Extracto
Los pacientes con cáncer de ovario (OC) se puede tratar con cirugía, quimioterapia y /o terapia de radiación, aunque ninguna de estas estrategias son muy eficaces. Varios productos naturales a base de plantas /suplementos dietéticos, incluyendo extractos de
Emblica
officinalis gratis (Amla), han demostrado propiedades anti-neoplásicas potentes. En este estudio se determinó que el extracto de Amla (AE) tiene efectos antiproliferativos sobre las células OC tanto bajo
in vitro Opiniones y
in vivo
condiciones. También determinamos los efectos antiproliferativos uno de los componentes de la AE, quercetina, en las células bajo OC
in vitro
condiciones. AE no indujo la muerte celular por apoptosis, pero aumentó significativamente la expresión de las proteínas autofágicos beclin1 y LC3B-II bajo
in vitro
condiciones. La quercetina también aumentó la expresión de las proteínas autofágicos beclin1 y LC3B-II bajo
in vitro
condiciones. AE también redujo significativamente la expresión de varios genes angiogénicos, incluyendo 1α factor de inducible por hipoxia (HIF-1α) en células OVCAR3. AE actuó de forma sinérgica con cisplatino para reducir la proliferación celular y aumentar la expresión de las proteínas autofágicos beclin1 y LC3B-II bajo
in vitro
condiciones. AE también tuvo efectos antiproliferativos e indujo la expresión de las proteínas autofágicos beclin1 y LC3B-II en xenoinjertos de tumores de ratón. Además, AE reduce el antígeno de células endoteliales - CD31 vasos sanguíneos positivos y la expresión de HIF-1α en xenoinjertos de tumores de ratón. En conjunto, estos estudios indican que la AE inhibe el crecimiento celular tanto OC
in vitro
y
in vivo
posiblemente a través de la inhibición de la angiogénesis y la activación de la autofagia en OC. De este modo AE puede resultar útil como alternativa o complemento enfoque terapéutico para ayudar a combatir OC
Visto:. De Una, DE A, C Papasian, Hentges S, S Banerjee, Haque I, et al. (2013)
Emblica
officinalis
Extraer induce la autofagia y la proliferación de células de cáncer de ovario humano inhibe la angiogénesis, el crecimiento de los tumores de ratón con xenoinjerto. PLoS ONE 8 (8): e72748. doi: 10.1371 /journal.pone.0072748
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Marzo, 2013; Aceptado: 12 de julio de 2013; Publicado: 15 de agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 De et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por un fondo intramural universidad de Kansas City y un Premio al Mérito VA Grant (SKB, SB). Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o participación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de ovario (CO) es el segundo más común cáncer ginecológico y es la principal causa de. muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos [1]. Cada año, aproximadamente 22.000 mujeres en Estados Unidos son diagnosticadas con OC, y 15.000 muertes se debieron a OC solo en 2011 [1]. OC es difícil de diagnosticar en sus primeras etapas (I /II), ya menudo no se sospecha clínicamente hasta que se propaga y avanza a las etapas posteriores (III /IV). En consecuencia, OC tiene un mal pronóstico, con una tasa de supervivencia de cinco años para todos los estadios de ~ 47% [2]. Actualmente, OC puede ser tratado con cirugía, quimioterapia y radiación, con resultados subóptimos como se indica por la tasa de supervivencia de cinco años antes citada. El desarrollo de nuevos medicamentos contra el cáncer, o combinaciones de fármacos para el OC no han proporcionado razón significativa para ser optimistas. Desde fármacos contra el cáncer convencionales pueden ser altamente tóxicos, compuestos bioactivos derivados de las plantas se están investigando más intensamente como terapias alternativas o adyuvantes para diversas formas de cáncer [3]. La evidencia reciente sugiere que los extractos de plantas tienen efectos antitumorales /anticáncer /antiproliferativo sobre líneas de células tumorales humanas cultivadas [4-7] y también tienen un efecto antiangiogénico en líneas celulares de cáncer [8].
