Extracto
La timosina β
10 (Tβ
10) regula la dinámica de actina como un citoplasma G-proteína actina secuestrante. Anteriormente, hemos demostrado que Tβ
10 disminuye el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la proliferación mediante la interrupción de la actina y mediante la inhibición de Ras. Sin embargo, poco se sabe sobre su mecanismo de acción y la función biológica. En el presente estudio, se establece un nuevo modelo de terapia génica utilizando un adenovirus modificado genéticamente, denominado como Ad.TERT.Tβ
10, que se sobreexpresan la Tβ
10 genes en las células cancerosas. Esto se logró mediante la sustitución de la Tβ nativo
10 promotor del gen con el promotor de TERT humana en Ad.TERT.Tβ
10. Se investigó la actividad de supresión del cáncer de Tβ
10 y encontramos que Ad.TERT.Tβ expresión específica del cáncer sorprendentemente inducida
10 de Tβ
10, así como la apoptosis en un modelo de co-cultivo de ovárica primaria humana las células de cáncer y fibroblastos normales. Además, Ad.TERT.Tβ
10 disminuye el potencial de membrana mitocondrial y el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estos efectos fueron amplificados por co-tratamiento con medicamentos contra el cáncer, tales como paclitaxel y cisplatino. Estos hallazgos indican que el aumento de la producción de ROS debido a la interrupción de la actina por Tβ
10 sobreexpresión aumenta la apoptosis de células de cáncer de ovario humano. En efecto, la sobreexpresión específica del cáncer de Tβ
10 por Ad.TERT.Tβ
10 podría ser una valiosa contra el cáncer terapéutica para el tratamiento de cáncer de ovario sin toxicidad para las células normales.
Visto : Kim YC, Kim BG, Lee JH (2012) timosina β
10 Expresión Impulsada por la apoptosis TERT Humanos promotor induce cáncer ovárico-específica a través de ROS producción. PLoS ONE 7 (5): e35399. doi: 10.1371 /journal.pone.0035399
Editor: Yoshiaki Tsuji, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Estados Unidos de América
Recibido: December 20, 2011; Aceptado: March 16, 2012; Publicado: 18 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación fuente es el gobierno de Corea. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
timosinas son una familia de pequeñas proteínas que originalmente fueron aisladas de timo de ternera, y se dividen en tres clases (α, beta y gamma) en función de su punto [1] isoeléctrico. Los ß-timosinas, que tienen una masa molecular media de las proteínas ácidas aproximadamente 5 kDa, están muy conservadas que se encuentran en casi todas las células eucariotas. Los ß-timosinas inhiben la polimerización de actina fines de púas por monómeros de actina secuestrantes [2], [3]. Como uno de los más abundantes beta timosinas en especies de mamíferos, timosina β
10 (Tβ
10) afecta a la metástasis y la proliferación de muchas células cancerosas [4] - [6]. Los efectos anticancerígenos de Tβ
10 parecen estar estrechamente relacionada con su función como regulador de la dinámica de la actina en las células tumorales [7], [8]. dinámica de la actina pueden ser perturbadas por la adición de drogas actina estabilización o la introducción de mutaciones, provocando cambios en la arquitectura celular y el movimiento celular interna. Por otra parte, informes recientes han indicado que los cambios en la dinámica de actina pueden resultar en la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) de las mitocondrias y la posterior muerte de las células, haciendo hincapié en la importancia de mantener la regulación dinámica del citoesqueleto de actina [9] - [14].
Recientemente, la telomerasa ha sido reconocido como un marcador tumoral de amplia gama y ahora es considerado uno de los objetivos terapéuticos más importantes para el tratamiento del cáncer. telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), la subunidad catalítica de la telomerasa, se detecta en aproximadamente el 90% de las células de cáncer de tejido tumoral, pero no es detectable en los tejidos normales [15] - [17]. Estudios previos han demostrado que el promotor de hTERT puede regular la expresión ectópica de los genes de interés en las células cancerosas positivas de telomerasa, lo que indica que el promotor de hTERT es un candidato prometedor para la generación de adenovirus específicos del cáncer [18] - [22].
