Extracto
El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte por cáncer, después del cáncer de pulmón, en los hombres de los países desarrollados. En sus primeras etapas, el crecimiento del tumor primario depende de los andrógenos, por tanto, en general, puede ser controlado por la terapia de privación de andrógenos (ADT). Sin embargo con el tiempo, la enfermedad progresa a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), una forma letal en necesidad de tratamientos más eficaces. receptores acoplados a proteína G (GPCRs) constituyen una gran clan de proteínas de superficie celular que se han implicado como dianas terapéuticas en el crecimiento y la progresión del CaP. Los resultados aquí presentados proporcionan pruebas intrigante de un papel para el nuevo miembro de la familia que se caracteriza GPR158 glutamato en el crecimiento y la progresión del CaP. Se encontró que GPR158 promueve la proliferación celular CaP independiente de receptor de andrógenos funcionalidad (AR) y que esto requiere su localización en el núcleo de la célula. Esto sugiere que GPR158 actúa por mecanismos diferentes de otros GPCRs. expresión de GPR158 es estimulado por los andrógenos y GPR158 estimula la expresión AR, lo que implica un potencial de sensibilizar a los tumores a condiciones de baja de andrógenos durante el ADT a través de un bucle de retroalimentación positiva. Además, encontramos la expresión de GPR158 se correlaciona con un neuroendocrino (NE) fenotipo diferenciación y promueve la formación de colonias de anclaje independiente de lo que implica un papel en la progresión de GPR158 terapéutica y la formación de tumores. GPR158 expresión se incrementó en el frente invasor de los tumores de próstata que se formó en el genéticamente definido condicional
PTEN
modelo de ratón knockout, y co-localizada con AR expresión elevada en el núcleo de la célula. El análisis de Kaplan-Meier en un conjunto de datos desde el portal genoma Memorial Sloan Kettering Cancer mostró que el aumento de la expresión de GPR158 en los tumores se asocia con una menor supervivencia libre de enfermedad. Nuestros resultados sugieren fuertemente que los productos farmacéuticos destinados a las actividades de GPR158 podría representar un enfoque novedoso e innovador para la prevención y gestión de los CRPC
Visto:. Patel N, T Itakura, Jeong S, Liao CP, Roy Burman-P, Zandi E, et al. (2015) Expresión y papel funcional del receptor GPR158 huérfano en el crecimiento del cáncer de próstata y la progresión. PLoS ONE 10 (2): e0117758. doi: 10.1371 /journal.pone.0117758
Editor Académico: Craig N. Robson, Instituto de Investigación del Cáncer del Norte, Reino Unido
Recibido: 7 Agosto, 2014; Aceptado: December 23, 2014; Publicado: 18 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Patel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud subvenciones R01-[] EY09828 a MEF y [R01-CA136924] para GAC. El premio de la Fundación Wright R. E. y mayo de Robert NP y MEF también prestó apoyo para la realización de este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes intereses en competencia. Nitin Patel y Elizabeth M. Fini son co-inventores en una solicitud de patente de Estados Unidos titulado "GPR158 como una nueva diana para el tratamiento del cáncer de próstata" provisional, aplicada por la Universidad del Sur de California (USC). Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
G-receptores acoplados a proteínas (GPCRs) comprenden un clan grande de las proteínas de la superficie celular que realizar diversas funciones celulares. GPCRs detectan información sobre el medio ambiente y típicamente transducen una señal en la célula por la unión y activación de las proteínas G heterotriméricas a ligando extracelular de unión a [1]. Los miembros de este clan han sido ampliamente explotados para el descubrimiento de fármacos y una gran parte de los fármacos utilizados actualmente en los GPCRs objetivo de mercado [2]. Los GPCR se clasifican en siete familias a través de análisis filogenético de su característica definitoria: los siete transmembrana (7TM) de dominio [1]. La familia de glutamato GPCR contiene 7 receptores huérfanos, tres pertenecientes a la rama receptor del ácido gamma-aminobutírico: GPR156, GPR158, y GPR179 [3,4]. GPR179 se demostró recientemente que se requiere para la función celular despolarizante bipolar en la retina, y mutaciones causan autosómica recesiva completa ceguera nocturna congénita estacionaria [5,6]. Dos publicaciones muy recientes proporcionan la primera caracterización de GPR158 [7,8]. La primera expresión GPR158 identificado en las neuronas bipolares de la retina y demostró un papel inusual como un andamio de proteínas de membrana de plasma, el funcionamiento de inhibir la señalización por GPCRs que par con la familia inhibidora de las proteínas Galpha mediante la unión a Gbeta5 y reclutamiento de miembros de la familia R7 de GTPasa Activación las proteínas (BPA) a la membrana plasmática [7]. La segunda publicación era de nuestro laboratorio [8]. Se identificaron expresión GPR158 en células de la malla trabecular (TBM) en las vías de salida del humor acuoso del ojo y su papel en la regulación de la función barrera de células, que posiblemente contribuye a la fisiopatología de la hipertensión ocular y glaucoma inducido por esteroides.
