Extracto
Antecedentes
El polimorfismo de los genes que codifican las enzimas metabolizadoras de fármacos se sabe que juega un papel importante en el aumento de la susceptibilidad de cáncer colorrectal. UGT1A locus del gen se ha sugerido para definir la actividad de glucuronidación de tejidos específicos. Capacidad reducida de glucuronidación se correlaciona con el desarrollo del cáncer colorrectal. Por lo tanto, hemos tratado de explorar el polimorfismo del gen UGTlA en el cáncer colorrectal humano.
Métodos
tejidos cancerosos y sanos se obtuvieron de selectedpatients. Las muestras de sangre se recogieron y se analizaron las transcripciones de ARNm UGTlA. Se preparó ADN genómico y se amplificaron UGTlA8 exón-1 secuencias, visualiza y se purificó. El ADN extraído se subclonó y secuenció. Dos de cola prueba exacta de Fisher, los odds ratios (OR), intervalo de confianza (IC) y análisis de regresión logística se utilizaron para el análisis estadístico.
Resultados
UGTlA expresión de ARNm se redujo en los tejidos cancerosos compararon con los tejidos sanos de la misma paciente. La expresión de ARNm UGTlA de tejido sano en los pacientes del estudio fue menor que en el control. La expresión del ARNm de tejido canceroso se había reducido regulado en UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A9 y hasta reguladas en UGTlA8 y UGTlAl0 UGT1A5 y UGT1A7 no se expresan en el tejido del colon de ninguno de los grupos. La frecuencia del alelo WT UGTlA8 * 1 fue mayor (p = 0,000), la frecuencia de UGTlA8 * 3 se redujo en el grupo control (p = 0,000). La expresión de UGTlA8 homocigóticos * 1 fue mayor en el grupo control (p = 0,000). Mayor frecuencia de heterocigotos tanto UGTlA8 * 1 /* 3 y UGTlA8 * 2 /* 3 fueron encontrados en el grupo de estudio (p = 0,000; p = 0,000). La aparición de cáncer colorrectal se relaciona principalmente con la presencia de polimorfos UGTlA8 * 3 alelos (p = 0,000).
Conclusión
La regulación de los genes humanos UGT1A es específica de tejido. La variación individual en las expresiones polimórficas de UGTlA locus del gen se observó en todos los tipos de tejido del colon probado, mientras que la expresión tejido hepático fue uniforme. La alta incidencia de UGTlA8 polimorfismo existe en pacientes con cáncer colorrectal. UGTlA8 * 1 alelo es un factor protector y UGTlA8 * 3 alelo es un factor de riesgo
Visto:. Wang M, Sol D-M, Wang S, Qing Y, Chen S, Wu D, et al. (2013) Expresión polimórfica de la UDP-glucuronosyltransferase UGTlA génica en cáncer colorrectal humano. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10.1371 /journal.pone.0057045
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 16 de diciembre de 2012; Aceptado 16 de enero de 2013; Publicado: 27 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Ciencia y Tecnología Proyecto clave de la provincia de Shandong (No.2006GG3202050), Ciencia Fondos de bonificación para jóvenes científicos de la provincia de Shandong (NO.2007BS03017, hay un vínculo URL), y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (No.Y2008C115, ningún vínculo URL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal es uno de los tipos más comunes de cáncer en todo el mundo. Con base en datos de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), el cáncer colorrectal para el 9,4% de todos los
de novo
cánceres diagnóstico en 2007.Compare a las figuras en el año 2000, recién diagnosticados de cáncer colorrectal en 2007 había aumentado en un 27%, y la tasa de mortalidad ha aumentado en un 28%; lo que representa un aumento anual del 3,9% y 4,0%, respectivamente [1].
