Extracto
Nuestro objetivo fue evaluar la asociación entre la expresión y el polimorfismo de TLR4 /vías y el cáncer de colon NF-kB. TLR4 (
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,
rs10759932
,
rs10759931
y
rs2770150
) se genotipo en muestras de sangre de los pacientes de cáncer colorrectal y controles sanos. TLR4 y citoquinas inflamatorias expresión fueron evaluados por PCR en tiempo real en la búsqueda de 40 tejidos normales y de colon y el nivel de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica. El alto nivel de expresión de TLR4 en tejidos de cáncer de colon se debe principalmente a las infecciones por bacterias en el colon humano y conduce a la inducción de una secreción aguda de citoquinas inflamatorias mediadas por NF-kB. Además, se presenta aquí una clara evidencia de una asociación entre TLR4
rs10759931
polimorfismo (OR = 0,086; IC: 0,04-0,18; p = & lt; 0,00001). Este polimorfismo afecta a toda la población sin ser específico para cualquiera de los géneros o para cualquier grupo de edad. Por el contrario, el
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se asocia con el cáncer de colon en mujeres mayores de 50 años y está estrechamente relacionado con los niveles disminuidos de hormonas sexuales femeninas durante el período posterior a la menopausia (OR = 0,188; IC: 0,074-0,48 , P = & lt; 0,00084).
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y
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parecen tener ninguna relación con el cáncer de colon. Nuestros datos sugieren que los SNP TLR4 podría servir como biomarcadores para la toma de decisiones en el tratamiento del cáncer de colon
Visto:. Semlali A, Reddy Parine N, Arafat M, L Mansour, Azzi A, Al Shahrani O, et al. (2016) Expresión y polimorfismo de Toll-like receptor 4 y efecto sobre el NF-kB mediada por la inflamación en pacientes con cáncer de colon. PLoS ONE 11 (1): e0146333. doi: 10.1371 /journal.pone.0146333
Editor: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de Estados Unidos |
Recibido: Abril 29, 2015; Aceptado: noviembre 20, 2015; Publicado: 15 Enero 2016
Derechos de Autor © 2016 Semlali et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Grant número RGP-PPV-260, http://dsrs.ksu.edu.sa/en. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Abreviaturas : TLR4, Toll-like receptor 4; CRC, el cáncer colorrectal; SNP, polimorfismos de un solo nucleótido; LRR, repeticiones ricas en leucina; DAMP, asociados a patógenos patrón molecular; Amortigua, las moléculas de patrón molecular asociado a daños; TNF, factores de necrosis tumoral; TIR, los receptores Toll-interleukin1; NF-B, el factor Kappa-luz-cadena-potenciador nuclear de las células B activadas; MAPA, Mycobacterium avium subsp. Para la tuberculosis; QPCR, PCR cuantitativa; de CI, los intervalos de confianza
Introducción
El cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad compleja y uno de los tipos más comunes de cáncer. Los factores de riesgo para el cáncer de colon parecen estar determinados por la interacción entre la genética y una variedad de exposiciones ambientales. Varias líneas de evidencia apoyan la opinión de que el deterioro del sistema inmune podría contribuir al riesgo de desarrollar muchos tipos de cáncer, y la activación del sistema inmune se perseguido vigorosamente durante la terapia del cáncer. En este sentido, se está convirtiendo en la asociación de la inmunidad innata con cáncer de colon. Además, los pacientes con inmunodeficiencia mostraron tener un mayor riesgo de cáncer [1], y estudios recientes han demostrado que la alteración de la señalización de los receptores de la inmunidad innata puede contribuir a la patogénesis del cáncer [2-5]. La inmunidad innata se activa principalmente y regulado por los receptores tipo Toll (TLRs) [6] que se encuentra en las membranas de las células del sistema inmune tales como neutrófilos, células dendríticas y macrófagos, así como en las células de la superficie de la piel y genitourinario y gastrointestinal [7] . activación de los receptores Toll-like es responsable de la muerte de las células microbianas durante la infección, dejando intactas las células huésped [8-10]. Similar a otros TLRs, TLR4 se compone de tres dominios: que comprende un dominio extra-celular residuos 24-631 y que contiene repeticiones ricas en leucina (LRR), una región transmembrana con una única hélice transmembrana entre los residuos 632-652, y un dominio de señalización citoplásmico C-terminal [11, 12]. TLRs constituyen un grupo particularmente importante de receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) [13] y se encuentran en las superficies celulares o dentro de los endosomas. Estos se expresa predominantemente en los tejidos implicados en la función inmune y tienen un papel importante en la defensa del huésped contra los organismos patógenos. Hasta la fecha, 10 TLRs funcionales se han descrito en los seres humanos; TLRs 11-13 se encuentran en especies de roedores (ratas y ratones) [14] .TLRs juegan un papel crucial en la activación del sistema inmune mediante la regulación de la producción de péptidos antivirales y citoquinas inflamatorias [15-19] a través de los motivos estructurales muy conservados conocido como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) .TLRs han sido implicados en la inmunidad innata [5, 12, 20, 21], y las alteraciones de las respuestas TLR pueden dar lugar a infecciones virales y bacterianas graves o un mayor riesgo de cáncer [4, 5, 20]; También han sido implicados en la respuesta inflamatoria de las células epiteliales intestinales [22].