Búsqueda de otra las posibles funciones de GPR158, hemos identificado un estudio de microarrays publicado mostrando GPR158 como uno de los genes regulados positivamente en la ablación del tumor metastásico resistente a andrógenos en comparación con los tumores de próstata primarios [9]. Otro estudio de microarrays de expresión génica mostró baja regulación de GPR158 por la captación de estrógeno en las células del cáncer de mama sensibles a los estrógenos humanos, o por el tamoxifeno (antiestrógeno) de tratamiento [10]. Tal vez no por casualidad, ambos tipos de cáncer implican la respuesta a las hormonas esteroides alterados. El cáncer de próstata (CaP) es la segunda causa principal de muerte por cáncer después del cáncer de pulmón en los hombres de los países desarrollados [11]. Inicialmente, la proliferación de las células de CaP depende de los andrógenos, por tanto, la terapia de privación de andrógenos (ADT) es el principal tratamiento para los pacientes con CaP localmente avanzado. ADT proporciona una remisión de la enfermedad en más de 90% de los pacientes sin embargo, la duración de la respuesta es típicamente de 2-3 años. A pesar del tratamiento ADT, CaP metastásico y vuelve enfermedades recurrentes que no responden a los tratamientos localizados [12], un proceso conocido como resistente a la castración CaP (CRPC). En general, los pacientes CRPC metastásico tienen una mediana de supervivencia de sólo 16-18 meses y la enfermedad sigue siendo incurable [13].
Es un hecho ampliamente reconocido que CRPC se desarrolla a través de múltiples mecanismos, incluyendo los receptores de andrógenos (AR) vías dependientes tales como la amplificación y la sobreexpresión AR [14]; la síntesis de andrógenos locales [15]; alteraciones en la expresión de las proteínas de AR co-activadores y co-represores; y las vías de AR-independientes, como las vías de supervivencia alternativos [16]. Orientación de la vía de AR se ha demostrado que ofrece el método más viable para nuevos agentes terapéuticos desde AR permanece activo en CRPC [17]. Otro posible enfoque terapéutico para el tratamiento del CaP es el fenotipo de células neuroendocrinas (NE). Este tipo de células se produce en focos dispersos dentro de adenocarcinoma de próstata, similar a su distribución dentro de las células epiteliales ductales de la próstata normal. Sin embargo, la densidad de células NE es a menudo mayor en los carcinomas de próstata que en el tejido normal, y los estudios han demostrado que la diferenciación NE (NED) se enriquece en tumores de alto grado y de etapa alta, y estrechamente asociado con la aparición de CRPC [18 -20]. Se cree que las células epiteliales de la próstata a transdifferentiate a las células NE, que se muestran a ser diferente de la población menor de células NE presentes en la próstata normal [18-20]. células NE pueden promover la proliferación de células de adenocarcinoma adyacentes en una condición de andrógenos de hambre, lo que lleva a la CRPC [21], que es apoyado por las observaciones de mayor índice de proliferación de células de CaP proximales a las células NE en comparación con las células de cáncer distal [22, 23]. Además, los estudios de cultivo de células han establecido que neurohormonas y neuropéptidos secretadas por las células NE puede apoyar el crecimiento independiente de andrógenos de células de CaP [24,25]. Sin embargo, el origen exacto y los factores causales de la NED siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, la identificación de nuevos genes y mecanismos moleculares en la conexión de estas vías múltiples responsables de la patogénesis de la CRPC es críticamente necesario para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
CaP se asocia típicamente con alteraciones genéticas que implican sensibilidad de andrógenos y la AR [26] . En este informe, se determinó la expresión, regulación molecular, localización subcelular y el papel funcional de GPR158 utilizando un conjunto de cuatro líneas celulares de CaP humanos con diferentes alteraciones en la AR que resulta en diversos grados de andrógeno-respuesta, andrógenos sensibilidad y la expresión del RA. Combinamos esto con un ratón modelo de CaP y la bioinformática análisis de conjuntos de datos CaP humanos. Nuestros hallazgos sugieren que la elevación de la expresión de GPR158 es un evento oncogénico importante que estimula la proliferación celular y la progresión del CaP y por lo tanto puede representar una diana terapéutica innovadora.