A pesar de que la etiología del cáncer colorrectal no se entiende completamente, el polimorfismo de los genes que codifican las enzimas metabolizadoras de fármacos se sabe que juega un papel importante en aumento de la susceptibilidad de cáncer de colon [2]. Un gran número de enzimas están involucradas en la fase I y fase II vías metabólicas, incluyendo miembros del citocromo P450 (P450) y UDP-glucuronosyltransferase (UGT) Superfamilias. UGTs catalizan la reacción glucuronidación, que es importante para el metabolismo de xenobióticos. Glucuronidación permite la utilización de ciertos nutrientes, así como la desintoxicación y excreción de los metabolitos y compuestos potencialmente dañinos, como los esteroides, bilirrubinas, drogas exógenas, productos químicos tóxicos y sustancias mutagénicas [3]. Más de 50 tipos de UGTs habían sido identificados en muchos órganos y tejidos de los animales y los humanos, incluyendo el hígado, mucosa intestinal, pulmones, cerebro, placenta y el útero [4] - [8]. UGTs humanos se han dividido en el UGT1, 2, 3 y 8 familias multigénicas basado en la divergencia evolutiva [4]. Hasta la fecha, 21 diferentes UGT [9] se han encontrado en los seres humanos. El locus del gen UGT1A humano está localizado en el cromosoma II. Se compone de trece diferentes primeros exones en el extremo 5 'unido, por corte y empalme alternativo, a cuatro exones comunes diferentes en el extremo 3'. UGT1A locus del gen codifica al menos nueve proteínas funcionales (UGT1A1, UGT1A3-UGT1A10) y cuatro pseudogenes (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].
Expresión específica de tejido del locus del gen UGT1A ha sido bien caracterizado. El gen se ha sugerido para definir la actividad de glucuronidación específica de tejido en el sistema digestivo humano. UGT1A proteínas hepáticas (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A9 y) han sido estudiados e identificados en detalle. Los estudios que examinan el tracto gastrointestinal humano han llevado a la identificación de tres transcripciones extrahepáticas UGT1A: UGT1A7, UGT1A8 y UGT1A10 [11], [12]. El uso de la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), una menor expresión de genes de UGT1A8 se observó en el esófago [13]. Un estudio más amplio no mostró ARN UGT1A8 detectable en el intestino delgado pero abundantes niveles de mRNA UGT1A8 en el intestino grueso [12]. En la actualidad, los datos sobre la expresión de UGT1A8 en el hígado o cualquier otro tejido humano ha sido escasa. La expresión selectiva de UGT1A8 en el colon podría indicar que UGT1A8 juega un papel importante en la homeostasis celular y la disposición de compuestos endógenos y exógenos. Se informó de que la proteína UGT1A8 catalizan la glucuronidación humana de cumarinas, compuestos fenólicos, antraquinonas, flavonoides y una serie de esteroides, en células transfectadas de riñón embrionario humano 293 (HEK293) [14]. Considere el hecho de que el colon contiene una cantidad considerable de proteínas UGT1A [12], una capacidad reducida de glucuronidating sustancias específicas podría ser perjudicial para el equilibrio homeostático del colon
.
Durante los últimos años, los datos de secuenciación y genotipado tenían conducido al descubrimiento de más de 100 variantes dentro de las regiones promotora y la secuencia codificante de los genes UGT1A. Notablemente, muchas de las variantes exhiben frecuencias de los alelos de hasta 40 a 50% en la población general, que se encuentran en desequilibrio de ligamiento. Sin embargo, algunas variantes son de suficiente frecuencia en la población general que se clasifica como polimorfismos [15], [16]. El polimorfismo está mejor representado por el gen UGT1A1, que se sabe que contiene 113 genotipos variante alélicas de UGT1A1 (UGT1A1 * 1-UGT1A1 * 113). Muchos de los genes UGT1A1 exhiben altas frecuencias de los alelos [17], [18]. polimorfismo genético también había sido encontrado en UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], y UGT1A9 [29]. El polimorfismo conduce a diferentes grados de la transcripción, así como alteraciones funcionales, que pueden disminuir la actividad de UGT y los resultados en la patología de los individuos afectados. El análisis de un estudio de casos y controles reveló aumento de riesgo de desarrollar cáncer colorrectal (CCR) en individuos portadores de UGT1A1 * 6 y UGT1A7 * 3 variantes [30]. El análisis de los polimorfismos genéticos de los genes UGT1A3 (UGT1A3 * 2, UGT1A3 * 3) mostró que no sólo el nivel de actividad de la proteína UGT1A3 expresado había cambiado pero la especificidad para diferentes sustratos se vio afectada así como [20]. Los numerosos estudios se han realizado sobre las variantes de genes UGT1A7. Con su bajo carcinógeno metabolización de la actividad, el gen UGT1A7 es un factor de riesgo para el carcinoma hepatocelular desarrollo (HCC) en, chino (OR = 3,06) [31], francés (OR = 3,4) [32], japonés (OR = 2,33) [33 ], y los coreanos (OR = 1,45) [34]. Además, UGT1A4 * 2 y UGT1A4 * 3 también se consideró como un factor de riesgo para el CHC en un estudio de asociación alélica [21].
