Extracto
Quinasa de adhesión focal (FAK) es una tirosina quinasa citoplasmática que es elevada en una variedad de cánceres humanos. Mientras FAK está implicada en muchos procesos celulares que son perturbados en el cáncer, incluyendo la proliferación, la actina y la dinámica de adhesión, la polarización y la invasión, sólo hay información limitada sobre el papel de FAK en la supervivencia de radiación. Hemos evaluado si FAK es un objetivo general de la radio-sensibilizantes, como se ha sugerido en los informes anteriores. Se utilizó un sistema genético limpio en el que FAK se eliminó de las células de carcinoma de células escamosas de ratón (SCC) (FAK - /-), y se reconstituyó con el tipo salvaje exógena FAK (en peso). Sorprendentemente, la ausencia de FAK se asoció con un aumento de la radio-resistencia en las células SCC avanzados. FAK reexpresión inhibe la transcripción mediada por p53 sobre regulación de p21, y un sub-conjunto de otros genes diana de p53 que participan en la reparación del ADN, después del tratamiento con radiaciones ionizantes. Además, el agotamiento de p21 promueve la radio-sensibilización, lo que implica que la inhibición mediada por FAK de la inducción de p21 es responsable de la relación de radio-sensibilidad de las células SCC FAK-competente. Nuestro trabajo se suma a un creciente cuerpo de evidencia de que existe una estrecha relación funcional entre la integrina /señalización de FAK y la vía de p53 /p21, pero demuestra que el papel de la FAK en la supervivencia después de la tensión es dependiente del contexto, al menos en las células cancerosas. Sugerimos que no debe haber precaución al considerar la inhibición de FAK en combinación con la radiación, ya que esto no siempre puede ser clínicamente ventajoso
Visto:. Graham K, Moran-Jones K, Sansom DO, Brunton VG, Marco MC ( 2011) FAK supresión Promueve la inducción mediada por p53 de p21, las respuestas de los daños de ADN y Radio-resistencia en células de cáncer escamoso avanzado. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10.1371 /journal.pone.0027806
Editor: Roger Chammas, Facultad de Medicina, Universidad de Sao Paulo, Brasil |
Recibido: 27 Junio, 2011; Aceptado: 25 Octubre 2011; Publicado: December 14, 2011
Derechos de Autor © 2011 Graham et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Cancer Research UK de subvención del programa (C157 /A9148). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la radioterapia es uno de los pilares de la terapia del cáncer en múltiples contextos de enfermedad, pero el tratamiento no siempre es curativa. Una gran cantidad de esfuerzo se dirige no sólo a mejorar la entrega de la radioterapia por métodos espaciales y dosimétricos cada vez más sofisticados, y también para identificar las estrategias de combinación para mejorar las respuestas de radiación. En lo que se refiere de este último, la radiación ionizante puede promover la activación de los receptores de y no receptoras tirosina quinasas (TK), y la modulación de las influencias citoprotectores, como el aumento de reparación del ADN, la proliferación y la reducción de la apoptosis [1], [2], [3] , [4], [5], [6], [7]. Desde estas respuestas contribuyen a celular de radio-resistencia, lo que, obviamente, puede limitar la eficacia de la radioterapia en el tratamiento del cáncer, la comprensión de la contribución de las TK puede proporcionar nuevas dianas moleculares para la radio-sensibilización, y potencialmente mejorar las respuestas tumorales. Un ejemplo es el factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), que es la corriente de los conocimientos tradicionales más ampliamente estudiado en este contexto. evidencia preclínica fuerte implica una capacidad de inhibición del EGFR para mejorar los efectos antitumorales de la radiación ionizante, y esto se ha traducido en la práctica clínica basada en los resultados de un ensayo de fase III en cáncer de cabeza y cuello [8], [9]. Esto demuestra la importancia de las estrategias de intervención robustos para establecer si una determinada TK celular contribuyen a la radio-sensibilidad, o la radio-resistencia.