Materiales y Métodos
Cell Culture
células epiteliales de próstata humana primarias (PHPECs) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron, según sus instrucciones, utilizando medio basal de la célula epitelial de la próstata que contiene kit crecimiento celular. Cuatro líneas de células de CaP humanos mantenidos en uno de nuestros laboratorios (Coetzee) fueron utilizados en estos estudios: LNCaP, C4-2B, PC-3 y DU145, todos obtenidos originalmente de la ATCC. células LNCaP y C4-2B se cultivaron en medio RPMI completo, mientras que DU145 y PC-3 células fueron cultivadas en medio DMEM (Gibco-BRL, Bethesda, MA), ambos conteniendo 10% de suero de ternera fetal (FCS) al 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células se dividieron cada 3 días
.
La línea celular LNCaP se estableció a partir de un ganglio linfático humano lesión metastásica de adenocarcinoma de próstata. células LNCaP expresan la AR que porta la mutación T877A común en el dominio de unión al ligando, la creación de una amplia especificidad de unión de esteroides. Son sensibles a andrógenos, que muestra la estimulación del crecimiento cuando son tratados con los andrógenos, y son también dependiente de andrógenos, de someterse a la detención del crecimiento tras la retirada de los andrógenos [27-29]. Las células C4-2B se derivaron de una metástasis ósea que creció en ratones desnudos después de la inoculación con las células, C4-2 resistentes a la castración LNCaP derivados [30,31]. Al igual que las células LNCaP, células C4-2B son sensibles a andrógenos. En consonancia con esto, conservan un AR funcional, aunque muestra menor afinidad por los andrógenos que la AR en las células LNCaP [32]. Sin embargo, a diferencia de las células LNCaP, células C4-2B son insensibles a andrógenos, debido a la retirada de los andrógenos que no se someten a la detención del crecimiento [33]. Las líneas celulares DU145 PC-3 y se establecieron a partir adenocarcinoma prostático humano, metástasis del cerebro o de la médula, respectivamente. Las líneas de PC-3 y DU145 celulares utilizadas en este estudio se caracterizaron previamente por uno de nuestros laboratorios (Coetzee) [34]. Ambas líneas son insensibles a andrógenos y andrógenos insensible. El PC-3
AR + sub-línea empleada en este estudio expresan bajos niveles de ARNm del RA y proteínas. Si bien esto no se traduce en proteína funcional suficiente para conferir la capacidad de respuesta a andrógenos, AR expresión ectópica provocó sistemáticamente una respuesta mucho mayor transactivación en esta sublínea que en el PC-3
AR- sublínea. Las células DU145 son AR negativo. Se realizó nuestra propia transferencia de Western para confirmar la ausencia o presencia de la proteína AR en estas dos líneas (S1 Fig.).
