Extracto
Los antígenos de cáncer de testículo-MAGE (CTA) son candidatos atractivos para la inmunoterapia. El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de expresión, la inmunidad humoral y la importancia pronóstica de MAGE CTA en el cáncer de ovario epitelial humana (EOC). expresión de ARNm o proteína de frecuencias se determinaron para MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 y C1 (CT7) en muestras de tejido obtenidas de 400 pacientes con EOC. La presencia de anticuerpos autólogos contra los antígenos MAGE se determinó a partir de 285 muestras de suero. Se estudiaron las relaciones entre la expresión de MAGE, la inmunidad humoral a antígenos MAGE, y las características clínico-patológicas. Las frecuencias individuales de expresión fueron los siguientes: A1: 15% (42/281), A3: 36% (131/390), A4: 47% (186/399), A10: 52% (204/395), C1 : 16% (42/267). expresión concordante fuerte se observó con MAGE-A1: -A4, MAGE-A1: C1 y MAGE-A4: -A10 (
p Hotel & lt; 0,0005). La expresión de antígenos MAGE-A1 o -A10 dio lugar a pobre supervivencia libre de progresión (PFS) (OR 1,44; IC 1.1 a 2.4,
p = 0,044
y OR 1,3, IC 1,03-1,64,
p
= 0,03, respectivamente); mientras que, la expresión de MAGE-C1 se asoció con una mejora de la SSA (OR 0,62; IC 0,42-0,92,
p = 0,016
). Los PFS mejoradas observadas para la expresión MAGE-C1, fue disminuida por co-expresión de MAGE-A1 o -A10. Espontánea inmunidad humoral a los antígenos MAGE estaba presente en un 9% (27/285) de los pacientes, y esto predice pobre supervivencia global (log-rank test
p = 0,0137
). Estos hallazgos indican que MAGE-A1, MAGE-A4, MAGE-A3, y MAGE-A10 son prioritarios objetivos atractivos para la inmunoterapia polivalente en pacientes con cáncer de ovario
Visto:. Daudi S, Ing KH, Mhawech-P Fauceglia , Morrison C, Miliotto A, Beck A, et al. (2014) Expresión y la respuesta inmune a los antígenos MAGE predecir la supervivencia en el cáncer ovárico epitelial. PLoS ONE 9 (8): e104099. doi: 10.1371 /journal.pone.0104099
Editor: Sophia N. Karagiannis, el Kings College de Londres, Reino Unido
Recibido: 22 de abril de 2014; Aceptado: 7 Julio 2014; Publicado: 7 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Daudi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto de Investigación del Cáncer Grupo de Trabajo cáncer de ovario Grant, vacuna contra el cáncer de Colaboración Grant, del Instituto de Investigación del Cáncer y el Instituto Ludwig para la investigación de cáncer, Anna-Maria Kellen Premio Investigador clínico del Instituto de Investigación del cáncer (a Kunle Odunsi), Institutos nacionales de Salud 5T32 CA 108456, Institutos nacionales de Salud y R01CA158318-01A1 Roswell Park cáncer Institute-Universidad de Pittsburg Instituto de cáncer cáncer de ovario Programa especializado de investigación de Excelencia Institutos nacionales de Salud P50CA159981-01A1. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción cáncer de ovario
epitelial (EOC) representa la neoplasia ginecológica más letal en mujeres. A pesar de los considerables esfuerzos dirigidos a la detección precoz y la mejora de las tasas de respuesta, la mayoría de las mujeres se presentan con enfermedad diseminada en el momento del diagnóstico inicial, tienen una tasa de recaída inaceptable de aproximadamente el 85% y una supervivencia global a los 5 años del 20-30% [1], [ ,,,0],2]. En consecuencia, se necesitarán estrategias de tratamiento específicas, tales como la inmunoterapia para mejorar el resultado clínico de los pacientes con cáncer de ovario.