La eficiencia catalítica de UGT1A8 * 3 (C277Y) y UGT1A9 * 3 (M33T ) allozyme hacia el ácido micofenólico se disminuyó drásticamente [29]. variación de alelos en uno de los muchos loci UGT puede lleva a alteraciones bioquímicas importantes en el potencial de la metabolización de fármacos. Esas enzimas UGT se conocen para degradar los carcinógenos; una falta de función puede desempeñar un papel importante en la etiología de un episodio carcinogénico como el cáncer colorrectal.
Para lograr una mejor comprensión del papel de UGT1A en el tracto gastrointestinal, el estudio actual se ha centrado en UGT1A8 en el tracto gastrointestinal. Sobre la base de los informes anteriores [35], nos dimos cuenta de los cambios de expresión y función de UGT1A8 podría ser un factor de riesgo de cáncer colorrectal. En este estudio, se examinó la expresión de genes polimórficos UGT1A. Hemos probado el genotipo de UGTlA8 en pacientes con cáncer colorrectal y exploramos la relación entre el polimorfismo de los genes UGTlA8 y el cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
2.1 El material clínico
(1) En grupo de cáncer colorrectal, 150 pacientes (90 mujeres y 60 hombres, con una edad media de 56,8 ± 11,3 años), fueron seleccionados en nuestro Departamento de Cirugía general, hospital Qilu, la Universidad de Shandong, provincia de Shandong, china. Estos pacientes fueron seleccionados de acuerdo a la norma de Amsterdam II [36], lo que impide el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) y la poliposis adenomatosa familiar (PAF). La elegibilidad se determina si el diagnóstico primario ocurrió hasta seis meses anteriores a la inclusión en el estudio, con el diagnóstico final confirmada a través del Departamento de Patología.
Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia, radioterapia o terapia biológica antes de la recogida de muestras. 120 sujetos normales (48 mujeres y 72 hombres, con una edad media de 57,2 ± 11,9 años), fueron seleccionados a partir Departamento de Gastroenterología intervencionista en el Hospital Qilu, la Universidad de Shandong. 72 muestras normales de tejido hepático de voluntarios (30 mujeres y 42 hombres, con una edad media de 56,5 ± 10,2 años) se obtuvieron a través del Departamento de Cirugía General, Hospital Qilu de la Universidad de Shandong. marcadores de serie del virus de la hepatitis sérica fueron negativos en estos 72 sujetos. Diez sujetos fueron remitidos para hemangioma hepático y catorce fueron remitidos para quiste hepático. Revisión de los registros médicos en todas las materias antes mencionadas indicó la ausencia de comportamientos crónicos que consumen drogas, así como la ausencia de tabaquismo y el alcoholismo. Se tomaron medidas de normalización de ejemplo adicional, incluyendo dejar de fumar 6 meses anteriores a la recogida de muestras de tejido, y el ayuno al menos 12 horas antes de los procedimientos quirúrgicos y la recogida de tejidos.
(2) 327 pacientes (123 mujeres y 204 hombres , con una edad media de 56,4 ± 11,0 años) con cáncer colorrectal fueron seleccionados en el Departamento de Cirugía general y del Departamento de Gastroenterología, hospital Qilu, la Universidad de Shandong. Estos pacientes fueron seleccionados en base a los estándares de criterios de Amsterdam II como antes [36]. En el grupo de control, había 327 voluntarios de la misma con el género (edad media de 54,2 ± 10,3 años). En promedio, los voluntarios eran dos años más jóvenes que los pacientes con cáncer colorrectal (p & lt; 0,05). Todos los sujetos eran gente de Han procedentes de la zona común de la provincia de Shandong en China, sin relación consanguinous. Los cuestionarios fueron administrados por enfermeras especialmente entrenados para estudiar materias en persona. El cuestionario recoge información sobre los factores de estilo de vida como la actividad física; alcohol y el tabaco de uso; , La familia y la historia médica de trabajo; y el uso de medicamentos de venta libre. Además, con el fin de preservar los archivos epidemiológicos y evaluar la exposición individual a los carcinógenos de la dieta, se utilizó un cuestionario detallado para medir la ingesta dietética promedio de un año antes del diagnóstico de cáncer colorrectal, o un año antes de la fecha de la selección de los controles. No hubo otras diferencias significativas (por ejemplo, por la edad, antecedentes familiares de cáncer colorrectal, el tabaquismo, el consumo total de carne, nivel de educación o ingresos) entre personas que proporcionaron muestras de sangre y la población en general. Se obtuvo el consentimiento informado y el estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Shandong.