a continuación, se describe un adenovirus recombinante, Ad.TERT.Tβ
10, que se construyó insertando el Tβ
10 genes bajo el control del promotor del gen hTERT en el plásmido de adenovirus p-lanzadera para inducir -tumoral específica expresión Tβ
10 genes. También hemos establecido un modelo de co-cultivo de células de cáncer de ovario primarios humanos y fibroblastos normales y tratados, posteriormente esta co-cultivo con Ad.TERT.Tβ
10 para dilucidar los efectos específicos del cáncer de Ad.TERT.Tβ
10. Además, se investigó el mecanismo de Tβ
apoptosis 10-inducida en 2774 células de cáncer de ovario humano que fueron tratados con Ad.TERT.Tβ
10. Estos experimentos revelaron evidencia de que Ad.TERT.Tβ
10 induce la expresión específica del cáncer de Tβ
10, lo que resulta en la apoptosis específica del cáncer a través de la producción de ROS. En conjunto, estos resultados indican que la sobreexpresión específica del cáncer de Tβ
10 por Ad.TERT.Tβ
10 de hecho podría ser una valiosa contra el cáncer terapéutica para el tratamiento de cáncer de ovario sin toxicidad para las células normales y, posiblemente, otros tumores malignos .
Resultados
β Timosina
10 se expresa en niveles bajos en cáncer de ovario
en nuestro estudio anterior, se informó de que Tβ
10 niveles de mRNA fueron elevado en ovarios normales, en comparación con otros tejidos, tales como el bazo, timo, próstata, testículos, intestino delgado, colon, y leucocitos de sangre periférica, pero los niveles de ARNm de Tβ
10 se redujeron en los cánceres de ovario [23]. Nosotros, por lo tanto, confirmó los niveles de mRNA y expresión de proteínas de timosina β
10 (Tβ 10
) en el cáncer de ovario tipo seroso y cáncer de ovario tipo mucinoso, así como en el cáncer cervical y inmortalizadas líneas celulares de cáncer de ovario, tales como 2774, OVCAR3, y SKOV3. Nuestros resultados que ARNm (Figura 1A) y proteína (Figura 1B) niveles de Tβ
10 eran de alta en el tejido ovárico normal, pero disminuyó en todos seroso Carcinoma, Carcinoma mucinoso, y las líneas celulares de cáncer de ovario inmortalizadas, eran consistentes con nuestro estudio anterior. Sin embargo, no fuimos capaces de detectar cambios en el tejido normal del cuello uterino, adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas. En particular, los altos niveles de expresión de Tβ
10 son características de ovarios normales, pero estos niveles disminuyen en el cáncer de ovario, lo que sugiere que Tβ
10 juega un papel en el desarrollo del cáncer de ovario.
(A) mRNA los niveles de expresión de Tβ
10 se determinaron mediante PCR en tiempo real utilizando ARN total aislado de los tejidos normales y cancerosas humanas, incluyendo las líneas celulares de cáncer de ovario, como el carcinoma seroso (seroso. C) y el carcinoma mucinoso (mucinoso. C), inmortalizados líneas humanas de ovario de células de cáncer (2774, OVCAR3, y SKOV3) y adenocarcinoma (Adeno. C) y carcinomas de células escamosas (células escamosas. C) del cuello del útero. Los datos se presentan como media ± SE para n = 3 muestras separadas por tipo de célula de agrupación y se expresa en términos de porcentaje de ovario normal. Las diferencias significativas entre los grupos se indican mediante un asterisco (*), P & lt; 0,05; un asterisco doble (**), P & lt;. 0.01 (B) El nivel de expresión de la proteína de Tβ
10 se determinó por inmunohistoquímica en tejido de ovario normal y comparación con la de tipo seroso y mucinoso de cáncer de ovario, respectivamente
Expresión cáncer-específica de β Timosina
10 por Ad.TERT.Tβ
10
Para dilucidar el papel de Tβ
10 en el cáncer de ovario humano, establecimos un nuevo modelo fisiológico por co-cultivo de células de cáncer de ovario primarios con los fibroblastos normales y el uso de un sistema de suministro de genes específica del cáncer que comprende un adenovirus modificado genéticamente. Hemos construido adenovirus recombinante, Ad.TERT.Tβ
10, sustituyendo el Tβ
10 promotor del gen con el promotor de hTERT, y se confirmó la integridad de Ad.TERT.Tβ
10 por reacción en cadena de la polimerasa ( PCR) utilizando Ad-de TERT, Tβ
10, y E1a cebadores (Figura 2A). Para confirmar el nivel de expresión Tβ
10 genes, se trataron las células con Ad.TERT.Tβ 2774
10 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y se controlará cambios en el Tβ
10 utilizando la expresión inmunocitoquímica (CPI) y RT-PCR. Nuestros resultados revelaron que Ad.TERT.Tβ
10 elevado Tβ
10 expresión en el citosol (Figura 2B).