amla (
Emblica
officinalis
) es una planta de fruto que ha sido reconocido por su valor medicinal, y se ha utilizado desde la antigüedad en el sistema tradicional indio de medicina 'Ayurveda' para el tratamiento de varias enfermedades como el cáncer [9-11]. El fruto de la planta Amla contiene 11 conocidos componentes medicinalmente pertinentes, tales como ácido gálico, ácido elágico, 1-O-galoilo-beta-D-glucosa, 3,6-di-O-galoilo-D-glucosa, ácido chebulínico, quercetina , ácido chebulágico, corilagina, 1,6-di-O-gallolyl beta D glucosa, ácido 3-ethylgallic, isostrictiniin y ácido ascórbico [9]. Las ramas de esta planta contienen siete compuestos bioactivos - geraniin, phyllanemblinins C y E, prodelfinidina B1, (2) -epigallocatechin 3-O-galato, (S) -eriodictyol 7- [6-O- (E) -p-coumaroyl ] -bd-glucósido [12]. De entre esta colección de compuestos, ácido gálico, ácido elágico, 1-O-galoilo-beta-D-glucosa, ácido chebulínico, quercetina, ácido chebulágico, corilagina, ácido ascórbico, y geraniin han demostrado fuertes propiedades anti-cancerígenos individualmente, y estos pueden ayudar a explicar las propiedades anticancerígenas de extracto de toda Amla (AE) [9,13]. AE se ha demostrado que inhibe la proliferación de una variedad de células de cáncer de
in vitro
, incluyendo las células de AO, y los efectos anti-proliferativos también ha demostrado
in vivo
[9-11]. Recientemente triphala, un remedio herbal que contiene AE, también ha demostrado propiedades anti-angiogénesis [8].
Debido al valor potencial de la AE como una terapia contra el cáncer, en particular para OC, que han investigado la lucha contra la efectos proliferativos y anti-tumorigénicos de AE en líneas de células de ovario
in vitro
y en un modelo de ratón con xenoinjerto. También hemos investigado el efecto de la AE sobre la angiogénesis del tumor en células cultivadas y un modelo de xenoinjerto de ratón. Hemos observado que AE no indujo la muerte celular apoptótica, pero aumentó significativamente la expresión de la proteína en la autofagia cultivo de tejidos y modelo de xenoinjerto de ratón. También hemos observado que AE actuó de forma sinérgica con cisplatino para reducir la proliferación celular y aumentar la expresión de beclin1 y LC3B-II bajo
in vitro
condiciones.
Materiales y Métodos
Ética Declaración de
Todos los animales se mantuvieron de acuerdo con las directrices estándar de la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care. El estudio fue aprobado por el Institutional
Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Ciudad de Kansas VA Medical Center (Kansas City, MO).
Cultivo de células y reactivos
OVCAR3, SW626 y células placentarias humanas normales (SA 799 pl) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) y la tripsina se adquirieron de Sigma, St. Louis, MO. células OVCAR3 y SW626 se mantuvieron en DMEM con 10% de suero bovino fetal (Hyclone Laboratories, Logan, UT) y antibióticos en 37
OC en un CO 5%
2 medio ambiente. Todas las células utilizadas en este estudio se encontraban dentro de 10 pases después de la recepción o la recuperación (~ 2 y 1/2 meses de cultivo). AE para el tratamiento se preparó a partir tabletas disponibles comercialmente (Himalaya, USA, Houston, TX, que contiene 250 mg de fruta de Amla y 350 mg de polvo de Amla tallo). Una solución madre de AE se preparó pesando las tabletas Amla, molienda ellos, y disolviendo el polvo en agua estéril libre de endotoxina a 10 mg /ml. La solución se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,02 micras y se utiliza para tratar la cultura a diferentes concentraciones.