La señalización dominios de TLRs se conocen como Toll IL-1 Receptor (TIR) dominios, ya que comparten homología con el dominio de señalización de IL miembros de la familia -1R [23], que inducen NF-kB y IRF3 translocación y trans-activación [24] y la activación de diferentes genes de citoquinas inflamatorias [25, 26] por una vía dependiente de MyD88 común a todos los TLRs, excepto TLR3 [ ,,,0],27, 28]. Otro mecanismo de señalización de TLR conocido como la vía MyD88 independiente está asociado con la estimulación de IFN-β y la maduración de las células dendríticas a través de la TRIF adaptador /tICAM-1 [29] o a través de TRAM /tICAM-2, que se limita a la TLR4 vía [30].
el gen TLR4 se encuentra en cromosoma 9 y codifica una proteína que funciona en la respuesta inmune mediante la activación de factor nuclear kappa-light-chain-potenciador de células B activadas (NF-kB) [ ,,,0],18]. El deterioro de TLR de señalización
in vivo
se hace evidente a través de la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), que se han asociado con el receptor de hipo-respuesta y la susceptibilidad a las infecciones bacterianas, fúngicas y virales [31]. Un estudio anterior pone de relieve la participación de la activación de TLR y los polimorfismos de TLR en muchas enfermedades, como el cáncer de próstata [32]. Por lo tanto, una disminución en la función de TLRs puede estar asociado a un aumento del riesgo de cáncer. Recientemente se ha demostrado que un polimorfismo en la secuencia del promotor de TLR2 y TLR4 un alelo variante están involucrados en
Helicobacter pylori gratis (
H
.
pylori
) -asociado gástrica cáncer [33, 34] Además .En, un polimorfismo en el grupo de genes TLR10-TLR1-TLR6 se asocia con un mayor riesgo de cáncer de próstata [35], y la expresión de TLR4 funcional in vivo se sabe que es responsable de la trombocitopenia inducida por LPS [36]. TLR-2 polimorfismos también están involucrados en la respuesta areduced después del desafío con micobacterias, whereasTLR4 se conocen polimorfismos de estar asociado con una respuesta reducida a lipopolisacárido y el desarrollo de cáncer gástrico [37, 38]. A TLR4 SNP (
rs11536898
) también se asocia con el cáncer de colon [39] .recently, un TLR4 humano (Asp299Gly) SNP se ha sugerido para ser más específicamente asociado con LPS hipo-respuesta y un mayor riesgo de desarrollar cáncer de próstata en una población del norte de India [40]. Además, TLRs han demostrado desempeñar un papel en la progresión de pólipos a los tumores, y la reducción de expresión TLR4 se ha asociado con el aumento potencial de la metástasis de cáncer colorrectal (CRC) [41, 42]. Un meta-análisis sintético basado en datos de 22 estudios también confirmó la asociación de TLR4 SNP Asp299Gly con un mayor riesgo de cáncer gastrointestinal, pero con un menor riesgo de cáncer de próstata [43]. Sin embargo, un informe conflictiva de un estudio multi-racial llevado a cabo en Malasia no mostró correlación entre un polimorfismo de TLR4 (Asp299Gly) y el riesgo de CCR [44]. Por lo tanto, es evidente que los estudios adicionales son necesarios para validar estos hallazgos. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la expresión de TLR4 en el CCR y para examinar la implicación potencial de las cuatro SNPs de TLR4 humano (
rs32770150
,
rs310759931
,
rs10759932and rs4986790
) con el riesgo de cáncer de colon en la población de Arabia Saudita.