2.2 Las muestras de tejido y reactivos
(1) En el grupo de cáncer colorrectal, 150 pares de muestras (1 cm × 1 cm x 1 cm) se cosecharon por los cirujanos que operan a partir de 150 pacientes con cáncer colorrectal durante colectomía parcial. Las muestras se enfriaron a continuación en solución salina C 0 °. Cada pares de muestra estuvo constituida por tejido maligno y el tejido sano circundante. El tejido sano se cosechó a una distancia de más de 5 cm del margen de resección de cáncer colorrectal. 120 muestras de la mucosa del colon sanos de grupo control fueron cosechadas a través enteroscopio eléctrica. El examen macroscópico de la mucosa sana del grupo de estudio y los sujetos de control no mostró signos de deterioro como la necrosis. El examen microscópico con microscopio de luz documentado histología normal. Los tejidos estaban libres de tumor y cualquier enfermedad concomitante detectable tal como colitis, displasia. mucosa colónica fue disecada y para obtener muestras de tejido muscular libres de colon y la mayoría de la submucosa. Esto permitió una comparación directa con el epitelio hepático minimizando la presencia de tipos de células no epiteliales. 72 muestras de tejido hepático de los voluntarios se obtuvieron a través de laparoscopio a una distancia de más de 5 cm desde el borde de la ablación quirúrgica. Las muestras fueron seleccionadas por la ausencia de enfermedad aparente histológicamente como la hepatitis, la cirrosis hepática y para minimizar el sesgo de la muestra. Después de ser encapsulado en envoltura de papel de aluminio y etiquetados, todas las muestras de tejido fueron lavadas en frío 0,9% de NaCl, e inmediatamente congelados en nitrógeno líquido dentro de los 10 minutos de la extirpación quirúrgica y se almacenaron de forma continua a -80 ° C hasta su uso posterior.
MMLV transcriptasa inversa se adquirió de Sigma Chemical Co. TaqDNA polimerasa se adquirió de Shanghai Shengong Co. Los reactivos necesarios en sistemas de reacción de la transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron proporcionados por el tumor Immunityand genéticos clave de ingeniería laboratorios. kit UGTlA se adquirió en Gentest Corp.
(2) se recogieron 5 ml de muestras de sangre venosa periférica de 327 pacientes con cáncer colorrectal y 327 casos de los adultos sanos. Ambos grupos se mantuvieron en ayunas al menos 12 horas antes de la recogida de muestras. Ácido citrato dextrosa (ACD) se utiliza para prevenir coagulado la sangre hasta el análisis. Los reactivos de lisado de eritrocitos, leucocitos lisado, la precipitación de proteínas y la hidratación de ADN fueron proporcionados a partir de Medicina Instituto de Genética del Colegio Médico de la Universidad de Shandong. Los reactivos necesarios en los sistemas de reacción de RT-PCR y endonucleasa TaqDNA se adquirieron de Promega CO. PCR productos kit de recuperación de gelatina se adquirió de BioTek CO. Todos los demás reactivos se obtuvieron de fuentes comerciales y de grado analítico.