Tratamiento
10.000 OVCAR3 o SW626 células se sembraron en pocillos individuales de placas de 24 pocillos en 1 ml de medio que contiene 10% de suero bovino fetal y se incubaron a 37
OC durante 24 h antes del inicio de los experimentos. Después de que el recubrimiento inicial, el medio se reemplazó con 1 ml de DMEM que contenía suero (10%) y AE (0-400 g /ml; por triplicado) para varios puntos de tiempo (6-96 horas) a 37
OC. El
in vitro
de control (0 mg /ml de AE) recibió vehículo (agua) a un volumen igual a la concentración más alta de AE utilizado. También tratamos las células OVCAR3 con diferentes dosis de quercetina (5 a 100 g /ml; por cuadruplicado) para varios puntos de tiempo (6-96 horas) a 37
OC. Los
in vitro
control (0 g /ml de quercetina) recibieron vehículo (DMSO; 4μl, que es equivalente al volumen de 100 mg /ml de quercetina)
La proliferación celular
la proliferación celular se evaluó mediante [) 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio] ensayos (MTT) como se describe anteriormente [14], con modificaciones [15]. células OVCAR3 y SW626 se hicieron crecer en placas de 24 pocillos que contenían DMEM y 10% de FBS. Después del tratamiento, se añadió MTT (0,1 mg /pocillo) a las células seguido de incubación durante 4 horas a 37
OC. Los cristales de formazano formados se solubilizan mediante la incubación de las células con 1 ml de alcohol isopropílico que se disolvió el producto formazon azul que se produjo durante la incubación con MTT. La densidad óptica se midió a 560 nm en un espectrofotómetro. Se calculó el número de células funcionalmente activas (es decir, los valores de densidad óptica) para las comparaciones entre grupos de control y tratados.
ADN fragmentación
El ADN se preparó a partir de cultivos tratados y no tratados como se describe anteriormente [16 ]. En pocas palabras, después del tratamiento las células se lisaron en 100 l de tampón de lisis (Tris 100 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM, SDS al 0,5%) tratados con 50 mg /ml de RNasa libre de DNasa a 37
OC durante 30 min y 100 mg /ml de proteinasa K durante 2 h a 50
OC. El ADN se extrajo con fenol-cloroformo y cloroformo y se precipitó en 3 volúmenes de etanol. El ADN (1 g /carril) se sometió a electroforesis en geles de agarosa 1%. Los estándares de peso molecular se ejecutan simultáneamente. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron usando un Chemidox (BioRad, Hercules, CA).
La extracción de RNA
El ARN total fue extraído de células OVCAR3 utilizando el método de extracción Trizol. cantidad y calidad de ARNm se determinaron midiendo su absorbancia en Genesys 6 de barrido UV /VIS Espectrofotómetro de barrido y también el uso de chips de ARN Experion (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).
Gene matriz
la expresión diferencial de genes reguladores de la angiogénesis se analizó utilizando Oligo GEArray proporcionado por el fabricante (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, EE.UU.). En pocas palabras, 3μg ARN total se transcribió de forma inversa en sondas de cDNA marcadas con dUTP-biotina-16 con el método TrueLabeling-AMP usando 16 l de ARN polimerasa 2.5X, 2 l 10 mM UTP biotinilado, la ARN polimerasa 2 l. Las membranas Superarray (OHS-026) se pre-hibridaron a 60
OC durante 2 horas. La hibridación de las sondas de ADNc marcados con biotina a las membranas se llevó a cabo a 60
OC durante la noche con agitación lenta. Las membranas hibridadas se lavaron en tampón de solución salina de citrato de sodio (una vez en 2x SSC, 1% de SCS y una vez en 0,1 x SSC, 0,5% SDS). Las membranas se incubaron con estreptavidina alcalina conjugada con fosfatasa, y luego con el sustrato quimioluminiscente CDP-Star. Las imágenes de las membranas fueron adquiridas mediante el sistema ChemiDoc XRS (BioRad) y los conjuntos de datos fueron exportados a GEArray Analyzer, el software desarrollado por SA Biociencia y analizado. El nivel de expresión relativa de cada gen se determinó mediante la comparación de la intensidad de señal de cada gen en la matriz después de la corrección para el fondo y la normalización.
Los estudios in vivo de tumores
ocho semanas de edad, los ratones nude (genotipo nu /nu, Harlan Laboratories (Madison, WI) se mantuvieron con agua y comida
ad libitum
en un ambiente libre de patógenos con un 12 h luz y 12 h oscuridad ciclo en un centro de cuidado de los animales en Kansas City VA Medical Center. cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas del Comité para el cuidado y uso de Animales de Kansas City VA Medical Center. OVCAR3 células (5X10
4) con Matrigel se inyectaron por vía subcutánea en el flanco trasero derecho de cada ratón (4-5 ratones por grupo). el crecimiento tumoral se controló después de la 2
nd día de la inyección y continuó hasta 24 días. se midieron la longitud y anchura del tumor usando un calibre y el volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula :. volumen del tumor = longitud x anchura x 0,5 ancho
Seis días después de la inyección, los ratones se alimentaron por vía oral con 10% de sacarosa (control) o 10% de sacarosa con AE al día (100 mg /kg de peso corporal.). La dosis de 100 mg /kg de peso corporal fue elegido sobre la base de un estudio preliminar donde esta dosis mostró un efecto óptimo en la inhibición del crecimiento del tumor. Después de 18 días de tratamiento AE, los ratones fueron sacrificados y se extrajeron los tumores y se fijaron en formaldehído al 4% tamponado en estudio.
La inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica se realizó sobre embebido en parafina-fijo formalina al 4% secciones de tejido de acuerdo con nuestros métodos anteriores [17,18]. Brevemente, las secciones de tejido se fijaron en formaldehído al 4% tamponado y desparafinaron en xileno, se rehidrataron en descendente concentraciones de alcohol, se lavaron con PBS y se bloquearon con suero de bloqueo (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 20 minutos. Las secciones fueron incubadas con beclin1, LC3B-II (Cell Signaling, Boston, MA), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) o HIF-1α (Novus Productos Biológicos, Littleton CO) de anticuerpos (1: 500 para todos los anticuerpos) durante la noche en una cámara húmeda a 4
OC. La inmunorreactividad se detectó usando anticuerpos secundarios conjugados con estreptavidina (Laboratorios Immpress-Vector) y las secciones se counterstained con hematoxilina. Las secciones fueron imágenes con un fotomicroscopio digital de Leica. Para la cuantificación de los microvasos, las secciones de tejido se analizaron a 50X de aumento y se contaron los vasos CD31-positivas. Se analizaron cuatro áreas de cada una de las 3 secciones por tumor.
OVCAR3 células fueron fijadas en formol al 4% tamponado y se lavaron en PBS. Después de bloquear en suero de bloqueo, las células se incubaron con beclin1, LC3B-II o HIF-1α (1: 200) de anticuerpos durante la noche a 4
OC. Las células se lavaron y se detectó la inmunoreactividad como se describe anteriormente. El número de células inmuno y el total de células se contaron y se calculó el porcentaje de células con inmunomarcación.
se realizaron Western Blot
Las transferencias Western como se describe anteriormente [19]. Brevemente, se extrajo la proteína ya sea de OVCAR3, SW626 células o de tumores y la concentración de proteína se midió por el método de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Cada muestra (50 mg) se realizó en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio-SDS. La proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se incubó con suero de bloqueo (Thermoscientific, Pittsburgh, PA) durante 1 h a temperatura ambiente seguido de incubación durante la noche a 4
OC con anticuerpo a Bax, Bcl2, caspasa 3, se escindió de la caspasa 3, caspasa 7, beclin1 o LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) o HIF-1α (1: 1000, Abcam). Después de lavar con Tris-NaCl-Tween 20 tampón, la membrana se incubó con anticuerpos secundarios (1: 10000, Abcam) a temperatura ambiente durante 1 h. La inmunorreactividad se detectó usando quimioluminiscencia mejorada (Thermoscientic).
El análisis estadístico
Los ensayos se realizaron por triplicado y cada experimento se repitió dos veces. Todos los datos gráficos se muestran como media ± S.E.M. Importancia fue probado mediante pruebas t no pareada, de Student de dos colas con varianza desigual (Microsoft Excel, Redmond, WA).
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo.