resultados
Análisis de parámetros de datos clínicos
Un total de 115 casos de cáncer de colon y 102 controles sanos fueron incluidos en el estudio. Las características clínicas de los pacientes, incluyendo la edad, la nacionalidad, antecedentes familiares, hábitos de fumar, y la etapa del cáncer de colon, se recogieron y se comparan con las de los pacientes del grupo control (Tabla 1). La edad de la población de estudio osciló entre 45 y 88 años, con una edad media de 56,04 ± 14,37 para los casos de cáncer de colon y de 52.84 ± 15.88 para los controles. No hubo diferencia significativa en la edad media entre los dos grupos. La razón hombre-mujer no fue significativamente diferente entre los casos y controles (66/49 para los pacientes y para los controles 60/42).
El aumento de la expresión del gen TLR4 en tejidos de cáncer de colon en comparación con los tejidos normales a juego
Las muestras de tejidos utilizados para el análisis de ARN (n = 40 tejidos a juego) fueron inmediatamente almacenados en la solución de ARN-más tarde. Después de la extracción del ARN, la transcripción PCR se realizó para comparar la expresión diferencial de mRNA de TLR4 una cuantitativa en tiempo real inversa. Como se muestra en la figura 1A, TLR4 fue altamente expresado (p & lt; 0,001) en los tejidos de cáncer de colon en comparación con tejidos normales de colon (2,53 ± 0,32) y (1,01 ± 0,01), respectivamente (Fig 1A)
celular total. RNA recién extraída de búsqueda de tejidos normales y de cáncer de colon se transcribe de forma inversa en ADNc y luego se usa para medir la expresión TLR4mRNA (Panel a). Los tejidos fueron immunostained utilizando anticuerpos específicos de TLR4 (panel B).
Para confirmar los datos de la expresión del ARNm, se determinó la expresión de la proteína TLR4 por inmunohistoquímica. Como se muestra en la (Fig 1B), inmuno-tinción positiva para el TLR4 general, se observó en las células epiteliales de colon y también en algunos compartimientos de las células del estroma. Sin embargo, la intensidad de la tinción fue mayor en los tejidos tumorales de adenocarcinoma de colon.
Correlación entre los polimorfismos de TLR4 y la susceptibilidad al desarrollo de cáncer de colon en Destinia.com Saudi Arabian pacientes
La distribución de alelos y genotipos y la asociación el análisis se describen en la Tabla 2. Todos los SNPs genotipo se ensayaron para determinar el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE). Muestras de ADN de la sangre de los 115 pacientes y 102 controles sanos fueron genotipo para la presencia de 4 TLR4 SNPs (
rs2770150
T /C,
rs10759931
A /G,
rs10759932
T /C y
rs4986790
A /G). Las características fenotípicas y genotípicas de los grupos de pacientes y de control se resumen en la Tabla 3.
Los datos de tres SNPs TLR4,
rs2770150
,
rs10759932
y
rs4986790
, que se encuentra en el promotor, no mostraron ninguna asociación con el cáncer de colon en la población de Arabia. Sin embargo, para SNP
rs10759931
, lo que resulta en Asp299Gly, la distribución de alelos y genotipos fueron significativamente diferentes entre los pacientes y controles. Se encontró que el alelo G ser significativamente más altamente frecuente entre los pacientes (0.87) en comparación con el grupo de control (0,3). A GG homocigotos de la misma SNP también era altamente frecuente en el grupo de pacientes en comparación con el grupo control (0,81
vs
. 0.1) y fue muy asociado con el desarrollo de cáncer de colon entre la población Arabia. Sin embargo, la presencia del alelo A en el caso de los heterocigotos y homocigotos (AA) parece conferir protección contra el cáncer colorrectal (OR 0,026; IC del 95%: 0,011-0,058; p ≤0.00001).