A diferencia de la evidencia emergente para EGFR, el papel de la otra TK, especialmente la no TK del receptor, es menos claro. Quinasa de Adhesión Focal (FAK) se encuentra en los sitios de adhesión integrina desde donde se transduce señales en las células que controlan múltiples propiedades asociadas con el cáncer, incluyendo adhesión y actina dinámica, migración, invasión, la angiogénesis, la protección de las células de la muerte celular suspensión inducida ( a veces denominado anoikis) y la proliferación en 3 dimensiones [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK se expresa a menudo en off en el cáncer humano [18], [19], [20], [21], y desempeña un papel en la tumorigénesis, como se demuestra en varios tipos de tejidos
in vivo
[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Anteriormente puso de manifiesto que la FAK supresión inhibe el desarrollo del cáncer de piel de ratón y la progresión maligna, y que la supresión de FAK promueve la muerte por apoptosis de los queratinocitos de la piel normal en la cultura [25]. Más recientemente, también hemos hecho uso de la K14-Cre-ER
T2 /f
lox
sistema -FAK ratón para derivar células cancerosas escamosas (SCC) de los tumores inducidos químicamente [29], [ ,,,0],30]. FAK deleción causa múltiples defectos, incluyendo la polarización y las respuestas a direccional señales, tales como la invasión quimiotáctica, así como problemas de crecimiento en 3 dimensiones (aunque el crecimiento en el plástico 2-D no se ve afectada) y retraso en el crecimiento como xenoinjertos
in vivo deteriorado
[29], [30].
se cree
FAK mediadas funciones pro-supervivencia a jugar un papel importante en la supervivencia de las células cancerosas, y que esto implica probablemente la vía de p53 [31]. Por otra parte, el promotor de FAK contiene elementos de respuesta de p53 y puede ser regulada hacia abajo por el daño de ADN de una manera dependiente de p53, mientras que la expresión de FAK se correlaciona con la p53 mutante en el cáncer de mama [32], [33], [34]. También hay
e in vitro
in vivo
evidencias que demuestran que la FAK knock-down puede sensibilizar las células a la quimioterapia citotóxica [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. En contraste, hay relativamente pocos estudios sobre el papel de la FAK en la sensibilidad a la radiación. FAK fosforilación es inducida después de la exposición a la radiación ionizante
in vitro
[42], aunque esto sólo puede haber sido una respuesta de estrés transitorio como el papel de la FAK no fue explorar. Sin embargo, existe un informe que siRNA mediada por FAK knock-down de radio promueve la sensibilización de las células de cáncer de páncreas [43], aunque el mecanismo subyacente no está claro. Además, la sobre expresión de FAK en células HL-60 confiere resistencia marcada a una variedad de estímulos apoptóticos, incluyendo la radiación ionizante [44], todos lo que sugiere que la inhibición de la señalización a través FAK es probable que promueva la radio-sensibilidad. Aquí hemos utilizado un sistema genético supresión /reconstitución limpia para poner a prueba el papel de FAK en respuesta a la radiación celular
in vitro
y
in vivo
, específicamente en las células SCC FAK-deficientes (y su FAK-expresión contrapartes), y comienzan a diseccionar el mecanismo subyacente.
resultados
Estamos derivados de células SCC de los cánceres de células escamosas inducidos químicamente en ratones que expresan un
floxed
forma de el exón codificante de unión a ATP de
FAK
bajo el control de la piel específicos (K14)
Cre recombinasa
fusionado con el receptor de estrógeno [25]. Escisión de
floxed CD -
FAK
en un solo tratamiento con 4-hidroxi-tamoxifeno (4-OHT) dio lugar a la deficiencia completa de la proteína FAK [29], [30] (véase también la Fig. 1C y 2B), que podríamos revertir reexpresando peso FAK, que nos permite estudiar cómo las células cancerosas a hacer frente a la perturbación grave de la vía de señalización de la integrina /FAK. Para evaluar la radio-sensibilidad, se realizó un ensayo clonogénico de dilución limitante comparación de FAK - /- con células FAK en peso en dosis crecientes de radiación de hasta 10 Gy. Esto reveló que la ausencia completa de FAK en estas células se asocia con un aumento de radio-resistencia
in vitro
(Fig. 1A). Una diferencia estadísticamente significativa en la fracción de supervivencia se observó a dosis de 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy y 10 Gy (valores de p de 0,0136, 0,0097, 0,0045, y 0,0036, respectivamente, se analizó mediante la prueba t de Student para datos independientes, n = 9).