2.3 Detección de expresión UGTlA ARNm en diferentes tejidos
La presencia de transcripciones UGT1A en el ARN total del tejido se analizó mediante amplificación por PCR, realizado como un dúplex RT-PCR co-amplificación con ADNc de β-actina como control. detección de RT-PCR de todas las transcripciones UGT1A predichos por el locus UGT1A humano se realizó utilizando el exón 1 cebadores sentido específicos y cebadores antisentido, que se encuentra dentro de los exones 2-5 o dentro de una parte común de el extremo 3 'de los primeros exones. Todos los cebadores se biosintetizan de Shenggong CO., Shanghai, después de recuperar en el laboratorio genómico, como se muestra en la Tabla S1. Se preparó
aislamiento de ARN de acuerdo con métodos de isotiocianato de guanidinio. Aproximadamente 200 mg de tejido congelado se pulverizó en un mortero lleno de nitrógeno líquido. polvo de tejido se lisó inmediatamente en solución de isotiocianato de guanidinio de fenol-ácido. UGT1A ADNc se co-synthesizd con cDNA β-actina en tubos Eppendorf que contienen RNA 1 g, 1 l MMLV, 7 l sistema de RT-PCR, 1 μ1 cebadores aguas abajo .UGT1A ADNc se co-amplificado con cDNA β-actina en un volumen de partida de 98 l que contenía 20 l revertir productos de transcripción, 19 l sistema de PCR, 1 l cebadores aguas arriba, 58 l de agua ultra pura. Después de incubación a 94 ° C durante 3 min, ciclo de PCR se inició mediante la adición de 2 l TaqDNA polimerasa seguido de centrifugación. Se realizó un total de treinta y cinco ciclos. Cada ciclo de PCR consiste en reacciones de amplificación a 94ºC durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, seguido de reacciones de alargamiento con el tiempo de alargamiento prolongado de 7 min a 72 ° C. electroforesis en gel de agarosa analítica se realizó para identificar los productos de PCR. Sistema de Análisis de gelatina Kodak se utilizó para evaluar la intensidad de la expresión de UGT1A y UGT1A isoformas de acuerdo con la siguiente fórmula:
Los experimentos se realizaron con varios niveles de controles, incluyendo los controles sin ADNc, cebadores, o polimerasa termófila. La especificidad de este ensayo se determinó por PCR utilizando todos los pares de cebadores de cada cDNA clonado plantilla para excluir la reactividad cruzada. Para confirmar la detección de cDNA UGT1A específica utilizando este ensayo, los productos de PCR fueron parcialmente secuenciados para documentar la identidad de estos productos de los genes específicos.
2.4 DNA aislamiento a partir de muestras de sangre entera
300 l de las muestras de sangre fueron infundidas en tubos de 1,5 ml Eppendorf. Se añadieron 900 l de lisado de eritrocitos de la muestra. La digestión se dejó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó a 12.000 g durante 20 segundos y se eliminaron los sobrenadantes claros. se añadieron 50 l de lisado de eritrocitos y 300 l de lisado de leucocitos para volver a suspender el sedimento, seguido de 30 minutos de digestión a temperatura ambiente. La proteína se precipitó mediante la adición de 100 l de la precipitación de proteínas y después la muestra se centrifugó a 12.000 g durante 20 segundos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo 1,5 ml tubo Eppendorf, seguido de la instilación lenta con etanol deshidratado de doble volumed pre-enfriada. La muestra se vacilaba ligeramente hasta que la precipitación de ADN. La muestra fue entonces centrifugado a 9.000 g durante 1 minuto y se eliminaron los sobrenadantes claros. se añadieron 500 l de etanol al 75% al precipitado, seguido de centrifugación a 9.000 g durante 1 minuto, los sobrenadantes se retiraron y precipitado de ADN se dejaron secar al aire. Se añadió la hidratación de ADN para rehidratar ADN y diluir solución de ADN a una concentración de 20 mg /L para su uso posterior, después de la cuantificación de ADN por espectrofotometría ultravioleta. ADN se rehidrata con agua pura a una concentración de 20 mg /L. La concentración se verificó con espectrofotómetro ultravioleta antes de su uso adicional.
2.5 Amplificación de UGT1A8 exón-1 por PCR
Exon-1, situado en el extremo 5 'de UGT1A8 humano, presenta individuo variación en su regulación. Los cebadores se diseñaron basándose en serie de UGT1A locus del gen (número de acceso AF297093). cebador directo (prlA8F, bases34175-34198): 5'-TGG GGT GTT CAG CTG TTG TGC TAG-3 ', el cebador inverso (prlA8F, bases de 35.175 a 35.208): 5'-GAA ATT GTC AAA TCA CAA TTC AGT AAG GAA TCT -3 '. Las condiciones de reacción se ajustó a 4 l de 5 reacción × PCR, 4 l de 5 × dNTP, 0,5 l de cebador directo, 0,5 l de cebador inverso, 5 l de Taq ADN endonucleasa, 2 l de molde de ADN, y el volumen óptico suplementario de tres veces estéril de agua, lo que hizo hasta un volumen total de 100 l destila. se llevó a cabo 35 ciclos de reacción de amplificación. Cada ciclo consistió en la desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, la reacción de recocido a 57 ° C durante 30 segundos, y extensión a 72 ° C durante 30 segundos. El ciclo completo fue precedida por una incubación de 3 minutos de la mezcla de reacción a 95 ° C y seguido por 10 minutos de elongación a 72 ° C. La identidad de los productos de la PCR se confirmó con electrophrosis gel.