(A) Diagrama esquemático del adenovirus recombinante, Ad.TERT.Tβ
10, generada por la recombinación de pSuttle.TERT.Tβ
10 y el plásmido columna vertebral pAdEasy-1 en BJ5183. El plásmido pShuttle modificado, denominado pSuttle.TERT.Tβ
10, se clonó mediante la inserción ordenada del promotor de TERT humana y Tβ
10 gen para generar un adenovirus recombinante. La integridad de Ad.TERT.Tβ
10 se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de Ad-de TERT, Tβ
10, y E1a. (B) Subconfluent 2774 células de cáncer de ovario se infectaron con 10 MOI de Ad.TERT.LacZ o Ad.TERT.Tβ
10. Después de 24 h, Tβ
10 proteínas y los niveles de ARNm se determinaron mediante inmunocitoquímica y RT-PCR, respectivamente. (C) subconfluentes células cancerosas de ovario humanas primarias co-cultivadas con células de fibroblastos se expusieron a 10 MOI de Ad.TERT.LacZ durante 7 días. β-galactosidasa nivel de expresión se determinó por tinción de β-gal (color azul). La flecha en el centro de la figura indica una masa de células de cáncer de ovario primario. (D) subconfluentes células cancerosas de ovario humanas primarias co-cultivadas con células de fibroblastos también fueron expuestos a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ
10 durante 24 horas. Tβ
nivel 10 expresión se determinó por inmunocitoquímica (color verde). Las flechas en la parte inferior de la figura indican las células del cáncer de ovario primario.
También evaluó la inducción de cáncer selectivo de la expresión génica de adenovirus recombinantes, Ad.TERT.Tβ
10 y Ad.TERT.LacZ , en nuestro modelo de co-cultivo de células de cáncer de ovario primarios y fibroblastos normales. En el día 7 después del tratamiento con 10 MOI de Ad.TERT.LacZ, se observó que las células de cáncer de ovario habían crecido bien en la capa formada por las células de fibroblastos normales como ser observada en el grupo no tratado. Por otra parte, X-gal células positivas, lo que indica la expresión de β-galactosidasa por Ad.TERT.LacZ, se detectaron sólo en las células de cáncer de ovario primarios (Figura 2C). En el día 1 después del tratamiento con Ad.TERT.Tβ
10, fluorescencia verde, indicando Tβ
10 expresión, se detectó en las células de cáncer de ovario primario pero no en células de fibroblastos normales (Figura 2D), lo que sugiere que el promotor de TERT confiere la expresión génica específica del cáncer de ovario.
efectos de la timosina β
10 en la migración de células de ovario cáncer
informes previos han demostrado que los efectos anticancerígenos de Tβ
10 están estrechamente en relación con su papel en la regulación dinámica de la actina en las células tumorales [7], [8]. Nosotros, por lo tanto, examinamos el papel de Tβ
10 en la migración celular y la invasión del cáncer. Se encontró que tanto la migración de células de cáncer y la invasión se redujo significativamente en las células infectadas por 2774 Ad.TERT.Tβ
10, en comparación con 2774 células infectadas con Ad.TERT.LacZ y 2774 células no infectadas (Figura 3A). En relación con la migración celular, movimiento celular también se estimó mediante el ensayo de curación de heridas. 2774 motilidad celular en una superficie de plástico se redujo significativamente por Ad.TERT.Tβ
10 tratamiento (Figura 3B).