Tratamiento de PHPEC, LNCaP y C4-2B células con el andrógeno, la dihidrotestosterona (DHT, 10 nM ), se llevó a cabo en medios de cultivo que contienen 10% tratado con carbón vegetal suero (CSS) para agotar los andrógenos. Para los estudios de hambre de andrógenos, LNCaP, se hicieron crecer células PC-3, DU145 y en 10% CSS
Reactivos y Oligonucleotide Primers
Los reactivos utilizados en el estudio fueron adquiridos como sigue:. Lipofectamina LTX con el reactivo PLUS (Invitrogen, Carlsbad, CA); anticuerpos primarios a la AR, el antígeno prostático específico (PSA), enolasa neuronal específica (NSE), factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y el factor de transcripción Sp1, y rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-intracelular dominio (ICD) y anti-dominio extracelular (ECD) anticuerpos GPR158 y anticuerpos anti-alfa-tubulina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO); anti-beta-actina de anticuerpos (Abcam, Cambridge, Reino Unido); de alta fidelidad de ADN polimerasa, Phusion (Finnzymes Inc., Woburn, MA); oligonucleótidos cebadores (Valuegene INC, San Diego, CA); tratado con carbón vegetal de suero bovino fetal (Atlanta Biologicals, Inc., Lawrenceville, GA). Todos los demás reactivos se adquirieron de Sigma. Tabla 1 proporciona las secuencias de todos los cebadores oligonucleótidos utilizados en este estudio. Para desmontables experimentos, hemos utilizado un conjunto de tres oligonucleótidos diseñados a medida siRNA (GenePharma Co. Ltd, Shanghai, China), la actividad de la que hemos caracterizado anteriormente [8].
cuantitativa en tiempo real inversa Transcription-PCR (qRT-PCR)
ARN total aislado de líneas celulares de CaP con Aurum RNA total mini kit (Bio-Rad, Hercules, CA) se sometió a análisis de QRT-PCR usando iScript de un solo paso RT- kit de PCR con SYBR Green (Bio-Rad) en el sistema CFX96 táctil PCR en tiempo real de detección (Bio-Rad), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. valores de cuantificación relativa de los genes de interés se calculan como 2
-ΔΔCt por el método comparativo Ct, donde ΔΔCt = (ARNm diana Ct de tratados gen muestra- referencia Ct de la muestra tratada) - (Ct ARNm objetivo de control de ejemplo-Ct gen de referencia de la muestra de control). Se utilizó beta-actina o GAPDH como un gen de referencia. Los cebadores utilizados para la estimación de GPR158, AR, PSA y la expresión de ENE se muestran en la Tabla 1.
Análisis Western Blot
Los lisados de células enteras se prepararon usando un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicolato de sodio, 1% NP-40) se disparó con un cóctel de inhibidores de proteasa durante 20 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 g durante 10 min. Se recogieron los sobrenadantes y las proteínas en los extractos se separaron por SDS-PAGE sin hervir las muestras y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se sondearon con el anticuerpo primario contra la proteína de interés y fueron desarrollados por quimioluminiscencia con una solución de reactivos Luminol potenciador y solución de peróxido (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, Reino Unido) y las imágenes fueron capturadas con sistema de imagen Fujifilm (LAS-4000; Fujifilm, Tokio, Japón). La carga de proteína se controló por extracción y Reprobing de la membrana con anticuerpo beta-actina.
construcciones de expresión
tres construcciones de expresión (GPR158-pcDNA 3.1 (+), GPR158-GFP y GPR158-NLS -M1 + 2-GFP) utilizado para estos estudios se describieron anteriormente [8]. También generó otra construcción de fusión GFP-GPR158, designado como GPR158:? C (AA 1-665), con toda la deleción CIE usando cebadores apropiados enumerados en la Tabla 1.
transfección transitoria
La células indicadas fueron transfectadas ya sea con plásmidos de expresión o construcciones de siRNA o plásmidos informadores promotor usando reactivo Lipofectamine LTX según las instrucciones del proveedor. En pocas palabras, 1-2 × 10
5 células /pocillo en 2 ml de medio completo fueron sembradas en placas de seis pocillos y se dejaron crecer hasta 70-80% de confluencia. ADN (2 g) se diluyó en 500 l Opti-MEM I + PLUS reactivo (2 l), se incubaron durante 5 min, se añadió Lipofectamine LTX (4,5 l) y se incubó durante 30 min. medio celular se reemplazó con frescos 2 antibióticos ml de medio libre y se añadió la mezcla, y se incubó durante 6 horas. Después de la incubación, los complejos se reemplazó con medio de crecimiento completo. A los 3 días después de la transfección, las células fueron procesadas, ya sea para el análisis de QRT-PCR o transferencia o célula conteo occidental.