El desarrollo de la inmunoterapia con éxito requiere la caracterización de antígenos asociados a tumores (TAA) que se expresan habitualmente en los ovarios tumores, con un patrón de expresión restringido en los tejidos normales. Por otra parte, el antígeno ideal debería exhibir una alta frecuencia de expresión en el cáncer y las pruebas de inmunogenicidad. TAA candidato se identifica a menudo en pacientes con fuertes respuestas inmunes celulares y /o humorales que indican robusta inmunogenicidad inherente a estos antígenos [3] - [5]
Los antígenos del cáncer de testículo (CTA) son una subclase de TAA. codificada por aproximadamente 140 genes. A pesar de su función biológica mal caracterizado, se sabe que la expresión de estos antígenos estar restringido en sitios privilegiados inmunes tales como los testículos, placenta y ovario fetal, pero no en otros tejidos normales. La expresión anormal de estos genes de la línea germinal en los tumores malignos puede reflejar la activación de un silenciado "programa gametogénico", que en última instancia conduce a la progresión tumoral y amplia inmunogenicidad [6]. La inmunogenicidad de CTA ha llevado al desarrollo generalizado de vacunas contra el cáncer dirigidas a estos antígenos en muchos tumores sólidos. Dentro de esta amplia clase de TAA, los antígenos asociados al melanoma (MAGE) han surgido como candidatos prometedores para la inmunoterapia del cáncer [7] - [9].
Más de 30 cáncer de testículo (CT) genes han sido reportados como miembros de las familias de múltiples genes que se organizan en grupos de genes en el cromosoma X (antígenos CT-X). Los grupos de genes CT están situados entre Xq24 y Xq28 e incluyen las familias de genes, tales como MAGE y NY-ESO-1 [10]. Tipo grupos de genes MAGE I son los más ampliamente caracterizada e incluyen el MAGE-A, MAGE-B y las familias MAGE-C. Las proteínas MAGE-A son codificadas por 12 miembros de la familia MAGE-A de genes diferentes (MAGE-A1 para MAGE-A12) y están definidos por una base de ácido amino 165-171 conservado, llamado el dominio MAGE homología (MHD). El MHD corresponde a la única región de aminoácidos compartidos por todos los miembros de la familia MAGE-A. MAGE-C1 /CT7 es estructuralmente diferente de MAGE-A de la familia, con un producto de proteína de 1142 aminoácidos (frente a & lt; 400 residuos para las proteínas MAGE-A) que contiene una secuencia de repetición en tándem que está ausente en MAGE-A [ ,,,0],11].
en el presente estudio, hemos analizado la expresión y la inmunogenicidad de un panel de cinco MAGE CTA en una gran cohorte de pacientes con cáncer de ovario. Además, hemos examinado la relación entre la expresión coordinada de los genes MAGE y los resultados clínico-patológica.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
incluidas en parafina fijados con formalina (FFPE; para inmunohistoquímica) y se congelaron muestras de tejido (por PCR con transcriptasa inversa) se obtuvieron de 400 pacientes sometidos a cirugía citorreductora de ovario, peritoneal primario y el cáncer de la trompa de Falopio en el Instituto Roswell Park cáncer (Buffalo, NY) entre 1992 y 2008. identificamos, y nos referimos a estos tres tipos de cáncer como el COE debido a su origen común en el epitelio de los conductos de Müller. Todas las muestras de tejido fueron recogidos bajo un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional (IRB) de Roswell Park Cancer Institute. Los pacientes firmaron un aprobado por el IRB consentimiento informado por escrito, y éstas se presentaron en la oficina del IRB. Todas las muestras de patología fueron revisados en nuestra institución, y el subtipo histológico de los tumores se clasifican de acuerdo con las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) [12], [13]. El estadio y el grado de los tumores fueron evaluados de acuerdo con la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) [14], [15]. En un subgrupo de los pacientes, se recogieron muestras de suero en el diagnóstico. Las historias clínicas de estos pacientes fueron revisados a posteriori en virtud de un protocolo junta de revisión institucional aprobado. La revisión incluyó tratamiento ambulatorio y hospitalario. Los resultados del estudio incluyeron la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de progresión (SLP). Ambos criterios de supervivencia se miden desde el momento del diagnóstico. La recurrencia se definió mediante criterios objetivos como todos los tratamientos se dio en el contexto adyuvante. La duración de OS era el intervalo entre el diagnóstico y la muerte. PFS representa el intervalo entre el diagnóstico hasta la progresión de la enfermedad, la recurrencia o la muerte. El tiempo de observación fue el intervalo entre el diagnóstico y el último contacto (muerte o el último seguimiento). Los datos fueron censurados en la última visita de seguimiento para los pacientes sin evidencia de recurrencia, progresión o muerte.