Resultados
AE inhibe OVCAR3 y las células SW626 proliferación
Para determinar si AE puede afectar a la proliferación de las células, hemos probado su efecto en tres líneas celulares diferentes : 1) una célula de cáncer de ovario (OVCAR3), 2) un adenocarcinoma primario de colon con metástasis en ovario (SW626), 3) una normal células de placenta humana (HS 799). Se utilizaron células de la placenta normal para determinar si AE tiene ningún efecto sobre células no neoplásicas. Además, se utilizó SW626 células para determinar si AE es capaz de inhibir los tumores que habían sufrido metástasis en otros sitios en el ovario, y para determinar si los efectos de la AE en OVCAR3 se duplicarían con otras células cancerosas. células OVCAR3 se trataron con concentraciones variables de AE (0-1.000 mg /ml) durante 24 horas y el número relativo de células se infiere utilizando ensayos de MTT. Concentraciones bajas (10 a 200 g /ml) de AE no afecta a la proliferación celular; sin embargo, la proliferación celular fue significativamente inhibido a concentraciones que van desde AE 300-1000 g /ml (Figura 1A). Se han tratado las células placentarias normales (HS 799 pl) con diferentes dosis (100 a 500 mg /ml) de AE para 48 horas para determinar si AE era generalmente citotóxico, y determinó que AE tenía esencialmente ningún efecto sobre la supervivencia celular en ninguna de las concentraciones probado (Figura 1B). Se han tratado tanto células SW626 OVCAR3 y en cultivo con concentraciones crecientes de AE durante diversos tiempos antes de realizar ensayos de MTT. La pérdida rápida de la proliferación celular ocurrió con concentraciones crecientes de AE en tanto OVCAR3 y SW626 células (Figura 1A, 1C, 1D). En ambas líneas celulares, la inhibición de la proliferación celular inducida por AE era dependiente de la concentración y tiempo de incubación (Figura 1C, 1D). La concentración más baja de AE prueba (100 mg /ml) provocó una inhibición significativa (p = & lt; 0,001) de las células OVCAR3 por 72 horas, y la dosis más alta (400 mg /ml) inhibió potentemente (p = & lt; 0,007) el crecimiento de OVCAR3 células en un 12 hora (Figura 1C). En las células SW626, AE a 100 g /ml provocó una inhibición significativa por 48 horas (p = 0,001), y en la dosis más alta de crecimiento se inhibió (p = & lt; 0,001) por 6 horas (Figura 1D)
A. Dosis efecto dependiente de la AE en la proliferación de las células OVCAR3. B. Dosis efecto dependiente de AE en la muerte celular en células de la placenta normal (HS-799 pl). DISCOS COMPACTOS. Dosis y el tiempo los efectos dependientes de AE en la proliferación OVCAR3 (C) y las células SW626 (D). E. Dosis efecto dependiente de la quercetina en la proliferación de las células OVCAR3. OVCAR3 y células SW626 se cultivaron y se hicieron crecer durante 2 días en DMEM en presencia de 10% de suero como se describe en Materiales y Métodos. Después de este período, los cultivos se alimentaron con medio que contiene 10% de suero y diferentes dosis de AE durante 24 horas excepto estudio dependiente del tiempo. Los datos son la media ± S.E.M. a partir de 6 observaciones independientes. *, P & lt;. 0.05, significativamente diferente del grupo de control tratado con vehículo
quercetina inhibe la proliferación celular en las células OVCAR3
Después de determinar que AE de la dosis y dependiente del tiempo reducen la proliferación celular en células OVCAR3, hemos probado si el tratamiento de células de OC con diferentes dosis (0 a 100 mg /ml) de la quercetina - uno de los componentes de AE-- podría reducir la proliferación celular en las células OVCAR3. La menor concentración de quercetina probado (5 mg /ml) provocó una inhibición significativa (p = & lt; 0,01) de las células OVCAR3 por 48 hr, y la dosis más alta (100 mg /ml) inhibió (p = & lt; 0,005) el crecimiento de OVCAR3 células por 24 horas (Figura 1E).
AE cambia la morfología de las células SW626 y OVCAR3
la inhibición de la proliferación puede cambiar el tamaño y la morfología de las células individuales [20]. Por lo tanto, observamos detenidamente la morfología de las células SW626 OVCAR3 y después del tratamiento con 0-300 g /ml de AE. La morfología de las células OVCAR3 tratados con 100 y 200 g /ml AE era indistinguible de las células no tratadas después de 24 horas (Figura 2 A-C), mientras que el tratamiento con 300 mg /ml para 24 horas causó la mayoría de las células para convertirse en redondo ( Figura 2D). AE también indujo alteraciones dependientes de la dosis en la morfología de las células SW626 después de 24 horas (Figura 2E-H). Un examen más detallado reveló que el tratamiento con 300 g /ml de AE por 24 horas inducidas vacuolas citoplasmáticas en tanto OVCAR3 y células SW626 (figuras 2J, 2N, 2L, 2P). Estos cambios morfológicos sugieren que la muerte celular puede estar ocurriendo desde la muerte celular es a veces acompañado por la formación de vacuolas [21]. Otros experimentos se realizaron con la concentración /ml 300 g de AE.