(a) poblaciones subconfluentes de FAK - /- y WT células FAK se tripsinizaron y se diluyeron en medio de cultivo a una concentración final que permita el crecimiento de colonias individuales. se añadieron 100 l de esta suspensión a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de la incubación durante 6 horas para permitir la fijación de las células, las placas se irradian con 0, 2, 4, 6, 8 o 10 Gy. Las células se analizaron por triplicado para cada dosis de radiación. Después de 7 días, se contó el número de colonias por placa y la fracción superviviente calcula. La representación gráfica se muestra representa la media ± SEM de tres experimentos separados. fracciones supervivientes en cada dosis de radiación se compararon con las células de la ONU-irradiado por la prueba t de Student para datos independientes, n = 9. (B) 2 × 10
5 FAK - se inyectaron células y FAK en peso por vía subcutánea en el flanco derecho - /de ratones desnudos hembra. Los xenoinjertos se les permitió llegar a aproximadamente 150 mm
3. Los animales se irradiaron con 5 Gy de irradiación de todo el cuerpo o mock irradiado. Después de 7 días se midieron los xenoinjertos y se sacrificaron los ratones. Se muestran los volúmenes medios de xenoinjertos ± SEM antes de la radiación (paneles superiores) y después de la radiación (paneles inferiores). El análisis estadístico de mock irradiado frente a volúmenes irradiados a los 7 días se evaluó mediante la prueba t no apareado de Student, * indica p & lt; 0,05, n = 10. (C) Los extractos de proteína se prepararon a partir de los xenoinjertos, separados por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa , y la inmunotransferencia con anti-FAK (superior) y los anticuerpos anti-β-actina (inferiores). Se muestra una muestra de cinco extractos distintos de cada grupo. Se añadió un control positivo (extracto de células en peso FAK) en el carril de final de la FAK - /-. muestras de xenoinjerto
(A) FAK - /- y las células FAK wt se irradiaron con 5 Gy en 70% de confluencia y los lisados preparados en los puntos de tiempo indicados. entonces inmunotransferencia se realizó con anti-p21 (panel superior), y anti-β-actina (panel inferior). (B) Los extractos de proteína se prepararon a partir subconfluent FAK - poblaciones de células y FAK en peso, separados por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, y se transfirieron con anti-FAK (panel superior), anti-p21 (panel medio) y anti - /β-actina (panel inferior) anticuerpos. (C) Se extrajo ARN de subconfluent FAK - /- células y FAK en peso, PCR realizada y producto analizado. carga ß-actina también se muestra (panel inferior). (D) Los extractos de proteína se prepararon a partir FAK - /- poblaciones de células y FAK en peso en el nivel de confluencia indicada. a continuación, se realizó la inmunotransferencia con anticuerpos anti-p21 (panel superior) y anti-β-actina (panel inferior).