(A) subconfluentes 2774 células de cáncer de ovario humano se infectaron con 10 MOI de Ad.TERT .LacZ o Ad.TERT.Tβ
10 durante 12 horas. Después de la resuspensión, las células se incubaron adicionalmente durante 12 h en la cámara superior de una placa Transwell® recubierta con una monocapa de colágeno para el ensayo de migración o con doble capa de colágeno y matrigel para el ensayo de invasión. Los resultados se expresan como un porcentaje del control del vehículo y son la media ± SE (barras) de tres experimentos. Las diferencias significativas de grupo de control de vehículo se indican con un asterisco (*), P & lt; 0,05; un asterisco doble (**), P & lt; 0,01 (B) Las células infectadas por virus también se incubaron adicionalmente en un 35 mm μ-Dish, bajo, con una cultura-Insert (ibidi) durante 12 horas, y seguido por la observación de la dirección y velocidad de la migración celular durante la cicatrización de heridas. Los resultados de curación de heridas se expresan como un porcentaje del control del vehículo y son la media ± SE (barras) de tres experimentos. Las diferencias significativas de grupo de control del vehículo se indican con dos asteriscos (**), P & lt;. 0,01
La inducción de cáncer-específica por apoptosis Ad.TERT.Thymosin β
10
Para examinar los efectos de la sobreexpresión de Tβ
10 sobre la viabilidad de las células cancerosas, subconfluent 2774 células de cáncer de ovario se infectaron con Ad.TERT.LacZ o Ad.TERT.Tβ
10 en una MOI de 10, y el MTT-bioensayo se realizó al día durante 6 días. Se encontró que Tβ
10 disminuyó significativamente la viabilidad celular de cáncer de ovario, en comparación con los controles de medios con o sin Ad.TERT.LacZ (Figura 4A). A continuación, para examinar si la disminución de la viabilidad celular era debido a apoptosis, se realizó un análisis FACS para Anexina V-FITC y encontramos que la sobreexpresión de Tβ apoptosis
10 inducida, pero no la necrosis, en la línea 2774 de células de cáncer de ovario (Figura 4B). Por otra parte, en el día 1 después del tratamiento de Ad.TERT.Tβ
10 en el modelo de co-cultivo de cáncer de ovario humano primario con los fibroblastos normales, se observa claramente la fragmentación nuclear (fluorescencia azul) sólo en las células de cáncer de ovario que sobreexpresa Tβ
10 (fluorescencia verde). Por otra parte, no fuimos capaces de detectar la fragmentación nuclear o Tβ
10 expresión por encima de los niveles de fondo del fibroblasto normal. Estos resultados indican que la sobreexpresión específica del cáncer de Tβ
10, que se ve facilitada por el promotor de TERT, estimula la fragmentación nuclear específica del cáncer como una de las características morfológicas de apoptosis (Figura 5A). Además se observó sorprendente cambios morfológicos de las células de cáncer de ovario tratados con Ad.TERT.Tβ
10 durante más de 90 horas utilizando un microscopio de imágenes en tiempo real. Después de 10 horas de tratamiento con Ad.TERT.Tβ
10, se observó cambios morfológicos apoptóticos típicos en las células de cáncer de ovario, tales como formación de ampollas en la membrana plasmática, la pérdida de interacciones célula-célula, vacuolización citoplásmica, y encogimiento de la célula debido a la rápida deshidración. Las células apoptóticas fueron desapareciendo con la muerte celular, mientras que las células de fibroblastos normales parecían no estar afectada por Ad.TERT.Tβ
10 durante más de 90 horas (Figura 5B; Película S1)
(A) Subconfluent 2774 ovario. se mantuvieron las células cancerosas durante 5 días en medio de cultivo completo que contiene Ad.TERT.LacZ o Ad.TERT.Tβ
10 a una MOI de 10 o 100, y el MTT-bioensayo se realizó diariamente. (B) En el segundo día después de la infección viral, a /yoduro de propidio (PI) de ensayo FACS Anexina V se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante (Clontech). gráficos de dispersión representativos se muestra la distribución de la anexina V y PI-células teñidas. En los paneles superiores, el eje X (FL1-H) indica la anexina V-FITC fluorescencia detectada a 518 nm, y el eje Y (FL2-H) indica la fluorescencia PI detectado a 620 nm. Como la parte inferior izquierda (LL) cuadrante indica células vivas, la parte superior izquierda (UL) cuadrantes indican las células necróticas, la parte superior derecha (UR) cuadrantes indican células finales de apoptosis, y abajo a la derecha (LR) cuadrante indica primeras células apoptóticas (paneles superiores) , los resultados se expresan como porcentaje del número total de células y son la media ± sE (barras) de tres experimentos individuales. Las diferencias significativas de grupo del vehículo se indican con un asterisco (*), P & lt; 0,05; un asterisco doble (**), P & lt;.