A-D. efecto dependiente de la dosis de AE en la morfología celular y la densidad de OVCAR3: A = Control, B = 100 mg /ml de AE, C = 200 mg /ml de AE, D = 300 mg /ml de AE. E-H. Dosis efecto dependiente de la AE en la morfología y la densidad celular de las células SW626. E = Control, F = 100 mg /ml AE, G = 200 mg /ml AE, H = 300 g /ml AE. I-J, M-N. AE aumentó vacuolas citoplásmicas en OVCAR3. I y M = Control, J y N = 300 mg /ml AE. K-L y O-P. AE aumentó vacuolas citoplásmicas en SW626. K y O = Control, L y P = 300 mg /ml de AE. OVCAR3 y células SW626 se cultivaron y se hicieron crecer durante 2 días en DMEM en presencia de 10% de suero como se describe en Materiales y Métodos. Después de este período, los cultivos fueron alimentados con 10% de suero medio y diferentes dosis de AE durante 24 horas. Algunas de las vacuolas se indican con flechas (N y P). Bar = 50 micras.
AE no causó muerte celular apoptótica en células OVCAR3 y SW626
A la vista de los cambios morfológicos descritos anteriormente, lo que sugiere que el tratamiento de líneas celulares con 300 OC g /ml de AE muerte celular inducida, quisimos determinar si el tratamiento con AE indujo la apoptosis de estas líneas celulares. Se han utilizado dos enfoques diferentes para explorar esta posibilidad: 1) El examen de ADN para la fragmentación internucleosomal, una característica de la muerte celular por apoptosis, y; 2) transferencia de Western de proteínas específicas (por ejemplo, bax, bcl
2, caspasa 3, caspasa 3 escindida y la caspasa 7) que participan en la ruta apoptótica. Para determinar si AE causada fragmentación internucleosomal de ADN, el ADN preparado a partir de cultivos de control y tratados con AE se fraccionó en geles de agarosa al 1% 24 y 96 horas después de la adición de AE (300 mg /ml). Aunque la degradación del ADN se observó en estas preparaciones, no había aparente fragmentación del ADN, incluso después de 96 horas de tratamiento (Figura 3A-B), lo que sugiere que la muerte celular no se produjo por apoptosis. Para explorar más a fondo el papel potencial de las vías de apoptosis en la muerte de las células AE, transferencias de Western tratado por Bax, Bcl
2, se realizaron caspasa 3, se escindió de la caspasa 3 y caspasa 7. En las células OVCAR3, el tratamiento AE redujo la expresión de Bax, Bcl
2 y se escindió de la caspasa 3 (Figura 3C, 3E y 3I), y no cambió la expresión de caspasa 3 o la caspasa 7 proteínas (Figura 3G y 3K). En las células SW626, el tratamiento AE no cambió la expresión de Bax, Bcl
2, caspase3, o caspase7 (Figuras 3D, 3F, 3H y 3L) y redujo la expresión de la caspasa 3 escindida (Figura 3J). En conjunto, los resultados apoyan la conclusión de que las vías apopotic no se activan en AE trataron líneas celulares de OC.