Asociación entre la frecuencias genotípicas de los polimorfismos del gen TLR4 y
de género
para evaluar la asociación entre el riesgo de cáncer de colon y los SNPs en función del sexo del paciente, las distribuciones genotípicas en función del sexo en el grupo de cáncer de colon se compararon con los de los sujetos de control (Tablas 3 y 4). Curiosamente, en el grupo de mujeres (35 pacientes y 31 controles), el alelo T del SNP rs2770150 presentan una frecuencia que fue significativamente mayor en los pacientes que en los controles (0,78 frente a 0,6) (OR 2,38; IC del 95% 1.2 a 4.8 y p = 0,012). Por el contrario, los genotipos CT y CC eran cuatro veces menos frecuente en los casos en comparación con los controles (OR 0,14; IC del 95%: 0,04 a 0,48 y p = 0,0009). Alelo (C) fue significativamente muy frecuente entre los controles (0.40) en comparación con el grupo de pacientes (0,22) (p = 0,0002). Sin embargo, la distribución del genotipo CC entre las mujeres afectadas y no afectadas fue diferente (p = 0,019) (Tabla 3). SNP
rs2770150 genotipo CC
no mostró un riesgo significativo en pacientes de sexo femenino después de aplicar la corrección de Bonferroni. Por el contrario, SNP
rs2770150
no se asoció con el cáncer colorrectal en los hombres (40 pacientes y 34 controles (Tabla 4).
SNP
rs10759931
, que mostraron una alta asociación con el riesgo de cáncer de colon en la población general, también presentó una asociación significativa en el sexo femenino (46 pacientes y 38 controles) y masculino (62 pacientes y 48 controles) subgrupos. Sin embargo, los genotipos GA y AA en el grupo femenino eran frecuente en las muestras de control en comparación con los pacientes con cáncer de colon (OR = 0,025 95% CI 0,007-0,090 y p & lt; 0,00001; Tabla 3) La misma observación se hizo en los pacientes varones en comparación con los machos saludables:. GA + AA eran 0,2 y 0,87, respectivamente (p & lt; 0,00001; Tabla 4) Por SNPs
rs10759932 Opiniones y r
s4986790
, no hubo diferencias significativas en la distribución de genotipos entre hembras y varones afectados y no afectados. se observó (p & gt; 0,05). (Tablas 3 y 4) guía
Asociación entre las frecuencias genotípicas de los polimorfismos del gen TLR4 y la edad
Un análisis más detallado de la distribución de los genotipos TLR4 después de la correlación con la edad revelaron que la edad media de aparición de las actuales muestras de cáncer de colon es de 56 años y en los grupos de control es de 52 años. Para evaluar la asociación entre SNPs TLR4 con una menor edad al diagnóstico de cáncer de colon, se estratificó a los pacientes como ≤50 o & gt; 50 años de edad. La distribución de los genotipos de los SNPs junto con el análisis estadístico se muestra en las Tablas 5 y 6. El alelo T del SNP rs2770150 presenta una frecuencia que fue significativamente mayor en los pacientes mayores de 50 años de edad que en los controles. Por el contrario, el alelo C fue significativamente menos frecuente en los casos en comparación con los controles (0,24 frente a 0,36) (OR 0,57; IC 95% 0,3 a 0,9 y p = 0,038) (Tabla 6), mientras que no se observó ninguna diferencia para este SNP para la subpoblación de pacientes menores de 50 (Tabla 5). Pero después de aplicar SNP corrección genotipo rs2770150 CC de Bonferroni no mostró un riesgo significativo en & gt; edad patients.rs10759931 50 años, que mostraron una asociación significativa en el estudio general, también se indica un riesgo significativo en ambas subpoblaciones de pacientes (p & lt; 0,00001) (Tablas 5 y 6). No hubo diferencias significativas en la distribución de genotipos entre los individuos afectados y no afectados para ambas subpoblaciones se observó (p & gt; 0,05) para los otros dos SNPs (
rs10759932
y
rs4986790
; Tablas 5 y 6).