0,01
(A) co-cultivos de células subconfluentes primarias humanas de cáncer de ovario y los fibroblastos se expusieron a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ
10 durante 24 horas, y luego inmunocitoquímica se realizó para observar los cambios morfológicos nucleares inducidas por Tβ
10 expresión. Imagen de contraste de interferencia (DIC) se fusionó con 4,6-diamino-2-fenilindol tinción (DAPI) (azul) y Alexa 488 tinción (verde) para evaluar la fragmentación nuclear por Tβ
10 expresión. Las flechas indican las fragmentaciones nucleares. (B) Los co-cultivaron células subconfluentes primarias humanas de cáncer de ovario y los fibroblastos se expusieron a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ
10 durante más de 90 horas, y luego se observaron cambios morfológicos utilizando un sistema de imágenes en tiempo real. Las flechas blancas indican características selectivas morfológicas de apoptosis, tales como formación de ampollas en plasma de células de membrana, vacuolización citoplásmica, y la contracción celular (después de 10 hr), seguido por la pérdida de interacciones de célula a célula (después de 15 hr). Y flechas negras seguimiento de uno de los fibroblastos indican que los fibroblastos se están moviendo activamente acerca incluso hasta 90 horas.
La relación entre β Timosina
10 y Fas Expresión
Para examinar si ovario apoptosis específica del cáncer se debe a la expresión de genes de apoptosis promoción y la posterior transducción de la señal, se evaluó la expresión de Fas y la caspasa 3 activación utilizando células de cáncer de ovario primarios co-cultivadas con fibroblastos normales, así como la línea celular de cáncer de ovario 2774. Se encontró que Ad.TERT.Tβ
10 inducida Fas mRNA y expresión de proteínas en 2774 células de cáncer de ovario (Figura 6A). En el modelo de co-cultivo primario, se detectó la expresión de Fas en células de cáncer de ovario primario pero no en los fibroblastos normales. Estos resultados son consistentes con la expresión específica del cáncer de Tβ
10 después de la infección con Ad.TERT.Tβ
10 (Figura 6B). Es importante destacar que, Tβ
10 aumento de la actividad de la caspasa 3 como lo hizo citocalasina D (Cyt D), un potente inhibidor de la polimerización de actina. El aumento de la actividad caspasa 3 también se inhibió por la adición de inhibidor de caspasa Z-VAD-FMK. Además, estos datos son consistentes con los resultados de viabilidad celular obtenidos a partir del ensayo de azul de alarmar (Figura 6C).
(A) subconfluentes 2774 células de cáncer de ovario humano se expusieron a Ad.TERT.LacZ o Ad.TERT. Tβ
10 a una MOI de 10 durante 48 horas y seguido por próximos experimentos tales como RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western para detectar FAS (CD95) mRNA y expresión de la proteína, respectivamente. (B) las células humanas primarias subconfluentes con cáncer de ovario co-cultivadas con fibroblastos también se expusieron a 10 MOI de Ad.TERT.Tβ
10 durante 24 horas y seguidas por inmunocitoquímica. La tinción específica de anticuerpos FAS /CD95 (Alexa 488, verde) se fusionó con imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y las imágenes de tinción nuclear (DAPI, azul) utilizando software de imagen. Blanco y flechas de color naranja indican los fibroblastos y las células de cáncer de ovario, respectivamente. (C) Las células se expusieron a Ad.TERT.LacZ o Ad.TERT.Tβ
10 a una MOI de 10 con o sin inhibidor de caspasa (zVAD, 40 M), y la actina inhibidor de la polimerización (la citocalasina D, 1 g /ml) durante 48 hr. Las células de cáncer de ovario 2774 fueron teñidas de acuerdo con el protocolo de caspasa 3 kit de ensayo comercial (Thermo) y la imagen usando un lector de Thermo Scientific Celómica ArrayScan de cribado de alto contenido (HCS). En el gráfico de barras, los valores que representan un porcentaje del control del vehículo es seguido por la relación entre el área de activación de la caspasa 3 y la zona del núcleo. Y los resultados son la media ± SE (barras) de tres experimentos diferentes. Las diferencias significativas de grupo del vehículo se indican con dos asteriscos (**), P & lt; 0,01 (gráfico de barras de la izquierda). La citotoxicidad en las mismas condiciones se determinó en células de cáncer ovárico en cultivo usando el ensayo de Azul de alamar (AB) como un