A-B. fotografías representativas de la fragmentación del ADN en células OVCAR3 (A) y células SW626 (B). OVCAR3 células SW626 y fueron tratados con 300 mg /ml de AE como se describe en Materiales y Métodos. Después del tratamiento, se extrajo el ADN y electroforesis en gel de agarosa al 1%. El tamaño en pares de bases de los marcadores de peso molecular (carril) se indica al lado del gel. El número en el lado derecho indica la longitud en nucleótidos para varios de las bandas. C24 = Control de las 24 horas, C96 = Control de 96 horas, T24 = tratamiento AE 24 horas, T96 = AE 96 horas de tratamiento, + C = Control positivo, S = estándar de tamaño de ADN. C-L. Las expresiones de las proteínas de apoptosis después del tratamiento AE (300 mg /ml) en OVCAR3 y las células SW626. fotografías representativas de Western blot de Bax (C, D), Bcl
2 (E, F), caspasa 3 (G, H), se escindió de la caspasa 3 (I, J), caspasa 7 (K, L) en OVCAR3 (C, e, G, I, K) y SW626 (D, F, H, J, L) las células después del tratamiento AE se muestran en la parte superior. β-actina se detectó como un control para cada mancha. El histograma correspondiente a cada fotografía representa la relación del análisis densitométrico de cada banda a la respectiva banda de β-actina. El cultivo se trató con 0 o 300 mg /ml de AE por 24 horas. Después del tratamiento, la proteína de OVCAR3 y células SW626 se extrajo y 30 g de proteínas se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE. A continuación, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y immunoblotted contra la apoptosis anticuerpos relacionados - Bax, Bcl
2, caspasa 3, caspasa 3 o troceados caspasa 7. Los valores son medias ± S.E.M. de 4 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05, en comparación con el grupo control
AE induce la autofagia en las células SW626 y OVCAR3
Recientes
in vivo
y
in vitro.
evidencia sugiere que una serie de fármacos contra el cáncer ejercen sus efectos, al menos parcialmente, a través de sus efectos en la autofagia [22,23]. Los estudios anteriormente sugieren que las vías apopotic no se activaron mediante tratamiento AE, así que optamos por determinar si se ha activado la autofagia en las células tratadas OC AE. Específicamente, se trataron OVCAR3 y células SW626 con AE para determinar los efectos sobre la expresión de beclin1 proteins- autofágicas y LC3B-II usando técnicas de inmunocitoquímica e inmunotransferencia. La inmunorreactividad para ambos beclin1 y LC3B-II estaba presente en no tratado OVCAR3 y células SW626 (Figura 4 A, B, E, F). La intensidad de la inmunotinción y el número de células immunopositive, sin embargo, se incrementaron en un tratamiento AE [Figura 4 A-H]. análisis de transferencia de Western era coherente con los resultados de la inmunotinción, lo que demuestra que el tratamiento con AE aumentó la expresión de beclin1 y LC3B-II tanto en OVCAR3 y células SW626 (Figura 4 I-P). Estos datos sugieren que la autofagia se activa en las células AE tratados. También se estudió la expresión de las proteínas autofágicas beclin1 y LC3B-II después del tratamiento quercetina (5 mg /ml para 48 horas) en células OVCAR3 utilizando inmunotransferencia. Expresión de beclin1 y LC3B-II fue significativamente mayor en las células tratadas con quercetina que el control (Figura 4 Q-T).
inmunotinción de beclin1 y LC3B-II en OVCAR3 y control de las células SW626 y después de ser tratado con 300 mg /ml AE (A, B, e y F). Los histogramas muestran el porcentaje de beclin1 (C y D) y LC3B-II (G y H) las células inmunopositivas como un porcentaje del total de células. OVCAR3 y células SW626 se cultivaron y se hicieron crecer durante 2 días en DMEM en presencia de 10% de suero como se describe en Materiales y Métodos. Después de este período, los cultivos se alimentaron con medio que contiene 10% de suero y AE durante 24 horas. Las células se fotografiaron a 400 aumentos. Expresión de beclin1 en la proteína total de OVCAR3 (I) y las células SW626 (J) y la expresión de LC3B-II en la proteína total de OVCAR3 (M) y SW626 (N) de las células después de ser tratado con AE (300 mg /ml) durante 24 horas fotografía representativa de Western blot para beclin1 y LC3B-II se muestran en la parte superior. β-actina se detectó como control para cada mancha. Media + S.E.M. valores de la relación densitométrico de beclin1 (K y L) y LC3B-II (O y P) con β-actina se muestran en la parte inferior de cada gel respectivo. Q-T: tratamiento quercetina (5 g /ml para 48 horas) induce la expresión de beclin1 (Q, R) y LC3B-II (S, T) en las células OVCAR3. Después del tratamiento, la proteína de OVCAR3 y células SW626 se extrajo y 50 g de proteínas se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE. A continuación, la proteína se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y inmunotransferencia contra anticuerpos beclin1 y LC3B-II. Después de inmunodetección, beclin1 y LC3B-II bandas positivas se midieron densitométrica y se normalizaron con los valores de ß-actina. Los valores son medias ± s.e.m. de 6 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05, en comparación con el grupo control. Bar = 50 micras.