inflamatoria innata moléculas de respuesta en relación con el cáncer de colon desarrollo
el objetivo del presente estudio fue evaluar las diferencias y relaciones entre la expresión de TLR4 y citoquinas, específicamente variaciones en la expresión de citoquinas inflamatorias interleuquina (IL1β1, IL6, IL-8 e IL-17. la presencia de células inflamatorias y los niveles de expresión de las citocinas clave implicadas en el proceso de inflamación cáncer de colon se cuantificaron mediante el uso de tiempo real inversa transcriptasa (RT) -PCR a partir de 40 tejidos de cáncer de colon y 40 tejidos normales que coinciden. El ARNm de citoquinas era sustancialmente más altos niveles (diferencias 10-22 veces) en los tejidos de cáncer de colon en comparación con las muestras normales del colon, como se muestra en la figura 2, lo que indica mayores respuestas pro-inflamatorias en las muestras de CRC. Esto es debido a la sobreexpresión de la actividad TLR4 en pacientes con cáncer de colon.
La producción de citoquinas se evaluó por qRT-PCR en tejidos de cáncer de colon y emparejan los tejidos normales (media ± SD, n = 40 pacientes, los datos se normalizaron a
GAPDH
, de control (barras blancas), cáncer (barras sólidas), * P & lt; 0,00 t-test)
El aumento de NF-kB expresión de p65 en tejidos de cáncer de colon
para confirmar nuestra hipótesis de que, el altamente nivel de TLR4 en pacientes con cáncer de colon conduce a la inducción de una respuesta inflamatoria mediada por múltiples vías específicamente NF-kappa B e inducir una secreción aguda de citoquinas inflamatorias como tales como IL-6, un estudio comparativo de la expresión de NF-kB se llevó a cabo mediante técnicas de inmunohistoquímica en tejidos de colon cáncer y tejidos normales que coinciden. Inmunohistoquímica análisis reveló que la expresión de NF-kappa B p65 en el tejido de cáncer de colon aumentó significativamente en comparación con tejido de colon normal (Fig 3) .Our resultados sugieren un papel crítico de NF-kappa B como una molécula de señalización en el proceso inflamatorio, lo que facilita la expresión y secreción de citoquinas pro-inflamatorias, lo que lleva a una serie de respuestas inflamatorias mediante la activación de TLR4.
Los tejidos fueron immunostained utilizando anticuerpos NF-kB específica (p65) a 1/100 (n = 10).
Discusión
La asociación entre la inflamación y la carcinogénesis fue descrito por primera vez hace 10 años [45-47] .Desde luego, la inflamación se ha descrito para aumentar la proliferación y la migración /invasión en varios tipos de células tumorales [47 ], y el vínculo entre comensal inflamación inducida por microorganismos de la mucosa recientemente se ha sospechado como vinculadas a la CRC. Por el contrario, nuestra hipótesis es que TLR4 desempeña un papel importante en el sistema inmune innato y que la alteración de la función estructural de esta proteína, que en última instancia, impiden la vigilancia inmune en la mucosa del colon, puede conducir al desarrollo de tumores [48]. Está documentado que la activación de TLR4 promueve la carcinogénesis y la resistencia a los tratamientos químicos en cáncer de mama [49, 50], mientras que el bloqueo de la activación de TLR4 puede retrasar el crecimiento de cáncer de mama y prolongar la supervivencia [2]. Por lo tanto, lo primero que examinó la asociación entre la susceptibilidad a desarrollar CCR en la población de Arabia y la expresión de TLR4 y el polimorfismo de TLR4. Nuestros resultados muestran que el TLR4 se sobreexpresa en las células epiteliales tumorales del cáncer de colon, que constituyen la primera línea de defensa contra agentes extranjeros. Además, nuestro análisis también demostró que la expresión de TLR4 es significativamente mayor en los tejidos tumorales de colon en comparación con tejidos de colon normales a juego. Estos resultados están de acuerdo con el trabajo previo informar de la sobre-expresión de TLR4in varios tipos de cáncer, tales como la progresión cáncer gástrico [51], el cáncer de mama [49, 50, 52], cáncer de colon [52], y el cáncer de ovario [53]. El nivel más alto en la expresión de TLR4 en tejidos de cáncer de colon en comparación con tejidos normales se debe principalmente a las infecciones