcripciones de
MSMB
,
NCOA4
y la fusión de
MSMB-NCOA4
fueron medidos mediante qRT-PCR en ARN aislado de tejido canceroso en una cohorte de pacientes con PC clínicamente localizado tratados con prostatectomía (n = 76). Los datos tenían una distribución no gaussiana, con la mayoría de las muestras que muestran
MSMB
expresión inferior a la media y sólo el 25% (19/76) de las muestras que se manifiestan MSMB-expresión por encima del promedio.
NCOA4
se expresó en un nivel alto en el 41% (31/76) de las muestras y los altos niveles de
MSMB-NCOA4 sobre Fusion se encontró en el 32% (23/73) de la muestras (Tabla 3). La expresión de
MSMB-NCOA4
transcripciones de fusión se correlacionó con la expresión de
MSMB gratis (Pearson r = 0,5092,
p Hotel & lt; 0,0001; Figura 2).
MSMB
expresión tiende a ser menor en mayor grado del tumor, pero los niveles de expresión de
MSMB
,
NCOA4
, y el
MSMB-NCOA4 sobre Fusion transcripción no se asociaron significativamente con la puntuación de Gleason (
p = 0,0913
; 0,2577; 0,1963 y, respectivamente), pT-etapa (
p = 0,2760
; 0,4819 y 1,000, respectivamente; Tabla 3), o el tiempo hasta la recurrencia bioquímica (
p = 0,3862
; 0,4126; 0,5940 y, respectivamente;. S2 figura)
MSMB
expresión se correlacionó positivamente con la expresión de
MSMB-NCOA4
.
Estos resultados se basan en Q-RT-PCR análisis. Medio de los valores normalizados se utilizaron como punto de corte entre la alta y la baja expresión de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
. La edad se refiere a la edad al momento del diagnóstico.
En segundo lugar, la detección de
MSMB
,
NCOA4
y
MSMB-NCOA4
transcripciones de fusión se evaluó usando RNA-seq en dos cohortes; una que contiene 12 BPH, 28 hormona-naïve PC, y 13 muestras CRPC [32], así como un segundo TCGA-cohorte consta de 301 tumores de adenocarcinoma de próstata. En general, la expresión de
MSMB-NCOA4
fue baja y no se observó expresión con mayor frecuencia en PC que en el tejido BPH, aunque se detectaron niveles bajos de expresión en 2 de las 12 muestras de BPH (Figura 3). En el ejemplo que expresa
MSMB-NCOA4
al más alto nivel, sólo el 2,2% de las transcripciones a partir de la
MSMB
promotor formó una transcripción con
NCOA4 gratis (figura 3B ).
NCOA4
se expresó en un nivel significativamente menor que
MSMB Hoteles en ambas cohortes (Figura 3) y S3 Fig.
(A)
MSMB
era expresado en el nivel más alto que
NCOA4
. El panel (b) inferior muestra el porcentaje de la
MSMB-NCOA4
lecturas del total lee de
MSMB
y
MSMB-NCOA4
.
NCOA4
se expresó en el nivel más bajo que
MSMB
. La parte de expresión de gen de fusión fue de 2,2% a más alto, de la suma de MSMB y MSMB-NCOA4 lee. Eje Y representa recuento de lecturas normalizadas.
Los niveles séricos de MSMB y SNP rs10993994
No hubo correlación significativa entre los niveles MSMB en el suero y la edad al momento del diagnóstico de los pacientes con CP (Spearman r = 0,1550) o al momento de la extracción de sangre entre los controles (Spearman r = 0,1876; S4 figura). En los casos de PC, el nivel medio de MSMB en el suero (23,0 ng /ml; rango intercuartil (IQR) 15.9) no fue diferente (
p = 0,2422
) de que en los controles (21,8 ng /ml; IQR 15.3 ; Tabla 4). Sin embargo, cuando se ajustaron por edad y PSA libre o total al momento del diagnóstico, hubo una asociación significativa entre el riesgo de PC y los niveles séricos de MSMB en el análisis de covarianza (
p Hotel & lt; 0,001; Tabla 5). niveles MSMB fueron mayores en los controles (la media del nivel MSMB fue de 29,7 ng /ml cuando se ajustaron por edad y PSA total en el diagnóstico y 29,2 ng /ml cuando se ajustaron por edad y PSA libre al momento del diagnóstico) en comparación con los pacientes con CP (la media del nivel MSMB era 21.1 ng /ml cuando se ajustaron por edad y PSA total en el diagnóstico y 22,4 ng /ml cuando se ajustó por edad y PSA libre al momento del diagnóstico) (Tabla 5). Además, el nivel MSMB suero se asoció con el riesgo indicado por la puntuación de Gleason y el estadio clínico al momento del diagnóstico (Tabla S4), con la asociación restante significativo de los casos no metastásicos o metastásicos solos. Además, los pacientes tenían una relación de PC significativamente inferior libre /PSA total en comparación con los controles (
p Hotel & lt; 0,0001; Tabla 4). Hubo una diferencia estadísticamente significativa aunque débil correlación positiva entre los niveles de MSMB y PSA libre, así como entre MSMB y PSA total en el suero de los casos de cáncer (Spearman r = 0,3990 y 0,3200, respectivamente) y en los controles (Spearman r = 0.3421 y 0.2710, respectivamente),