ARN total de tejidos Aislamiento
ARN de tejido total se aisló de los tejidos tumorales congelados por el uso de el Reactivo TRI (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Potencialmente ADN contaminante se eliminó por tratamiento con RNasa libre de DNasa I (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania), seguido por extracción con fenol /chroloform. El ARN se disolvió en RNasa libre de H
2O. La concentración de ARN resultante se midió espectrofotométricamente (DU500 Espectrofotómetro, Beckman Coulter, Fulleron, CA, EE.UU.), y la calidad del ARN se comprobó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
transcriptasa inverso-PCR Análisis de MAGE -A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 y la expresión de MAGE-C1
Dos microgramos de cada muestra de ARN se utilizaron para generar ADNc con la transcriptasa inversa-PCR Ready-To-Go (RT- PCR) perlas (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). ARN a partir de tejido testicular normal (Clontech, Mountain View, CA) se utilizó como control positivo. PCR se realizó posteriormente para estudiar la expresión de MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 y C1 en 305 pacientes con EOC. Gliceraldehído-3-phosphodehydrogenase (GAPDH) se utilizaron cebadores como una prueba para la integridad del ARN. Tabla S1 enumera las secuencias de cebadores para cada gen y su respectiva longitud amplicón. Las condiciones de amplificación de todos los productos de genes fue 5 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos que consistían en 1 min a 95 ° C, 1 min a 60 ° C, y 1 min a 72 ° C. Estos ciclos fueron seguidos por una etapa de elongación 6-min a 72 ° C (BioRad iCycler, BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los productos de PCR se separaron sobre un gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron con bromuro de etidio en un transiluminador ultravioleta (IS-4400 ChemiImager, Alpha Innotech, San Leandro, CA). Las intensidades de los productos de PCR fueron heterogéneos, y algunos especimenes produjeron bandas amplicón única débiles. Estos se puntuaron positivo sólo si el resultado podría ser reproducido por una extracción de ARN y repetida específica de RT-PCR a partir de la misma muestra de tumor. Los casos con muy bajos niveles de transcripción que no eran de forma reproducible positivo no se consideran positivos. bandas de productos de PCR se escindieron del gel de agarosa y el ADN asociado se aisló con el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Las muestras de ADN se sometieron a secuenciación para verificar el producto de PCR.
Análisis inmunohistoquímico de MAGE-A3, MAGE-A4 y MAGE-A10 Expresión
inmunohistoquímica (IHC) el análisis se realizó utilizando tejidos FFPE de 304 pacientes de microarrays de tejidos (TMA). TMA se construyeron usando 0,6 mm núcleos de tejido FFPE perforadas de cada bloque donante. Para superar la heterogeneidad del tumor, se seleccionaron tres núcleos representativas de cada tumor. Los 4 núcleos de tejido micras de espesor se desparafinaron y tratados previamente con una solución específica de recuperación de antígeno (DakoCytomation, Carpenteria, CA) durante 20 minutos. Los portaobjetos se enfriaron durante 20 minutos y después se trató en 3% H
2O
2 para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Las diapositivas TMA se incubaron a continuación con un bloque de proteína sin suero (DakoCytomation, Carpenteria, CA) durante 30 minutos. Tabla S2 se enumeran los anticuerpos y condiciones IHC. conejo MAGE-A3 anti-humanos de anticuerpos policlonales (LS-B4662, vida útil Biosciences, Inc.) fueron adquiridos comercialmente. Anti-MAGE-A4 MAB (clon: 57b) y anti-MAGE-A10 (clon: A3) sobrenadantes de hibridoma se producen en el Hospital Universitario de Basilea (Basilea, Suiza) [16], [17]. IgG de conejo o IgG1 de ratón (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó como el isotipo negativo emparejado control. Marcado biotina estreptavidina (LSAB +) los reactivos (DakoCytomation, Carpenteria, CA) se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seguido de un 3,3'-diaminobencidina (DAB) + (DakoCytomation, Carpenteria, CA) de incubación. Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina. Un corte de células tumorales positivas 5% se utilizó para definir la expresión positiva.