2.6 Purication y secuenciación de los productos PCR
Los productos de PCR fueron teñidos con bromuro de etidio durante 15 min, y se aisló con 20 g /L de gel de agarosa , a una tensión de 120 V durante 1 hora. Las correas de ADN amplificados fueron cortadas bajo la lámpara ultravioleta a 320 nm y se colocaron en tubos de 1,5 ml Eppendorf. Se ha añadido el volumen de tampón de unión cuadruplicado a las correas de ADN. Después de la incubación con baño de agua a 65 ° C durante 7 min, la mezcla se transfirió en columnas y se centrifugó a 12.000 g durante 1 minuto. Se utilizaron 300 l de tampón de unión para limpiar la columna después de desechar la solución. Se añadieron otros 750 l de ADN de tampón de lavado a la muestra y se repitió la centrifugación a 10.000 g durante 1 minuto. La solución mezclada se centrifuga a 12.000 g durante 1 minuto antes de desechar los sobrenadantes. Tras la eliminación del sobrenadante, las muestras se transfirieron desde tubos de 1,5 ml Eppendorf en la columna. Después, se añadieron 30 pl de DNA Buffer de agua en la columna, la mezcla se centrifugó a 12.000 g durante 1 minuto. La solución se recogió para la cuantificación y el análisis adicional. Los fragmentos de ADN recogidos de diferentes genotipos se transfirieron a TOPO TA plásmido Las muestras de ADN fueron secuenciados en medicina Instituto de Genética de Colegio Médico de la Universidad de Shandong con un secuenciador totalmente automático (Prism 377, ABI CO., EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
Este estudio utilizó las mismas medidas de control de calidad descritos por Lesley M. Butler, et al. [37]. controles primeros, positivos y negativos fueron incluidos en cada experimento de PCR y Taqman. Homocigoto de tipo salvaje, heterocigotos y homocigotos variantes para cada genotipo UGT1A8 de muestras de ADN genómico del genotipo UGT1A8 se incluyeron. En segundo lugar, los ensayos repetidos se realizaron en tres muestras seleccionadas al azar de cada experimento y había 100% de concordancia. En tercer lugar, tres muestras adicionales seleccionados al azar se confirmaron por secuenciación directa del ADN. Por último, el personal de laboratorio fueron cegados al estado del caso de las muestras.
2.7 estadístico El análisis
Paquete de software de SPSS11.0 se utilizó para analizar los datos en este estudio. Los datos cuantitativos se expresan como media ± desviación estándar (X ± s). Las comparaciones entre las medias de dos grupos de muestras se hicieron con el de Student
t-test
, mientras que múltiples medias de los grupos fueron analizados por ANOVA. Los resultados de los estudios de casos y controles se analizaron mediante la prueba exacta de dos colas de Fisher para determinar la diferencia de distribución de múltiples alelos entre casos y controles. Ajustado RUP y IC del 95% para el cáncer colorrectal se calcularon utilizando modelos de regresión logística. se utilizaron los IC de 95% a menos que se indique lo contrario. OR ajustadas e IC 95% se utilizaron para evaluar los efectos de alelos UGT1A8, el genotipo y de género en la susceptibilidad en el cáncer colorrectal. Un valor de p de 0,05 o menos se definió como estadísticamente significativo.
Resultados
3.1 Variación de la expresión de ARNm de UGT lA
Todas las transcripciones de genes humanos UGT1A visualizar una única 5 'característica terminal de cada uno de los transferasa individuo y un común 3' parte codificada por los exones 2-5. La región 3 'es idéntica en todos los miembros codificadas por el locus UGT1A y por lo tanto se puede explotar para analizar la expresión general UGT1A. Co-amplificación de los 487 pb UGT1A y 317-bp productos PCR humanos β-actina, separados en un gel de agarosa al 2% y teñidos con bromuro de etidio, se demuestra el uso de tejidos cancerosos, los tejidos sanos circundantes, tejidos de colon normal de los pacientes de control y los tejidos hepáticos. La amplitud y la intensidad de β-actina (317 pb) en los paneles fueron consistentes como se esperaba. La amplitud y la intensidad de UGT1A ARNm (487 pb) fueron mucho más variable. La cuantificación de los productos de DRT-PCR se logró mediante el cálculo de coeficiente de relación utilizando el Sistema de Análisis de gelatina Kodak. Sin embargo, la cuantificación reveló diferencias significativas en los niveles de estado estacionario entre tres fuentes extrahepáticas y los tejidos hepáticos.