Lentivirus Producción y Transducción Celular
GPR158 cDNA fue sub-clonado a partir de la pcDNA 3.1 (+), vector de expresión descrito anteriormente, en el vector de expresión lentiviral pSLIK (Addgene, Cambridge, MA). La producción lentivirus y la infección se llevó a cabo como se describe [35]. Brevemente, el envase viral se realizó en las células HEK 293T después de la co-transfección de la pSLIK-GPR158, dos plásmidos de encapsidación pMDLg /pRRE y pRSVREV, y plásmido de la cubierta de VSV G usando Lipofectamine 2000. Los virus se cosecharon 72 horas después de la transfección, y el partículas virales se concentran. células LNCaP se infectaron a una MOI baja para asegurar & lt; 30% la frecuencia de la infección y las células estables (Lenti-GPR158) se generaron con la selección de higromicina a 400 mg /ml de 4-semanas. Para la inducción de GPR158, las células LNCaP estables fueron tratados con 100 y 500 ng /ml de doxiciclina (DOX) durante 72 hrs. Las células LNCaP infectadas con partículas virales generadas con sólo el vector pSLIK (Lenti-vector) se utilizaron como control negativo. Después de 3 días de la inducción Dox, las células se sometieron a cualquiera blotting o célula conteo Western o ensayo de fraccionamiento subcelular de proteínas o ensayo de formación de colonias en agar blando.
Fraccionamiento subcelular
fraccionamiento subcelular se llevó a cabo utilizando el kit de fraccionamiento subcelular de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific Inc, Rockford, IL). Este kit se ha demostrado para aislar citoplásmica, la membrana, nuclear soluble, unido de la cromatina y el citoesqueleto fracciones de pureza suficiente para la localización de proteínas y de redistribución de estudios [36]. En pocas palabras, una separación por etapas de compartimentos celulares de 3 × 10
6 de las células indicadas se realizó después de la aplicación de la citoplasmática suministrado, membrana,, tampones de extracción de cromatina determinada y proteínas del citoesqueleto solubles nucleares. La concentración de proteína en cada fracción se estimó utilizando el kit de estimación de proteínas BCA (Thermo Scientific Inc.) y la cantidad indicada de proteína se sometió a transferencia Western.
formación de colonias de ensayo
El lenti- líneas celulares LNCaP GPR158 o lenti-vector se utilizaron para el ensayo de formación de colonias. Brevemente, las células se sembraron en una placa de 12 pocillos (5.000 células /pocillo). Las células se suspendieron en rojo fenol libre RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, y 0,48% de agar, y superpuestos en una capa sólida del mismo medio que contiene 0,8% de agar. Las células fueron inducidas o bien en el medio anterior que contiene 100 ng /ml de Dox, o se dejan sin tratar, con reposición suave de sus medios cada 3 días. Después de 2 semanas de incubación, la placa se tiñó con 0,005% de cristal violeta (EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ), se decoloró durante la noche con PBS y se contaron las colonias bajo el microscopio y fotografiado en el 20 × magnificación.
inmunohistoquímica (IHC) Análisis en el condicional
PTEN
ratón knockout
el condicional
PTEN
modelo de ratón knockout fue creado en la Universidad del Sur de California por dos de los co-autores de este estudio [37]. IHC análisis de GPR158 y AR expresión se llevó a cabo en los tres (ventral, dorsolateral y anterior) lóbulos derivado de la próstata de un 10 meses de edad condicional homocigotos
PTEN
ratón knockout (
PTEN
- /-) y un control de la misma edad correspondiente (
PTEN
+ /+
). En resumen, los tejidos de la próstata se fijaron en formaldehído al 4% y los bloques de muestras se cortaron en 5 micras de grosor, desparafinadas en xileno, y rehidratada utilizando un gradiente de etanol disminuyendo seguido de un enjuague con bidestilada H
20. Para recuperar la antigenicidad, los portaobjetos se incubaron con tampón de 10 mM de citrato (pH 6,0), se lavó con tampón de fosfato 0,1 M, se bloquearon con peróxido de hidrógeno 0,3% en metanol durante 15 min y con 5% de suero de cabra en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron con anti-ICD anticuerpo GPR158 (1: 100) o anticuerpo anti-AR (1: 200) en suero de cabra al 1% a 4 ° C durante la noche seguido por incubación con anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo (Vector Laboratories, Burlingame , CA) durante 1 h y rábano picante estreptavidina peroxidasa (vector Laboratories) durante 30 min, y después se visualizó por kit DAB (vector Laboratories). Los portaobjetos se contratiñeron posteriormente con 5% (w /v) Harris hematoxilina. Los portaobjetos que contenían secciones de parafina de la próstata a partir de sujetos humanos normales y PCA fueron proporcionados por el núcleo y procesados mediante el procedimiento anterior.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (sE) la importancia de las diferencias en los valores medios entre las muestras tratadas y no tratadas se determinó mediante la prueba t de Student después de determinar que los datos se ajustan a una distribución normal.