Se realizó medición de anticuerpos en el suero por ELISA
El análisis serológico de la respuesta inmune humoral como se describe anteriormente [18]. 285 muestras de suero de un subconjunto de los pacientes se analizaron por ELISA para serorreactividad a las proteínas recombinantes de longitud completa producidos por bacterias MAGE-A1, -a3, -A4, -A10 o C1. Como un antígeno de control negativo, la proteína de la dihidrofolato reductasa recombinante fue preparado y utilizado en cada ensayo. El suero se diluyó en serie de 1:100 - 1:100,000 y se añade a bajo volumen placas de 96 pocillos (Corning) recubiertas durante la noche a 4 ° C con el antígeno 1 mg /ml en 25 l y se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con PBS que contiene 5% de leche descremada. Después de la incubación durante la noche, las placas se lavaron extensamente con PBS que contenía 0,2% de Tween 20 y se enjuagaron con PBS (BioTek ELx405 lavadora automatizada). Serum IgG unida a antígenos se detectó con anticuerpos IgG anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Biotech Sur). Después de la adición de sustrato ATTOPHOS (Fisher Scientific), la señal fluorescente se midió utilizando un lector de fluorescencia 4000 Series Cytofluor (PerSeptive Biosystems). A título recíproco se calculó para cada muestra de plasma como la dilución máxima todavía reaccionar significativamente a un antígeno específico. La especificidad se determinó mediante la comparación de serorreactividad entre los diversos antígenos de la prueba. En cada ensayo, los sueros de los pacientes con reactividad conocida se utilizaron como controles. Un resultado positivo se definió como títulos recíprocos & gt;. 100
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos fueron generados utilizando el software SAS (SAS System Copyright 2002 SAS Institute Inc. v.9.2) y la R 2.15.3 lenguaje de computación estadística. Un nivel de significación nominal de 0,05 se utilizó en todos los ensayos. El uso de una tabla de contingencia 2 × 2, se determinó el nivel de concordancia entre los diferentes perfiles de expresión de genes MAGE. Las distribuciones de MAGE-A1, -A3, -A4, -A10 y expresión C1 y el resultado clínico se analizaron por la prueba de suma de Wilcoxon Rango o Chi cuadrado de Pearson. El análisis multivariado de predictores independientes de la supervivencia se analizaron utilizando el modelo de riesgos proporcionales de Cox [19]. distribuciones de supervivencia estimadas fueron calculadas por el método de Kaplan y Meier [20], y las pruebas de significación con respecto a las distribuciones de supervivencia se basan en la prueba de log-rank. el pronóstico relativo se resumió con las estimaciones y los límites de confianza del 95% para la razón de riesgo (HR). No se hicieron ajustes para comparaciones múltiples. Un árbol filogenético se construye por una distancia de Manhattan, la expresión como cero (ausente) y uno (actual) de codificación, y el vecino estándar unirse algoritmo.
Resultados
Población de estudio
Un total de 400 tejidos de pacientes con ovárico, peritoneal primario y el cáncer de tubo de Falopio se investigaron por RT-PCR y IHC. Las características de los pacientes de este estudio se presentan en la Tabla 1. La edad media de la muestra del paciente fue de 63 (rango: 21-93), con una duración media de seguimiento de 35 meses (rango: 1-176 meses) . Como era de esperar, la mayoría de los pacientes presentaban enfermedad en etapa avanzada (82%), los tumores pobremente diferenciados (74%) y con la histología serosa (64%). enfermedad sensible Platinum se demostró en 182 de los 400 pacientes (46%), con 116 pacientes que tienen resistencia de platino (29%), y 16 pacientes con una respuesta refractario de platino (4%). La mediana de la SG para todos los pacientes fue de 40 meses (rango: 0-173), mientras que la mediana de la SLP fue de 12 meses (rango: 0-160).