in vitro
modelo alternativo. Los resultados se expresan como un porcentaje del control del vehículo y son la media ± SE (barras) de tres experimentos. Las diferencias significativas de grupo de control de vehículo se indican con un asterisco (*), P & lt; 0,05; un asterisco doble (**), P & lt; 0,01 (gráfico de barras a la derecha)
Los efectos de la timosina β
10 en la disfunción mitocondrial y la producción de ROS
Informes anteriores han indicado que la alteración del citoesqueleto de actina induce la generación extracelular de ROS, en particular, O
2
-, que amplifica apoptosis Fas dependiente de [13], [24]. Además, la disminución de la dinámica de actina causa la despolarización de la membrana mitocondrial y un aumento en la producción de ROS, lo que resulta en la muerte celular [14]. Tomados en conjunto, la hipótesis de que la inhibición de la polimerización de actina por Tβ
10 abre los poros de la membrana mitocondrial o canales durante un tiempo prolongado, lo que resulta en la reducción de potencial de membrana mitocondrial (MMP) y un aumento en la liberación de ROS en el citoplasma. Por lo tanto, hemos medido los cambios inducidos por el 10-Tβ
en los niveles de MMP ROS y encontramos que inicialmente altos niveles de MMP se disminuyó notablemente por Tβ
10 sobreexpresión (Figura 7A). Por otra parte, la producción de ROS se incrementó en Tβ
10 sobreexpresión, que es coherente con el resultado del bioensayo MTT.
Las células (A) se expusieron a Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad. TERT.Tβ
10 (10 MOI), y el inhibidor de la polimerización de actina (citocalasina D, 1 mg /ml) durante 48 h, y luego un potencial de membrana mitocondrial se realizó (MMP) de ensayo. El ensayo de MMP se realizó utilizando el protocolo del kit de ensayo de MMP (Thermo), y los resultados se obtuvieron imágenes utilizando un lector de Thermo Scientific Cellomics ArrayScan de cribado de alto contenido (HCS). (B) Las células se expusieron a Ad.TERT.LacZ (10 MOI), Ad.TERT.Tβ
10 (10 MOI) con o sin agentes anti-cáncer, tales como paclitaxel (taxol, 5 g /ml) y cisplatino (platino, 10 g /ml), durante 48 horas. Los resultados se compararon con los de otros tratamientos, por ejemplo, cada agente anti-cáncer o inhibidor de la polimerización de actina (citocalasina D, 1 mg /ml). Los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelulares (ERO) se detectaron mediante un sistema ELISA de fluorescencia con la sonda fluorescente sensible a la oxidación 2, diacetato de 7-diclorofluoresceína (DCF-DA). Además del ensayo de ROS, un ensayo de MTT-bio también se realizó bajo las mismas condiciones. Los todos los resultados se expresan como un porcentaje del control del vehículo y son la media ± SE (barras) de tres experimentos. Las diferencias significativas de grupo de control de vehículo se indican con un asterisco (*), P & lt; 0,05; un asterisco doble (**), P & lt;. 0.01
Se ha informado de que los niveles de ROS celulares aumentan en condiciones de estrés por tratamiento con agentes anticancerígenos tales como taxol (paclitaxel) y el platino (cisplatino) . Este aumento ROS conduce a la inducción de moléculas pro-apoptóticos, tales como p53 y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), lo que lleva a la apoptosis celular [25] - [30]. Utilizamos Ad.TERT.Tβ
10 como un co-tratamiento con dos clases de los agentes contra el cáncer, y encontramos que el co-tratamiento dio lugar a efectos sinérgicos, el aumento de la generación de ROS y la disminución de la viabilidad celular (figura 7B). Estos hallazgos sugieren que la apoptosis inducida por el cáncer de ovario Tβ
10 sobreexpresión se debe a la producción de ROS en respuesta a la disminución de MMP.