También probamos si FAK influenciado de radio-sensibilidad
in vivo
, mediante la comparación de la FAK - /- y FAK en peso SCC xenoinjertos. 2 × 10
se inyectaron 5 células por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones hembra desnudos y los animales fueron ya sea irradiado con 5 Gy (en forma de irradiación de todo el cuerpo) o mock irradiado cuando los xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 150 mm
3. Este tamaño fue seleccionada como la FAK - /- tumores habían superado un retraso inicial en su crecimiento
in vivo
, y su tasa de proliferación en este punto no difirió significativamente de sus contrapartes de FAK en peso. Estudios anteriores demostraron que la cepa CD1 de ratones desnudos podía tolerar dosis corporal total 5 Gy durante 10-14 días. Después de 7 días, se midieron los xenoinjertos y los animales fueron sacrificados. volúmenes de los tumores se calcularon antes y después de 5 Gy de irradiación o irradiación simulada, y se analizaron mediante la prueba t de Student para datos independientes. Se observó una reducción estadísticamente significativa en el volumen del tumor en los xenoinjertos en peso de FAK irradiados en comparación con los controles simulados irradiado (p = 0,0030, n = 10), pero esto no se ha replicado en los FAK - /- xenoinjertos (p = 0,3300, n = 10) (Fig. 1B). Los extractos de proteína se prepararon a partir de 5 ratones en cada grupo y se sometieron a transferencia de Western para confirmar el nivel de expresión de FAK en FAK - /- y los tumores FAK WT (Fig. 1C). Los bajos niveles de FAK presente desde FAK - /- es probablemente de la pequeña cantidad de estroma o infiltrado inmune (figura 1C.) De material derivado de un tumor
Las células SCC hemos utilizado aquí expresamos p53 de tipo salvaje (confirmadas. por secuenciación (no mostrado)), y se identificó una diferencia FAK-dependiente en la inducción del gen diana de p53, p21, después de la irradiación (Fig 2;. véase también más adelante). Específicamente, la inducción de p21 fue evidente por 2 horas después de tratar FAK - /- células con 5 Gy de irradiación; por el contrario, p21 no fue inducida cuando FAK estaba presente (Fig. 2A). Curiosamente, los niveles basales de proteína p21 y ARNm en las poblaciones sub-confluentes de ambos FAK - /- células y FAK WT fueron similares (Fig 2B y 2C, respectivamente.), Mientras que los niveles de p21 fueron elevados en ambas líneas celulares con el aumento de la confluencia (Fig . 2D). Esto está en consonancia con el papel ampliamente aceptado para p21 en detención del ciclo celular inducida por contacto (Fig. 2D), y demostró que un estímulo diferente fue capaz de aumentar los niveles de p21 independientemente del estado de la FAK. Para garantizar la discrepancia en la inducción de p21 tras la exposición a radiaciones ionizantes, no estaba relacionada con las diferencias en la densidad celular, se tuvo cuidado en todos los experimentos para asegurar que las células se irradiaron a una confluencia comparables, por lo general el 70%.
La FAK -dependence de la regulación de p21 se reprodujo
in vivo
. Específicamente, se inyectaron ratones desnudos por vía subcutánea con 2,5 × 10
5 FAK - /- células o FAK en peso, se permitió que los xenoinjertos de establecer, y los animales se irradiaron con 5 Gy de irradiación cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 500 mm
3 en volumen. Los ratones fueron sacrificados a las 0, 2 horas, 6 horas, y 24 horas después de la irradiación (n = 3 por grupo) y los niveles de p21 se evaluaron tanto por transferencia de Western de lisados tumorales y la inmunohistoquímica (IHC) tinción de tejido embebido en parafina. Los FAK - /- xenoinjertos mostraron un aumento en los niveles de proteína p21 tan temprano como 2 horas después de la irradiación (Fig 3A, paneles de la izquierda.); los niveles de p21 apareció máxima alrededor de este tiempo. El aumento de p21 también fue visible por IHC (Fig. 3A, paneles de la derecha). La media de positividad p21 (basado en la puntuación de 20 campos) se analizó a través de todos los puntos de tiempo y esto demostró una diferencia significativa en los niveles de p21 en los tumores de irradiado