La expresión de MAGE-A1, MAGE-A3 , MAGE-A4, MAGE-A10 y MAGE-C1 en cáncer de ovario
la expresión de antígenos MAGE se evaluó tanto por RT-PCR y IHC para la mayoría de los pacientes de los que se disponía de muestras adecuadas. La expresión de MAGE-A4 y MAGE-A10 se detectó concordantemente por ambos métodos (r = 0.31, OR = 3,88, p & lt; 0,001; r = 0.14, OR = 2,00, p & lt; 0,001, respectivamente), pero los resultados MAGE-A3 no fuera reproducible concordantes (r = -0.06, OR = 0,86, p = 0,9198), debido a una baja tasa de detección (Tabla S3). A menos que se indique lo contrario, se procedió mediante la clasificación de los tejidos como antígeno positivo si se identificaron mediante RT-PCR o IHC (Tabla 2). En consecuencia, si se consideran todos los tejidos 400 muestras analizadas por RT-PCR o IHC en este estudio, las frecuencias de MAGE-A3, -A4 y -A10 expresión mediante cualquiera de los métodos fueron del 36% (131/390), 47% (186/399 ) y 52% (204/395) de los tejidos, respectivamente (Tabla 2). MAGE-A1 y C1 demostraron la frecuencia más baja de la expresión en 15% (42/281) y 16% (42/267), respectivamente. Tabla S3 es un resumen de la frecuencia de MAGE ARNm y la expresión de proteínas en muestras tumorales de los pacientes EOC.
MAGE-A3, -A4 y -A10 no mostraron inmunotinción en los tejidos normales (figuras 1A -C), pero inmunotinción intensa en los testículos (Figs.1D-F). El patrón de tinción era citoplásmica y nuclear para MAGE-A3 y A-4, y difusa tinción citoplásmica para MAGE-A10 (Figs.1G-I).
Las muestras fueron teñidas con anticuerpo policlonal para MAGE-A3 (X20 ), los clones 57b y sobrenadantes de hibridoma A3 en el MAGE-A4 y MAGE-A10, respectivamente (x15). Las muestras de ovario normal y testículo se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. A-C: La tinción de la ovario normal que no muestran reactividad. D-F: La tinción de los testículos que muestra túbulos seminíferos con una fuerte tinción intratubular, y reactividad no específica ausente. G-I:. La tinción de tumor de ovario que demuestra una fuerte citoplasmática y /o patrones de tinción nuclear
Co-expresión de MAGE-A y MAGE-C1 en cáncer de ovario
Las frecuencias de co-expresión de los antígenos MAGE, se muestran en la Tabla 2. La mayor frecuencia de co-expresión se observó para -A4: -A10 (29%). Mientras que ambos son relativamente raros, el antígeno de la familia MAGE-C (C1) tendía a ser co-expresada con MAGE-A1 [OR 4,4, p = 0,00015, CI 3.6 a 5.2], y que se expresa de forma independiente con el otro MAGE A los antígenos de la familia (Figura 2a). MAGE-Una familia antígenos -A1: -A4 [OR 3,7, p = 0,0003, 3,0-4,4] y -A1:-A3 [OR 2,8 p = 0,0022, IC 2.2 a 3.5] tiene el más fuerte co-expresión; casi cada par está asociado a excepción de -A1: -A10 (OR = 1,2, p = 0,7 IC 0.6-1.8) lo que sugiere que se expresan de forma independiente. Para caracterizar el patrón de expresión MAGE multivariante, se ha creado el árbol filogenético en la figura 2b, en el que cada hoja que termina en un gráfico circular simboliza una persona o grupo de personas. Hay dos patrones distintos de expresión que se observan. El gen MAGE-A4 dirige un patrón de expresión importante (más bajos clados de la derecha), y más tarde se convierte en MAGE-A3 y -A10 expresión en esta población de pacientes. El segundo patrón de expresión único consiste en una expresión independiente de MAGE-A3 y -A10, que luego se convierte en -A4 (clados superior derecha). En marcado contraste, la expresión de MAGE-C1 rara vez aparece sola y surge esporádicamente en todo el árbol filogenético. Del mismo modo, MAGE-A1 aparece con poca frecuencia y raramente en el clado MAGE-A10. Estas observaciones se traducen en fuertes implicaciones clínicas dentro de esta gran cohorte de estudio.