Resultados
Efectos GPR158 en la proliferación de células
para investigar el significado de la expresión GPR158 de CaP, hemos realizado una serie de experimentos utilizando líneas celulares de CaP humanos con diferentes alteraciones en la AR resultantes en diversos grados de capacidad de respuesta a andrógenos, los andrógenos sensibilidad y AR expresión, como se describe en la sección Materiales y Métodos. En primer lugar se evaluaron los niveles de ARNm de GPR158 endógeno y la proteína por PCR en tiempo real cuantitativa y transferencia Western, respectivamente. El rápido crecimiento, las líneas de andrógenos insensible DU145 y PC-3 (tiempo de duplicación de 1.5-2 días) expresaron niveles más altos de GPR158 mRNA (Fig. 1A) y proteína (Fig. 1B) en comparación con las células de crecimiento más lento de la línea LNCaP y su derivado C4-2B (tiempo de duplicación de 2-3 días). El nivel de proteína GPR158 en las células más rápido crecimiento fue de aproximadamente 2 a 3 veces más alta en comparación con células más lentamente crecimiento.
(A) Análisis de RT-PCR de la expresión de mRNA GPR158 en líneas celulares de CaP indicados (B) análisis de transferencia Western para la detección de proteína GPR158 utilizando anti-ICD anticuerpo GPR158 en lisados de células enteras de las líneas celulares de CaP indicados. La misma membrana se sondó para la beta-actina, que sirvió como control de carga. La línea vertical indica reposicionado líneas de gel de la misma membrana para que coincida con el orden de la muestra de la Fig. 1A. (C, D, E) Los cuatro indicado líneas celulares de CaP se transfectaron a 70% de confluencia con cualquiera de los plásmidos de expresión GPR158 o pcDNA3.1 vacío (+) vector (C y D) o bien GPR158 siRNA o control revueltos siRNA (E) como se se indica utilizando el reactivo Lipofectamina LTX y se incubaron en medio de crecimiento durante 3 días en un placas de cultivo de 6 pocillos. (C y E) Después de 3 días, las células tripsinizadas se contaron usando colorante azul de tripano en una cámara de hemocitómetro. (D) de Western blot para la detección de GPR158 en lisados de células enteras aisladas a partir de células transfectadas con plásmidos indicados utilizando anticuerpo anti-ICD GPR158. (F) Se aisló ARN total a partir de células DU145 que fueron transfectadas con la concentración indicada de cualquiera de GPR158 siRNA o control revueltos siRNA para el análisis de los niveles de ARNm de GPR158 de QRT-PCR. GAPDH fue de control de referencia interna. (C, E, F) Los datos muestran la media ± SE de 3 experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. *** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01; * P & lt; 0,05; ns, p & gt;. .05
Para evaluar el posible papel biológico de GPR158 en la regulación de la proliferación celular de células de CaP humanos, se realizó transfecciones transitorias con el vector de expresión de mamífero GPR158 se describe anteriormente [8]. Las líneas celulares transfectadas con el vector solo se utilizaron como control. El efecto sobre la proliferación celular se cuantificó después de 3 días de la transfección. Transient sobre-expresión de GPR158 en las células del LNCaP, DU145 y líneas C4-2B llevó a una tasa significativamente mayor de la proliferación celular por 3,88, 2,15 y 2,77 veces, respectivamente, en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Fig. 1C ). Transient sobre-expresión de GPR158 mostró sólo un aumento marginal en la proliferación de las células PC-3, sin embargo, este fue el que proliferan más rápidamente de las cuatro líneas de células sin GPR158 sobre-expresión, elevando la posibilidad de que la tasa de proliferación podría estar ya maximal . La sobreexpresión de GPR158 a los 3 días después de la transfección se confirmó en lisados de células enteras por Western Blot; Se observó un claro incremento en los niveles de proteína GPR158 en todas las líneas celulares (Fig. 1D).