por bacterias en el colon humano, explicando un origen potencial de cáncer de colon. Estos hallazgos sugieren que la activación de la expresión del TLR4 en los tejidos cancerosos de colon puede promover el crecimiento tumoral y la resistencia a la apoptosis, una conclusión que es apoyada por el estudio previo que mostró que el bloqueo de TLR4 señalización crecimiento del tumor retrasos y prolonga la supervivencia de los animales [41 , 54]. TLR4 de señalización en el cáncer se considera un arma de doble filo: si TLR4 se activa en las células inmunes, se puede mejorar la inmunidad anti-tumor, y por lo tanto TLR4 podría ser utilizado como un marcador para la detección de una predisposición a un cáncer; Sin embargo, la inflamación crónica inducida por la activación de TLR4 es un importante factor de riesgo para el desarrollo del cáncer [55] .TLR4 podría ser un jugador importante en el desarrollo del cáncer de colon y el deterioro inTLR4 señalización in vivo se hace evidente a través de la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).
Este es el primer informe que examina una posible asociación de varios polimorfismos commonTLR4 con cáncer de colon en saudíes. Dada la frecuencia más alta de la
TLR4
alelo G en pacientes con CCR en comparación con los controles sanos, se presenta una clara evidencia de una asociación entre la novela TLR4
rs10759931
polimorfismo y la susceptibilidad al desarrollo de cáncer de colon en la Arabia la población árabe. El
TLR4
genotipo GG es el más extendido en el Oriente Medio, sobre todo en la población de Arabia Saudita. Este polimorfismo afecta a toda la población sin ser específico para cualquier sexo o cualquier grupo de edad. El genotipo AA se representa generalmente en otras poblaciones y protege contra el cáncer de colon así el genotipo GG puede servir como un marcador genético para el diagnóstico de cáncer de colon en esta población étnica. Por el contrario, el
TLR4
polimorfismo
rs2770150
se asocia con el cáncer de colon en mujeres mayores de 50 años y está estrechamente relacionado con los niveles disminuidos de hormonas sexuales femeninas durante el período posterior a la menopausia. Estudios anteriores ya han descrito el papel del estrógeno y la progesterona en la protección contra el cáncer de colon en las mujeres [56-59]. En este sentido, se investigó este polimorfismo en mujeres pre y postmenopáusicas para ayudar a clarificar este fenómeno.
El más común de polimorfismo de cambio de sentido, D299G, que se produce en el exón 4 del gen TLR4 humano (A896G), se encuentra dentro del dominio extracelular del receptor. Las estructuras de rayos X de tanto de tipo salvaje y mutado (D299G) receptores con LPS y los dominios MD-2 se han determinado [60], que muestra claramente que este polimorfismo no afecta a la dimerización, pero da lugar a un cambio conformacional local significativa en el sitio D299G [61]. Este cambio conformacional puede perjudicar la unión del ligando y bajar respuesta de señalización del receptor de LPS, y alteración de la señalización de TLR4 se ha demostrado que interfiere con el reclutamiento de MyD88 y TRIF [62], lo que conduciría a una respuesta inmune deprimida a cualquier agresión bacteriana comensal en células de la mucosa. Este polimorfismo junto con TLR4rs2770150 no mostró asociación con el cáncer de colon en este grupo étnico, a pesar de que estos dos SNPs mostraron un fuerte vínculo con el cáncer de próstata [32] y el cáncer gástrico [63] en otros estudios y en otras poblaciones.
TLR4 activación por ligandos conduce a la producción de citocinas que promueve un papel importante en la patogénesis de la misma cáncer, especialmente en la iniciación y mantenimiento de la inflamación. El papel de las citocinas, como la IL-6 juega un papel importante en una amplia gama de actividades biológicas en hematopoies inmune es la regulación y la oncogénesis. La mayoría de estas citoquinas también se ha detectado en varios tumores epiteliales [64], está implicada en la proliferación y diferenciación de varias células tumorales malignas [65]. La sobreexpresión de IL-6 se ha encontrado en el cáncer de próstata [66, 67], carcinoma de mama [68] y el carcinoma de células escamosas oral de [69].