(A) MAGE-A1 es co-expresada con-A3 o -A4 o C1. MAGE-A3 es co-expresada con -A10. MAGE-A4 es co-expresada con MAGE-A10. La intensidad de color más oscuro representa un significado más fuerte. Las asociaciones más fuertes son entre MAGE-A1 a -A4, MAGE-A1 a C1 y MAGE-A1-A3 a. La odds ratio (OR) mayores de 1 implican los antígenos tienden a aparecer juntos. (B) Árbol filogenético para la expresión de MAGE. Cada hoja que termina en un gráfico circular simboliza una persona.
Correlación de la expresión del antígeno MAGE con el resultado clínico
Se investigó la relación entre la expresión de MAGE y los parámetros clínico-patológicos. Hemos encontrado que MAGE-A3 y A4 no tuvieron efectos pronósticos individuales. En consecuencia, nos hemos centrado en un análisis más detallado de MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-C1 y otros factores de pronóstico clínico-patológicos conocidos en el cáncer de ovario.
Solo, la expresión de MAGE-A10 (204/395, 52%) se asoció con un peor resultado clínico (mediana de la SLP 8.8 [07.02 a 12.03] frente a 15,5 [13.6-18.4] meses,
p = 0,009
; OS 37,8 [28,2-45,0] frente a 45,0 [39,8-52,2] meses, p = 0,0781). La co-expresión con MAGE-C1 (25/204, 12%) invirtió esta tendencia de la SSP, pero no OS: A10 (+) /C1 (-) pacientes tuvieron la mediana de SLP de 7,9 meses (7.0-12.1) frente a A10 (+) /C1 (+) 13,1 meses (CI9.5-29.9). Estratificado en cuatro grupos basados en A10 patrón de expresión /C1, este patrón se mantiene (log-rank test, p = 0,0133) y sugiere que A10 (-) /C1 (+) expresión puede ser de protección (mediana de la SLP 20 [15.7-NA] meses ) (Fig. 3).
curvas de supervivencia general para los grupos de pacientes en base a MAGE-A10 y la expresión C1. la expresión de MAGE-C1 predice una mejor supervivencia libre de progresión y una tendencia hacia una mejora en la supervivencia global. La expresión de MAGE-A10 amortigua los resultados de supervivencia al grado de pacientes con expresión de MAGE negativo.
Los patrones de expresión no se asociaron de forma conjunta con la edad (p = 0,900), etapa (p = 0,1373), grado ( p = 0,4532), la histología (p = 0,737), el sitio primario (p = 0,744) o de reducción de volumen de estado (p = 0,112) (Tabla 3). expresión MAGE-C1 se asoció con enfermedad sensible al platino (28/38, 74% vs. 70/142, 49%; p = 0,009) y la respuesta clínica (30/38, 79% frente a 92/164, 56%, p = 0,015).
a pesar de que nos hemos centrado en MAGE-A10, al menos prevalente MAGE-A1 (42/281, 15%) fue también ligeramente asocia con resultados más pobres de supervivencia (PFS media 10,3 [6.2- 15,0] frente a 12,8 [10.5-15.7] meses
p = 0,043
, OS 38,7 [20,3-78,4] frente a 41,3 [36.5-46.6] meses p = 0,607). Para la SLP, MAGE-A1 co-expresión con A10 es redundante (estratificado prueba de log-rank p = 0,57), sin embargo A1 (+) /A10 (-) pacientes tienen pronóstico ligeramente más pobre (PFS media 12,7 [5,3-36,6] frente a 16,3 [14.1-19.4] meses, p = 0,0187). Para modelar los tres antígenos de forma conjunta, se recomienda considerar la expresión de cualquiera de la A1 o A10 antígeno junto con la expresión de MAGE-C1; el efecto no es significativamente diferente de la estratificación presenta en la Tabla 3.