Para evaluar el papel de GPR158 endógeno en la proliferación de células de CaP, se realizó el experimento inverso por la baja regulación de GPR158 a través del enfoque de siRNA. Hemos informado anteriormente de la caracterización de un grupo de tres siRNA oligonucleótidos, lo que demuestra el 80-90% desmontables de expresión de la proteína GPR158 en las células PC-3 a 100 nM, de una manera reproducible [8]. Estamos transfectadas cada una de las cuatro líneas celulares de CaP con 100 nM de esta piscina siRNA. Después de 3 días de la transfección, se observó una inhibición significativa del crecimiento (aproximadamente 50%) en todos los cuatro de las líneas celulares, en comparación con sus respectivos siRNA revueltos transfectaron las células de control (Fig. 1E). Se confirmó la caída dependiente de la dosis de la expresión mRNA GPR158 por transfección de la piscina siRNA, con una inhibición de aproximadamente 90% a 100 nM de ARNsi en las células DU145 (Fig. 1F), y aproximadamente 75-90% en las otras líneas celulares (datos no se muestra).
En conjunto, estos resultados indican que el nivel de expresión de la proteína GPR158 endógeno controla la velocidad de la proliferación de células de CaP, independientemente de la capacidad de respuesta a andrógenos, los andrógenos sensibilidad o el estado AR-expresión de la línea celular de CaP humana usado.
Efectos de un andrógeno en la expresión de GPR158
para descubrir los factores que regulan la expresión GPR158, se realizaron búsquedas en la aplicación NextBio "Fármaco Atlas" [38] que se encuentra compuestos y tratamientos correlacionaron significativamente con un gen con resultados clasificados en orden de significación estadística. Nuestra búsqueda usando "GPR158" como la consulta identificó el andrógeno DHT como el más importante y el primero en la lista de compuestos correlacionados. Los resultados revelaron 7 estudios independientes realizados utilizando células LNCaP y todos los estudios mostraron aumento de la expresión de ARNm con el tratamiento GPR158 DHT en el intervalo de 1,28 a 3,57 veces (S2 Fig.).
Para determinar experimentalmente si GPR158 es una gen sensible a los andrógenos, llevamos a cabo experimentos de tiempo de tratamiento DHT, comparando PHPECs sensibles a andrógenos y sensibles a los andrógenos LNCaP y células, y sensible a los andrógenos, pero andrógenos
insensibles
células C4-2B. Los resultados representativos se muestran en la Fig. 2. En las células LNCaP, y PHPECs mRNA GPR158 y los niveles de proteína aumentó en 3-4 veces con el tratamiento con DHT a las 24 horas (Fig. 2, A, B, E y F). En contraste, el tratamiento DHT no tuvo efecto sobre GPR158 ARNm y los niveles de proteína en las células C4-2B (Fig. 2, C y G). Tanto los niveles de ARNm y proteínas para el antígeno prostático específico (PSA), un gen diana AR bien estudiado, se incrementaron significativamente en PHPEC, LNCaP y células tratadas con C4-2B DHT. Al igual que en informes publicados, también se observó estabilización de la proteína en las células LNCaP AR DHT-estimulado a las 12 horas en células LNCaP y PHPEC [39], pero no en las células C4-2B (Fig. 2, E, F y G). Es importante destacar que se encontró que el antagonista de AR, bicalutamida inhibe el aumento mediado por DHT en GPR158 ARNm y los niveles de proteína y también se observó una inhibición completa de la expresión de PSA en PHPEC (Fig. 2, D y H). GPR158 mRNA y los niveles de proteína se redujeron a la inanición de andrógenos por incubación de PHPEC en un medio que contiene 10% de CSS durante la noche. Basándose en estos resultados, se concluye que GPR158 es un gen sensible a los andrógenos.