En los pacientes con cáncer colorrectal, la expresión de ARNm UGTlA se redujeron significativamente en los tejidos patológicos en comparación con los tejidos sanos circundantes cosechados juntos. expresión UGT1A ARNm en el tejido sano recogido de pacientes de cáncer colorrectal fue significativamente menor que el tejido de colon sano recogido de control normal. Se detectó el nivel más alto de expresión UGT1A ARNm en el tejido hepático, que fue significativamente mayor que los tejidos de colon normal de los controles sanos (P & lt; 0,01), (Tabla No.1). expresiones de genes del colon UGTlA se caracterizaron por la variación individual significativa, mientras que hepáticos expresiones UGTlA mRNA fueron más uniformes.
3,2 expresión polimórfica de isoformas UGT1A en diferentes tejidos
Análisis de la expresión génica fue UGT1A realizado en el ARNm empleando UGT1A exón 1 específica DRT-PCR. Como se informó anteriormente, hepático humano y los tejidos de colon se caracterizan por una expresión diferencial única y específica de tejido de la locus UGT1A [11], [12]. Artículos de exón 1 específica DRT-PCR detecta específicamente las transcripciones de todas las isoformas UGT1A conocidos. correas de ADN se separaron en 2% de agarosa y se tiñeron con bromuro de etidio (Fig.1). De las isoformas de la familia UGT1A analizados, UGT1A5 y mRNA 1A7 no se detectó en todas las muestras de tejido, y el número de muestras expresan isoformas UGT1A era diferente en diferentes tejidos. El análisis de 150 diferentes transcripciones UGT1A de tejidos cancerosos demostró lo siguiente: UGT1A1, 1A8 y 1A10 mRNA se expresaron en 102 muestras (figura 1.A). UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A8, 1A9 y 1A10 mRNA se expresaron en 54 muestras (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 y 1A10 mRNA se expresaron en 66 muestras (Fig.1.c). UGTlA3, 1A4, 1A8, 1A9 y 1A10 mRNA se expresaron en 108 muestras (Fig.1.d). La expresión polimórfica de isoformas UGTlA en diferentes tejidos se muestra en la mesa de debate2 y fig.2. En contraste con los tejidos cancerosos, y UGTlA8 mRNA UGTlAl0 no se expresaron en los 72 diferentes muestras de tejido hepático. Hubo poca variación en la abundancia de las transcripciones UGTlA isoformas cuando cada uno se comparó con los niveles de expresión de ß-actina. niveles UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6 mRNA y 1A9 fueron regulados diferencialmente abajo en los tejidos cancerosos en comparación con rodea la mucosa normal (P & lt; 0,01), sin embargo, los niveles de UGTlA8 mRNA y UGTlAl0 fueron hasta reguladas (P & lt; 0,01).
AT: tejidos de cáncer de colon; N: Alrededor de la mucosa sana; M: Marcador
productos A.PCR de UGTlA8 exón-1 (1 033 pb). 1,2,3: productos de PCR de UGTlA8; M: marcador. resultados B.Sequenced de alelos uGTlA8. R: UGTlA8 * 1; b: UGTlA8 * 2; c: UGTlA8 * 3
Estos datos demuestran que el locus UGT1A se expresa en el tracto gastrointestinal humano.. Los datos también señalan la regulación polimórfica y la variación individual de UGTL Un locus del gen de la transcripción de ARN. Además, la identificación de la expresión específica de tejido de UGT1A8 implica que los mecanismos de regulación pueden ser indicativos del desarrollo evolutivo y la base biológica para determinar las variaciones individuales en el riesgo de cáncer.