Correlación de la respuesta de anticuerpos a la MAGE antígeno con el resultado clínico
ELISA para anticuerpos MAGE suero específicas de antígeno se realizó en muestras de suero obtenido al momento del diagnóstico de 285 de los 400 pacientes EOC (Tabla 2). Se observó una respuesta humoral inducida espontáneamente a por lo menos un MAGE-A antígeno en un 9% (27/285) de los pacientes de los cuales el 85% (23/27) también expresa un antígeno MAGE-A. La respuesta serológica a cualquier antígeno MAGE se distribuye por igual entre todos los parámetros clínico-patológica (Tabla 4). La presencia de respuesta inmune humoral a cualquiera de los antígenos MAGE predijo una peor supervivencia global (mediana de la SLP 12,3 [6,4-19,7] vs. 13,5 [10.9-16.5] meses, p = 0,231; mediana OS 27,8 [17,3-52,2] 45,4 vs [40.2-51.9] meses, p = 0,002) (Figura 4).
curvas de supervivencia general para los grupos de pacientes en base a la presencia de autoanticuerpos anti-MAGE. La respuesta humoral a cualquier antígeno MAGE predice la supervivencia global pobre, y ninguna asociación significativa con la supervivencia libre de progresión.
Discusión
La inmunoterapia es un enfoque prometedor para mejorar las tasas de supervivencia y clínica los resultados en pacientes con cáncer de ovario [21] - [23]. Entre los posibles objetivos de antígeno tumoral, CTA son considerados como los candidatos más prometedores para el desarrollo de vacunas contra el cáncer. Para evaluar la utilidad de la CTA familia MAGE como dianas para la inmunoterapia específica en la EOC, se llevó a cabo el presente análisis exhaustivo sobre un gran panel de los tumores de ovario. Nuestros resultados indican expresión aberrante de MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10 y MAGE-C1 en 15%, 36%, 47%, 52% y 16% de las muestras de EOC, respectivamente. Además, se encontró que teniendo en cuenta cualquiera de estos antígenos MAGE, aproximadamente el 78% mostró una expresión de al menos uno de estos cinco antígenos CT. Por otra parte, MAGE-A1 y la expresión de MAGE-A10 se asociaron con un mal resultado clínico, mientras que MAGE-C1 /CT7 se asoció con una mejor supervivencia.
La frecuencia de expresión de MAGE en EOC que nos informe es generalmente concuerda con el reportado para la mayoría de los otros tumores, excepto para el melanoma y el cáncer no microcítico de pulmón de células [16], [24]. La expresión de MAGE-A3 mRNA se ha encontrado en el 10-40% de varios tipos de tumores, incluyendo la vejiga [25], de mama [26] y el mieloma múltiple [27]. Con respecto a EOC, la frecuencia de MAGE-A1 y expresión -A3 que nos informe es similar a la reportada en estudios previos, con la excepción de Zhang
et al
que encontró una expresión 54% y 37% en tejidos de cáncer de ovario, respectivamente [28] - [30]. Esto puede reflejar diferencias en las poblaciones de estudio, ya que había muchos más tumores en etapa temprana que nuestro grupo de estudio. En un estudio anterior, la expresión de MAGE-A4 correlacionado negativamente con la supervivencia o indirectamente a los factores de pronóstico establecidos en el cáncer de ovario [31]. De acuerdo con estos estudios, nuestros resultados demuestran una clara asociación para la expresión de MAGE y el pronóstico. En este sentido, mientras que MAGE-A1 y la expresión MAGE-A10 se asociaron con un mal resultado clínico, MAGE-C1 se asoció con una mejor supervivencia. Estos resultados contrastantes de supervivencia entre las diferentes familias de antígeno MAGE plantean muchas preguntas esenciales sobre el papel de los genes MAGE en la tumorigénesis, la invasión y la metástasis en EOC.