AE inhibe los genes relacionados con la angiogénesis en células OVCAR3
A la vista del hecho de que una masa tumoral en crecimiento debe establecer un suministro vascular y recientes informes de que la angiogénesis podría ser inhibida por remedios herbales que incluye AE [8], hemos querido determinar si AE podría inhibir la angiogénesis
in vitro
. Específicamente, se estudiaron los efectos del tratamiento AE sobre la expresión de genes angiogénicos en tratado con AE (300 mg /ml) y células OVCAR3 no tratados utilizando la matriz Human angiogénico OligoGE que detecta 112 genes involucrados específicamente en la angiogénesis (SA Bioscience Corporation). Los experimentos se realizaron en tres estudios independientes y los resultados se muestran en la Figura 5 A-D. Muchos de los genes (verde
*) se expresaron a niveles reducidos en las células tratadas con AE en comparación con los controles no tratados (Figura 5B). A clustergram que representa los resultados obtenidos en el control y los cultivos tratados con AE se muestra en la Figura 5C. La expresión de COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL1β, PDGFB, TNFRSF12A y HIF-1α se redujeron a menos del 40% de los niveles de control (Figura 5D), con HIF-1α se inhibe en la mayor medida.
A. Las fotografías representativas de matriz de micro de control y cultivo tratado-AE. El cultivo se trató con 0 o 300 mg /ml AE para 24 h. Después del tratamiento, el ARN se aisló utilizando Trizol método de extracción. Las membranas se hibridaron con Superarray marcado con biotina cDNA, se incubaron con estreptavidina alcalina conjugada con fosfatasa, la expresión del gen se detectó con el sustrato quimioluminiscente CDP-Star. B. diagrama de dispersión Representante de AE-tratada vs cultivos de células de control. Muchos genes (verde
*) están bajo expresado en el grupo tratado con AE. C. Panel izquierdo: Mapa de calor (clustergram) de control y los cultivos tratados con AE. Nueve genes que se reducen en más del 70% se indican mediante puntas de flecha en el lado derecho del mapa de calor. El panel medio: un mapa de calor aumentada que muestra la reducción de expresión de HIF-1α en el grupo tratado con AE. Panel derecho: La magnitud de la expresión génica. D. Representación gráfica de la expresión génica relativa utilizando el fondo global y GAPDH como gen de referencia y convertido a veces el cambio de valores (AE frente a control).
AE inhibe la expresión de HIF-1α in vitro
En los experimentos anteriores, se demostró que el tratamiento con AE expresión de numerosos genes asociados con la angiogénesis suprimida. Con el fin de determinar si la disminución de la expresión de genes correspondió a la disminución de los niveles de proteína, se analizó específicamente el efecto del tratamiento con AE en la producción de la proteína HIF-1α en las células OVCAR3 utilizando inmunocitoquímica y transferencias de Western. Tanto inmunocitoquímica y Western blot resultados mostraron una reducción significativa la expresión de HIF-1α en cultivos de células OVCAR3 (Figura 6 A-B), más el apoyo a la idea de que el tratamiento AE suprime la angiogénesis.
A. Fotomicrografía que muestra una expresión reducida de immunostatining HIF-1α en las células después del tratamiento OVCAR3 AE. El histograma muestra el porcentaje de células inmunopositivas HIF-1α comparación con las células totales. células OVCAR3 se cultivaron y se hicieron crecer y se trataron con 0 o 300 g /ml de AE por 24 horas. Las células fueron immunostained con anticuerpos HIF-1α y se fotografiaron con un aumento de 400X. Bar = 50 micras. Los valores son medias ± s.e.m. de 4 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05, en comparación con el grupo control. B. Una fotografía representativa de Western blot para HIF-1α se muestra en la parte superior. β-actina se detectó como un control para cada mancha. Media + S.E.M. valores de la relación densitométrico de HIF-1α y β-actina se muestran en la parte inferior del gel. Después de inmunodetección, se midió el volumen de bandas positivas HIF-1α densitométricamente y normalizado con los valores de beta-actina. Los valores son medias ± s.e.m. de 4 experimentos independientes. *, P & lt; 0,05, en comparación con el grupo control.