3.3 Identificación de la matriz de ADN extraído de muestras de sangre total
SeqMan de DNASTAR Software de Biología Molecular se utilizó para analizar las secuencias de los productos de PCR. secuencias detectadas fueron comparados con los criterios especificados previamente estandarizados por proyecto del genoma humano [HGP] para determinar los sitios de SNP y la frecuencia de los alelos, análisis después agrupado de resultados secuenciados y diversas exclusiones de picos fantasma y los sectores defectuosos. Distribución de la población de alelos se reunió Hardy-Weinberg mediante χ2 prueba (grados de libertad = número de alelos-1). La longitud de los productos de PCR fue 1,033bp (Fig.2.A). resultados en secuencia de los productos de PCR purificados indicaron que había tres SNPs en el par de bases 518 (CG), el par de bases 765 (AG), y el par de bases 830 (GA) dentro de la región de codificación de UGT1A8 exón-1 (Fig.2.B, Tabla S2) .La mutación en el nucleótido 518 conduce a la mutación sin sentido en el codón 173, como resultado, la alanina se sustituye con glicina. La mutación en el nucleótido 830 resultados en sustitución de tirosina para cisteína codificados por el codón 277. La mutación en el nucleótido 765 es una mutación silenciosa. Los polimorfismos funcionales se muestran en la Tabla S2. Para la mayoría de las muestras con una mutación heterocigota, sólo una única mutación estaba presente, indica las tres mutaciones puntuales no están vinculados (Tabla S2, S3). Para mejorar la precisión, los fragmentos de ADN recogidas de diferentes genotipos fueron transferidos en los plásmidos de clonación TOPO TA. Múltiples clones de cada muestra de ADN se caracterizaron por análisis de secuencia de ADN. En todos los casos, los patrones de mutación acertaron la identidad de los alelos como se indica en la Tabla S2 y Table.S3. El genotipo de las muestras puede ser verificada utilizando la clonación TOPO de fragmentos de ADN, en este caso UGTlA8 * 2 y * 3 UGTlA8 alelos se identificaron utilizando la clonación TOPO.
3.4 Análisis de frecuencia de los alelos y el genotipo de UGT1A8
En el grupo de control, la frecuencia del alelo UGTlA8 * 1 (tipo salvaje) y UGTlA8 * 1a fue dominante (79%), seguido de un 18,8% para UGTlA8 * 2. La identidad de UGTlA8 * 3 era de hecho rara, con sólo el 2,3% de los controles observados para llevar este genotipo (table.3, Figura.3). UGTlA8 * La es una mutación silenciosa y codifica UGTlA8 * l. Un patrón de homocigotos UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1a, 1a UGTIA8 * /* 1a) representó aproximadamente el 65,21% de los adultos normales (Table.4). Se encontró que el genotipo de UGTlA8 * 1 /* 2 y UGTlA8 * 1a /* 2 fue a una frecuencia de 24,64%, el genotipo UGTlA8 * 1 /* 3 y UGTlA8 * 2 /* 3 fue a una frecuencia de 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 estaba a una frecuencia de 5,8% en los controles. Curiosamente, no había UGTlA8 homocigótica * 3. En el caso de pacientes con cáncer colorrectal, la frecuencia del alelo UGTlA8 * 1 y * UGTlA8 1a, UGTlA8 * 2, * 3 UGTlA8 constituido de aproximadamente 61,5%, 22,0% y 16,5% (Figura.3), respectivamente. La expresión de heterocigotos UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8, consisten en aquellos con un genotipo de UGTlA8 * 1 /* 2 UGTlA8 y UGTlA8 * 1a /* 2, se encontraban en una frecuencia de aproximadamente 18,84%. 28,98% de los individuos con cáncer colorrectal expresó UGTlA8 * 1 /* 3 y * UGTlA8 2 /* 3. El genotipo homocigótico de UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /* 1 UGTlA8, UGTlA8 * 2 /* UGTlA8 2) compuesta por 46.38%, 4.35% de los casos cancerosas, respectivamente. Un caso de UGT1A8 * 3 homocigotos también señaló (table.3). No hubo diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de los alelos y genotipos entre el grupo de estudio y el grupo de control. El alelo de tipo salvaje (UGTlA8 * 1) frecuencia fue menor entre los grupos de estudio que el grupo control [P = 0,000, OR = 0,45, IC (0,28-0,79)]. El mismo significado podría señalar con el genotipo UGTlA8 * 1 /* l [p = 0,000, OR = 0,28, IC (0,19-0,41)] y UGTlA8 * 2 /* 3 [p = 0,000, OR = 10,58; IC (4.48- 24.98)] (Table.4 y la figura 4). Los resultados opuestos se observaron en UGTlA8 alelo * 3 [p = 0,000, OR = 6,99, IC (3,39-14,42)] (table.3 y la figura 4) y el genotipo UGTlA8 * 1 /* 3 [p = 0,000, OR =