Discusión
De los miembros de la familia ß-timosina, timosina beta
4 (Tβ
4), timosina ß ß
10 (Tβ
10), y la timosina
15 (Tβ
15) han sido estudiados en carcinogénesis. Ellos han sido implicados en el secuestro de actina. Sin embargo, la función de ß-timosinas es en gran parte desconocida, y su papel en la progresión de la enfermedad neoplásica sigue siendo controvertido
.
La elevada expresión de Tβ
4 y Tβ
10 ha sido considerado como una característica de carcinogénesis humana. La sobreexpresión de Tβ
4 se produce en una amplia variedad de carcinomas humanos. Tβ
4 afecta a la migración de células de la angiogénesis y el cáncer en muchos tipos de células del cáncer [31] - [34]. Del mismo modo, la sobreexpresión de Tβ
10 ha sido reportado en numerosos carcinomas humanos, incluyendo melanomas [1], carcinomas de riñón, páncreas [35], y el estómago [36], así como carcinomas medulares de tiroides [37].
Paradójicamente, Tβ
4 y Tβ
10 puede estar implicado en la degeneración del cáncer, como los informes han indicado que Tβ
4 tiene efectos supresores tumorales en el mieloma [38], y Tβ
10 está desregulado en el carcinoma renal de células [39] y el cáncer de ovario [40]. Además, Tβ
10 migración celular inhibida y la formación de tubos de tipo capilar de las células endoteliales de la arteria coronaria humanos [6]. Nuestros resultados también implican Tβ
10 en la degeneración de cáncer, como el alto nivel de Tβ
10 transcripciones en ovario normal se redujo notablemente en los carcinomas de ovario. Por otra parte, se aceleró la expresión ectópica de Tβ
10 en líneas celulares de carcinoma de ovario, la proliferación celular reducida y el movimiento, y la apoptosis. Por lo tanto, Tβ
10 sobreexpresión en células de ovario normales parece actuar como un regulador negativo de la carcinogénesis, aunque el mecanismo exacto no está claro. Sin embargo, como Tβ
4 se induce en el cáncer de ovario [34] y juega un papel en el secuestro de actina como Tβ
10, la expresión ectópica de Tβ
10 en nuestro sistema experimental puede conducir a un aumento de la actividad de ß timosinas y posterior perturbación de la dinámica de la actina. Este concepto es apoyado por los informes de que Tβ
4 y Tβ acto
10 en el desarrollo de los vasos de manera complementaria in vivo [6] y que el desequilibrio de la actina G y F-actina causa de células redondeo y la muerte [41 ]. Por lo tanto, se consideró que una posible estrategia para la investigación del cáncer y la terapia génica con Tβ
10. Nosotros, por lo tanto, fabricado de un adenovirus recombinante, Ad.TERT.Tβ
10, para usar para la terapia génica humana y para dilucidar el mecanismo de Tβ
10 en la prevención del cáncer de ovario.
sistemas de adenovirus recombinante son versátiles para estudios de expresión génica y aplicaciones terapéuticas, y muchos investigadores han utilizado los adenovirus recombinantes con gran éxito en los últimos años. Sin embargo, su baja especificidad es una desventaja que limita la utilidad de estos vectores como
in vivo
agentes terapéuticos. Los vectores que combinan una alta infectividad con la expresión de células específicas de cáncer son, por lo tanto, se necesitan. Varios estudios han demostrado que la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) es altamente expresado en la mayoría de los tejidos tumorales pero no en los tejidos normales. Por ejemplo, la actividad del promotor de hTERT es mayor en las células cancerosas humanas y murinas derivadas de pulmón, colon, hígado, mama, ovario y cerebro [42] - [47]. Por el contrario, han demostrado que el promotor de hTERT es inactivo en los fibroblastos normales humanos [42], y las células epiteliales humanas normales de la tráquea [42], de mama [47], y ovario [45], [48]. Por lo tanto, hemos examinado el papel de Tβ
10 en el cáncer de ovario utilizando un adenovirus recombinante (Ad.TERT.Tβ
10). Ad.TERT.Tβ
10 se construyó mediante la inserción del gen Tβ 10
bajo el control del promotor de hTERT en el plásmido de adenovirus p-lanzadera para obtener la expresión específica del cáncer, y se comparó con Ad.TERT .LacZ como control. En un modelo de co-cultivo de células primarias humanas del cáncer ovárico y fibroblastos normales, β-galactosidasa dirigido por el promotor de hTERT se expresó en células de cáncer de ovario solamente, pero no en los fibroblastos normales. cambios morfológicos citotóxicas y apoptóticas estaban ausentes de los fibroblastos normales tratados con 10 MOI de Ad.TERT.LacZ durante un período de 7 días, en contraste con la apoptosis específica del cáncer de ovario inducida por el tratamiento de las células con 10 MOI de Ad.TERT. Tβ
10 durante un período de 10 horas. Por otra parte, se encontró que la expresión específica del cáncer de Tβ
10 de Ad.TERT.Tβ
10 fue acompañada por la elevada expresión de Fas, lo que resulta en la apoptosis específica del cáncer. Por lo tanto, consideramos que el efecto anticancerígeno de Ad.TERT.Tβ
10 parece estar asociado con la sobreexpresión de Tβ
10 en lugar de la toxicidad no específica viral.