Aquí nos muestran una mayor expresión de TLR-4 en tejidos de cáncer de colon y su papel en las vías inflamatorias en particular a través de la vía NF-kB, un concentrador molecular fundamental que une la inflamación y el cáncer. La inhibición de la activación de NF-kB mediante el bloqueo de la señal de MyD88 reducirá la liberación de citoquinas proinflamatorias, aliviar la respuesta inflamatoria y lograr un efecto terapéutico
.
En resumen, proporcionamos vínculos entre la expresión del gen TLR4 y los polimorfismos de TLR4, los cuales se han planteado la hipótesis tan importante para el proceso carcinogénico de cáncer de colon en la población de Arabia Saudita. Nuestros datos sugieren que la variación genética en TLR4 puede influir en el desarrollo de cáncer de colon. La replicación de estos resultados se justifica dada la plausibilidad biológica de la asociación y la interacción con la dieta y el estilo de vida que pueden modificar estos efectos genéticos. Además, creemos que nuestro estudio proporciona una importante relación mecanicista que podría ser el punto de partida para estudios posteriores, y SNPs importantes en esta genes podría servir como biomarcadores para la toma de decisiones en el tratamiento del cáncer de colon.
Materiales y Métodos
las poblaciones de estudio y recogida de muestras
Un total de 115 casos de cáncer de colon y 102 controles sanos fueron incluidos en este estudio, que fue aprobado por la junta de revisión institucional local. Las muestras fueron reclutados de Rey Hospital Universitario de Khalid en Riad, Arabia Saudita. Todos los datos del cuestionario y las muestras (de sangre y tejidos) se recogieron en el reclutamiento inicial de los dos casos y controles. Se pidió a los participantes que rellenaran un cuestionario autoadministrado con respecto a sus características socio-demográficas (por ejemplo, la edad, antecedentes familiares de cáncer), el estilo de vida (por ejemplo, el hábito de fumar y la ingesta de alcohol), y la historia médica personal. Los casos y los controles fueron frecuencia pareados por edad y sexo. Las características clínicas de los pacientes, incluyendo la edad para la selección de la población saudí (se excluyeron los individuos que no sea ciudadano de Arabia Saudita), antecedentes familiares, hábitos de fumar, la etapa del cáncer de colon, los medicamentos y la presencia de otras enfermedades fueron recogidos y comparados. La edad de la población de estudio osciló entre 45 y 88 años, con una edad media de 57,04 ± 14,37 para los casos de cáncer de colon y de 56.51 ± 15.70 para los controles (Tabla 1). Las muestras de tejido se utilizan para la extracción de RNA. Las muestras de sangre se almacenaron en tubos con EDTA a -80 ° C y se utilizan para la extracción de ADN genómico.
reactivos generales
ADN /cebadores y SNPs se obtuvieron de Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON , Canadá). Los anticuerpos anti-TLR4 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, EE.UU.) .RNA más tarde para la estabilización de ARN fue obtenido de Ambion /Life Technologies (Burlington, ON, Canadá). kits de ARN eran de Qiagen (Hilden, Alemania). Los ADNc de alta capacidad reversa kit de transcripción era de Applied Biosystems (Warrington, EE.UU.). SYBR Green se obtuvo de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá).