En general, los antígenos MAGE se expresan con mayor frecuencia en pacientes con enfermedad avanzada y los pobres resultados, lo que indica que su expresión podría contribuir a la tumorigénesis [26], [32] - [37]. Varios estudios han demostrado que las proteínas MAGE son críticos para la supervivencia celular, aumentando las propiedades tumorigénicas de las células y, por tanto, pueden contribuir activamente al desarrollo de tumores malignos [38] - [40]. Además, dado que la expresión de antígenos CT se ha asociado con la transformación tumorigénico de las células madre del cáncer [41], es posible que MAGE-A1 y MAGE-A10 que expresan las células de cáncer de ovario representan una población con propiedades de células madre auto-renovación, y por lo tanto más resistente a la eliminación inmune o la quimioterapia.
a diferencia de MAGE-A1 y MAGE-A10, el posible mecanismo (s) por el que la expresión de MAGE-C1 /CT7 confiere un beneficio de supervivencia es menos clara. En la comparación de la estructura de la proteína de los miembros de la familia MAGE, mientras que el primer y el segundo dominios están muy conservadas entre el MAGE-A y miembros de la familia -C, la proteína MAGE-C1 lleva una característica única. Además de un segmento de MAGE-homóloga ácido 275-amino en su C-terminal, MAGE-C1 /CT-7 tiene una región de ácido 867-amino compuesto de tres tipos de repeticiones en tándem en su N-terminal [11]. Esta región puede ser de gran importancia como la secuencia de la proteína repetitiva puede dar forma a los epítopos presentados para su reconocimiento inmune de MAGEC1 /TC-7 y, potencialmente, de ese modo determinar la calidad de las respuestas inmunes resultantes.
Además, nuestros resultados indican que los pacientes con anti-MAGE inmunidad humoral tenían peor pronóstico. Estos hallazgos no implican necesariamente que el anti-MAGE respuestas inmunes dañan directamente los resultados del tratamiento en pacientes con cáncer de ovario. Dado que la densidad del antígeno presentado por las células presentadoras de antígeno
in vivo
afecta diferencialmente la generación de humoral anti-tumor y respuestas de células T [42], se propone que los pacientes que desarrollaron respuestas inmunes espontáneas son los que tienen alta densidad del antígeno porque de la carga de enfermedad avanzada, y por lo tanto con un peor pronóstico. Estos pacientes son todavía susceptibles de beneficiarse de la inmunoterapia MAGE-dirigido debido a que sus anti-MAGE-A en curso de la respuesta inmune no son eficaces. En un estudio previo de las respuestas inmunes humorales espontáneas contra el antígeno NY-ESO-1 CT, el impacto de la inmunidad humoral fue neutral en el pronóstico de los pacientes [43].
Debido a que la expresión de antígenos MAGE está regulada por mecanismos epigenéticos tales como metilación y acetilación de histonas, razonó que la expresión del antígeno MAGE en tumores puede ser el resultado de la activación de un programa de expresión génica coordinada, en lugar de una serie de eventos independientes [6]. El uso de métodos analíticos, el presente estudio identificó significativa co-expresión entre los antígenos MAGE. Estos resultados apoyan la idea de que el cáncer de ovario adquiere un perfil de transcripción gametogénico, en el que genes silenciados típicamente se activan ahora que conduce a la progresión del tumor. Nuestros resultados indican que MAGE-A4 es el gen central que dirige el patrón de expresión de los otros genes, con MAGE-C1 solamente emergente esporádicamente en el árbol filogenético. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que MAGE-A1, C1 y -A10 son posibles factores pronósticos del cáncer de ovario, con MAGE-A1 y A-10 asociado con un mal pronóstico; y MAGE-C1 /CT7 asocia con un mejor pronóstico. Proponemos MAGE-A1 y MAGE-A10 como objetivos prioritarios para la inmunoterapia en el cáncer de ovario. Desde MAGE-A4 exhibe una frecuencia relativamente alta de expresión, y parece dirigir un patrón importante de co-expresión de otros antígenos MAGE (Fig. 2b), también proponer MAGE-A4 como un objetivo prioritario para la inmunoterapia del cáncer de ovario.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Los cebadores para los genes MAGE para RT-PCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
anticuerpos MAGE y condiciones para IHC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s002 gratis (DOCX) sobre Table S3. estado antígeno MAGE
en cáncer de ovario
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104099.s003 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer a Erika Ritter y Christina Sedrak, de rama LICR NY, por su excelente asistencia técnica.