Los estudios anteriores han informado de que un alto nivel de ROS tiene un efecto positivo en el desarrollo del cáncer y la proliferación [49] - [56]. Sin embargo, encontramos que el secuestro de actina por la sobreexpresión de Tβ
10 era debido a la disfunción mitocondrial y la elevación de ROS, por el que se activó la apoptosis de señalización. La idea de que las células cancerosas son vulnerables al ataque de ROS se apoya en el uso terapéutico de fármacos anticancerosos ampliamente aceptadas, tales como taxol y cisplatino. Ambos de estos medicamentos incrementan la generación de ROS en 2774, y el tratamiento concomitante de agentes contra el cáncer con Tβ
10 resultan en un efecto aditivo de ROS elevación y posterior inducción de la apoptosis. Por lo tanto, el destino de la célula de cáncer parece estar determinada por el equilibrio ROS. leve elevación de ROS puede ayudar el desarrollo del cáncer, pero la elevación excesiva de ROS en las células cancerosas bajo algunas tensiones tales como Tβ
10 sobreexpresión y tratamiento de medicamentos contra el cáncer parece estimular las señales de apoptosis.
Además de la inducción de la apoptosis , Tβ
10 sobreexpresión reduce potentemente la motilidad de las células de cáncer de ovario 2774, y este efecto fue independiente de la inducción de la apoptosis. En las 2774 células de cáncer de ovario, se indujo apoptosis mucho más tarde que en las células de cáncer de ovario primario. Ad.TERT.Tβ
apoptosis en células de cáncer de ovario primario 10-inducida y inmortalizado líneas celulares de cáncer, tales como 2774, OVCAR3, y SKOV3, se produjo 10- y 48-horas más tarde, respectivamente. Como se llevaron a cabo los ensayos de la invasión y la migración antes de la observación de la apoptosis, sugerimos que Tβ
10 sobreexpresión en cáncer de ovario puede tener efectos de destrucción celular beneficiosos de células tumorales primarias así como las células metastásicas.
nuestros hallazgos indican que la actividad anti-cáncer de Tβ
10 puede ser debido a la generación de ROS. Además, Tβ
10 y contra el cáncer agentes, tales como taxol y cisplatino, tuvieron un efecto sinérgico sobre la muerte de células cancerosas. También se encontró que la sobreexpresión específica del cáncer de Tβ
10 dirigido por el promotor de hTERT resultó en apoptosis cáncer selectivo a través de la amplificación de la señalización de FAS. Este estudio proporciona información sobre el mecanismo que subyace a los efectos anticancerígenos de Tβ
10 en el ovario, que puede resultar útil para el desarrollo de terapias contra el cáncer de ovario eficaces y sin efectos secundarios.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
las obras utilizando muestra humana se recibió el consentimiento por escrito de un paciente y aprobados por la Asociación coreana de la Junta de Revisión Institucional (KAIRB).
Líneas celulares y cultivo de células primarias
la línea celular de cáncer de ovario humano 2774 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC), y células de cáncer de ovario y de fibroblastos humanos primarios fueron aisladas de pacientes con grado III adenocarcinoma endometrioide (cáncer) y co-cultivaron en superficies de vidrio. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EE.UU.), y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen ).
vectores virales
el adenovirus recombinante, "Ad.TERT.Tβ
10", fue construido de acuerdo con el procedimiento estándar usado en el sistema de vector adenoviral AdEasy ™ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.).