(AC y EG) Las células de las líneas indicadas se incubaron en medio que contenía 10% CSS para la inanición de andrógenos durante la noche (0 punto de tiempo), seguido de tratamiento con DHT (10 nM) para los períodos de tiempo indicados. El ARN total (A-C) o lisados de células (E-G) se aislaron y se sometieron a QRT-PCR y Western Blot, respectivamente para estimar AR, PSA, GPR158 y expresión de beta-actina. (D y H) PHPEC se hicieron crecer en medios que contienen 10% de FCS o 10% de CSS, se trató con DHT (10 nM) por sí sola durante 24 horas o pre-incubadas con bicalutamida (10μM) para 1-hr antes de DHT tratamiento en medios que contienen 10 CSS%. ARN total o toda la lisados celulares se aislaron y se realizó QRT-PCR y Western Blot, respectivamente, para detectar GPR158, AR, PSA y los niveles de beta-actina (D) El nivel de mRNA de los genes indicados anteriormente se consideraba 1 en las células cultivadas en 10% de FCS para el cálculo de la diferencia de veces en relación de estos genes en otras condiciones experimentales. (AH) Los datos representan tres experimentos independientes.
Efectos de GPR158 en la expresión AR
Los LNCaP /C4-2B visualización CaP modelo de progresión humana características de la transición de la dependencia de andrógenos insensibilidad a los andrógenos [32,40], y el AR desempeña un papel crucial en este proceso [41]. Higo. La figura 3 muestra los resultados de nuestro análisis de los efectos sobre la expresión de GPR158 AR. Transient sobre-expresión de GPR158 en las células LNCaP aumentó, y el silenciamiento de GPR158 endógeno reduce, el ARNm para la AR, así como para PSA (Fig. 3A). En las células LNCaP tanto y C4-2B, la sobre expresión de GPR158 incrementado significativamente los niveles de AR y de la proteína PSA, mientras que desmontables de GPR158 (reducción de 90%) redujo significativamente AR y los niveles de proteína PSA (Fig. 3, B y C). En conjunto, estos resultados indican que GPR158 estimula la AR y PSA expresión.
LNCaP (A, B, C) y C4-2B (B y C) fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo Lipofectamina LTX, ya sea con GPR158 plásmido de expresión o vector (A y B) o ya sea GPR158 siRNA o control revueltos siRNA (A y C). Después de 3 días de la transfección, el total de ARN aislado de células y proteínas lisados se utilizaron para QRT-PCR (A) y Western Blot (B y C), respectivamente, para el análisis de la expresión de GPR158, AR, PSA y mRNA β-actina y proteínas. Los datos representan dos experimentos independientes realizados por duplicado.
Efectos dependientes de la dosis de GPR158
Para investigar más a fondo el papel de GPR158 en la regulación de la proliferación celular y la expresión génica AR, hemos creado la línea celular LNCaP Lenti-GPR158. Esta es una sublínea de las células LNCaP establemente transformada con un lentivirus que expresa GPR158 bajo el control de Dox. El sistema lentivirus Dox-inducible permite la regulación estricta de la expresión de GPR158 en una forma dependiente de la dosis. células LNCaP fueron escogidos para este modelo porque expresan los niveles más bajos GPR158 endógeno. Se demostró recientemente que Dox altera los perfiles metabólicos y de proliferación de células LNCaP a concentraciones más altas [42], un efecto que se confirmó (datos no mostrados). Por lo tanto, en todos los experimentos con esta línea celular, se comparan los resultados obtenidos con la línea celular LNCaP Lenti-GPR158 a los obtenidos utilizando cultivos paralelos de células LNCaP parentales tratados con las mismas dosis de Dox.
Fig. La figura 4 muestra los resultados representativos de experimentos usando la línea celular LNCaP Lenti-GPR158. El tratamiento de lenti-GPR158 LNCaP con Dox durante 3 días inducidos expresión GPR158 de una manera dependiente de la dosis, en comparación con las células no tratadas (Fig. 4A). Hemos observado consistentemente un aumento de aproximadamente 3 veces y 6 veces en los niveles de proteína GPR158 después de tratar con Dox a 100 ng /ml y 500 ng /ml, respectivamente, durante 3 días (Fig. 4A). 5A.