DNA extracción
ADN genómico fue extraído de la sangre entera usando el kit QIAmp (QIAmp DNA Blood Mini Kit, Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 200 a 300 l de sangre almacenada en tubos de EDTA a -80 ° C se equilibró a temperatura ambiente, se mezcló con la proteasa y tampón de lisis, y se incubaron a 56 ° C durante 10 minutos. Después, se añadió 100% de etanol, y la mezcla se pasó a través de la columna usando centrifugación. La membrana se lavó la columna, y el ADN se eluyó con 100 l de tampón de elución (AE). La concentración de ADN extraído se determinó usando un Nano-Drop8000spectrophotometer (Thermo Scientific) .La pureza de ADN se evaluó por la norma A260 /A280 y relaciones A260 /A230.
aislamiento de ARN total
Total RNA de tejido se aisló utilizando el kit DNA /RNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania), como se describe por Alanazi et al [70]. Brevemente, los tejidos se sometieron a lisis en tampón de 350 μllysis con 3,5 l β-mercaptoetanol. El lisado se filtró a continuación y se homogeneizaron con 70% de etanol, y el ADN se cargó en la columna y se digirió con ADNasa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, la membrana se lavó la columna y el RNA se eluyó con 40μl libre de RNasa H
2O y se almacena en tubos de recogida libre de nucleasa a -80 ° C. La concentración, pureza y calidad del ARN aislado se determinó a través de todo el sistema analizador Agilent 2100 Bio y el kit de análisis de Agilent Small RNA de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).
la síntesis de ADNc
según lo descrito por Semlali et al [71, 72], 1 g de cada muestra de ARN transcrito fue invertir en cDNA utilizando una alta capacidad de cDNA kit de transcripción reversa (Applied Biosystems, Warrington, USA) .Las condiciones para la preparación de los moldes de cDNA para el análisis de PCR fueron 10 min a 25 ° C, 2 h a 37 ° C, y 5 min a 85 ° C. El ADNc sintetizado se almacenó a -20 ° C o 4 ° C para posteriores reacciones de PCR.
Cuantitativa en tiempo real PCR
expresión TLR4 mRNA se detectó mediante RT-qPCR como se describe anteriormente [71 , 72]. La expresión de la casa de mantenimiento de GAPDH gen se utilizó como control endógeno para la normalización de la cantidad de ARN de la muestra. Las reacciones se realizaron utilizando un Green Supermix PCR SYBR de Applied Biosystems. Las secuencias de TLR4, citoquinas y cebadores GAPDH se muestran en la Tabla S1.
PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema de PCR A7500 en tiempo real (Applied Biosystems). Los cebadores se añadieron a la mezcla de reacción a una concentración final de 250 nM. Como se ha descrito anteriormente [72], 5μlof cada muestra de cDNA se añadió a una mezcla de PCR que contiene 20-l 12,5 l de SYBR Green Supermix, 0,5 l de cebadores específicos y 7 l de RNasa agua /libre de DNasa. La reacción de PCR consistió en con 50 ° C durante 2 minutos y 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 62 ° Cfor30 minutos y 30 segundos a 72 ° C. Todos los ensayos de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado, y la especificidad de cada par de cebadores se verificó por la presencia de un único pico de temperatura de fusión. GAPDH produjo niveles de expresión uniformes que varían en menos de 0,5 TC entre condiciones de la muestra y por lo tanto se utilizó como gen de referencia para este estudio. Los productos amplificados se separaron en un gel de agarosa para confirmar que no había productos espurios amplificados. Los resultados se analizaron mediante el método de expresión relativa 2
-ΔΔCt (Livak).
La inmunohistoquímica (IHC) Análisis
se cortaron bloques
embebidos en parafina-de cáncer de colon y muestras de tejido de colon normales en secciones de 3 micras de espesor. Estos se montaron en portaobjetos con solución salina recubierto y se incubaron durante 15 a 20 minutos en un horno de aire caliente a 60 ° C. Muestras de tejido fueron deparaffinized con EZ Prep (Ventana, Arizona, EE.UU.) a 75 ° C, el calor pre-tratada de la célula acondicionado 1 (CC1, Ventana, Arizona, EE.UU.), utilizando un protocolo de "acondicionamiento celular estándar" para la recuperación de antígenos en 100 ° C y, a continuación, se incubó con una gota de solución de inhibidor durante cuatro minutos a 37 ° C. Diapositivas luego se lavaron y se incubaron durante 32 minutos a 37 ° cwith contra TLR4 y anti NF-kappa B (diluido 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) anticuerpo primario y seguido de una incubación con el UltraView anticuerpo secundario multímero HRP universales . Las proteínas TLR4 immunolocalized se visualizaron utilizando una reacción DAB cobre mejorada.