p Hotel & lt; 0,0001 en todos (S5 figura), y la asociación significativa entre la proporción de PSA libre-a-total y los niveles séricos de MSMB en los casos y controles (Spearman r = 0,2142; r = 0,1351, respectivamente),
p
. & lt; 0,0001 en todos (S5 figura)
Entre los pacientes con CP, los niveles en suero MSMB no se asociaron con la puntuación de Gleason en la prostatectomía o muestras de biopsia (
p = 0,6621
; 0,819, respectivamente; Tabla 6), pero los niveles séricos de MSMB y pT-etapa (
p = 0,0288
) y la edad al momento del diagnóstico (
p = 0,0452
) tiende a estar asociado débilmente en los casos de prostatectomía (Tabla 6). El análisis de Kaplan-Meier mostró ninguna asociación entre el nivel MSMB suero y tiempo hasta la recurrencia bioquímica en los pacientes tratados con prostatectomía o radioterapia (
p = 0,1396
; 0,1925, respectivamente; S6 figura) o en pacientes tratados con hormonas (
p = 0,2070
;. S6 figura) guía empresas
Por el contrario, hubo una muy fuerte asociación entre los niveles MSMB bajas en el suero y el genotipo TT riesgo de que el SNP rs10993994 de ambos casos de cáncer y controles (
p
& lt; 0,0001; 0,0001, respectivamente; figura 4). Sin embargo, el rs10993994 SNP no se asoció con puntuación de Gleason en muestras de biopsia o prostatectomía o con PT-etapa en la prostatectomía (
p = 0,7959
; 0,4683; 0,3584, respectivamente; Tabla 7). Aunque la frecuencia del genotipo TT tiende a ser ligeramente más alta en los casos de cáncer (15%) en comparación con los controles (12%), no hubo asociación del genotipo rs10993994 y el riesgo de cáncer en esta cohorte (
p = 0,5114
; Tabla 7)
El genotipo de SNP rs10993994 nivel y MSMB en la sangre de los pacientes con CP) (a y controles (B).. MSMB nivel más bajo se asoció con alelo T del SNP rs10993994. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los diferentes grupos. Las líneas representan el nivel MSMB media de los diferentes genotipos. *** denota
p
. & lt; 0,0001
Discusión
En el presente trabajo se estudió el papel potencial de MSMB /
MSMB
/
MSMB-NCOA4
como biomarcadores de PC en las cohortes correspondientes a diferentes etapas de la PC de pronto para la enfermedad avanzada. Hemos demostrado que la expresión MSMB se reduce en PC más avanzado, siendo más bajo en el CRPC. Los bajos niveles de proteína MSMB en CRPC fueron consistentes con nuestros datos de RNA-seq indica una baja
MSMB
niveles de transcripción en el CRPC comparación con las muestras de PC. El hallazgo de la disminución de la expresión de MSMB /
MSMB Hoteles en PC en comparación con el de próstata no maligno, así como la asociación de la pérdida de expresión con una enfermedad más avanzada y de mayor puntuación de Gleason-, es consistente con varias publicaciones anteriores [5-7]. Sin embargo, los casos CRPC no se han estudiado a fondo antes. Dahlman et al., [23] estudió la expresión MSMB en 3 metástasis CRPC y encontró
MSMB
bajos niveles de transcripción. Aquí, mostramos que ambos niveles de transcripción y proteínas MSMB son bajos en CRPC con sólo el 9% de los casos CRPC que expresan MSMB.
En nuestro estudio, la proteína MSMB o los niveles de ARNm no se asociaron con el pronóstico en la prostatectomía o ADT - los pacientes tratados. Algunas publicaciones anteriores han demostrado una asociación entre el bajo MSMB y mal pronóstico en PC [7,11], mientras que otros demostraron alta MSMB o
MSMB
niveles de transcripción y de mal pronóstico [12,36]. Puede haber varias razones para los resultados discordantes. cohortes de pacientes varían. En este caso, hemos utilizado tres cohortes: (a) una cohorte prostatectomía de 261 casos con un seguimiento medio de 7,3 años, (b) una cohorte prostatectomía de 76 casos con un seguimiento medio de 5,2 años y (c) una cohorte principalmente de los pacientes tratados con ADT con un seguimiento medio de 3,6 años. Cohortes A y C se utilizan para la detección inmunohistoquímica de la proteína MSMB y la cohorte B para la medición de QRT-PCR de
MSMB Versión taquigráfica. Consistentemente, ninguna de las cohortes demostró valor pronóstico para MSMB /
MSMB
. Una variable putativo es el anticuerpo utilizado para la inmunotinción. Hemos probado dos anticuerpos utilizados comúnmente, un anticuerpo monoclonal y uno policlonal. Dieron patrones de tinción altamente concordantes. Por lo tanto, los anticuerpos no son la causa probable de los datos discrepantes.
Una transcripción de la fusión de lectura a través de
NCOA4
y
MSMB
recientemente se ha demostrado en algunos cánceres de próstata [27,28]. Por lo tanto, el objetivo fue medir la expresión de la transcripción de fusión en muestras clínicas.