frente
animales un-irradiadas (Kruskal-Wallis, p = 0,038, n = 3). Además, la comparación individual de los puntos de tiempo separados ilustra un aumento estadísticamente significativo en la puntuación p21 en comparación con los niveles de referencia (Mann Whitney, p = 0,0404, n = 3). En contraste, los xenoinjertos en peso de FAK no demostraron ningún aumento constante en los niveles de p21 en cualquiera de los puntos de tiempo examinados. Western Blot de FAK que expresan WT-lisados tumorales confirmó la presencia de FAK, pero no hubo un incremento apreciable en los niveles de proteína p21 (Fig. 3B). El análisis adicional de IHC (Fig. 3B, paneles de la derecha) confirmó que no hubo aumento significativo en la expresión de p21 a las 2 horas (p = 0,6625), 6 horas (p = 0,6625), o 24 horas (p = 0,3827) (Mann Whitney, . n = 3), en comparación con los controles
(A) FAK - /- se inyectaron células SCC o B) FAK (wt células SCC, por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones hembra desnudos. Cuando los xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 500 mm
3, los ratones se irradiaron con 5 Gy y se sacrificaron a las 0, 2 horas, 6 horas, y 24 horas (n = 3 por grupo). La mitad de la xenoinjerto se fijó en formalina entonces embebidos en parafina y la otra mitad se congeló rápidamente en nitrógeno líquido. Los extractos de proteína se prepararon a partir de las secciones congeladas, separadas por SDS-PAGE, transferidos a nitrocelulosa, y se transfirieron con anti-FAK (panel blot superior), anti-p21 (panel blot medio), y anti-β-actina (panel inferior blot ). Las secciones incluidas en parafina se tiñeron con p21 y las células p21 positivas visualizadas por IHC (paneles de la derecha). Representativos imágenes de campo claro de tejido teñido de p21 a las 0, 2 hrs, 6 hrs y 24 hrs radiación POST se muestran (barra de escala, 0,1 mm).
Se extrajeron los ARN de las poblaciones sub-confluentes de FAK - /- células y FAK wt en varios puntos de tiempo después de 5 Gy de irradiación, y QRT-PCR se realizó usando los cebadores para p21 endógeno. Hubo un aumento bifásico en los niveles de mRNA p21, alcanzando un máximo de 2 horas y 6 horas después de la irradiación en FAK - /- las células; por el contrario los niveles de mRNA p21 no fueron inducidos en la línea celular de FAK en peso después de la irradiación (Fig. 4A). ARN también se extrajo de ambas líneas celulares después de 2 horas una gama de dosis de radiación (0, 2, 5, 10, 20, y 30 Gy) y se analizaron mediante qRT-PCR. Hemos encontrado que los niveles de ARNm de p21 aumentaron en FAK - /- células SCC de una manera dependiente de la dosis (rango de 2 Gy a 10 Gy); una mayor escalada de dosis no dio lugar a un aumento de más del mRNA p21. El aumento dependiente de la dosis en la transcripción p21 fue atenuada con la re-expresión de FAK en peso en las células SCC FAK-deficiente (Fig. 4B). En experimentos paralelos, se encontró que el aumento de los niveles de estado estacionario de la proteína p21 eran evidentes después de la irradiación a diferentes dosis en FAK - /- células SCC, y que esto se atenuó cuando la expresión de FAK se restauró (Fig. 4C, comparar los paneles izquierdo y derecho) . Para complementar la supresión genética de la FAK, también se utiliza un inhibidor de quinasa FAK (PF-562271; [45]) a una dosis de 0,5 M (que es óptima para la inhibición de la actividad quinasa FAK en estas células (no mostrados)) para 2 horas antes de la irradiación, y recogidos lisados de proteínas para inmunotransferencia a las 0, 2, 4, y 6 horas después de 5 Gy. los niveles de p21 aumentaron visiblemente por 2 horas después de la radiación en 0,5 M PF-562271 tratado FAK en peso células en comparación con las células no tratadas (Fig 4D.)
(A) ARN fue extraído de subconfluent FAK -. /- y FAK wt poblaciones de células en diversos puntos temporales después de 5 Gy de irradiación. a continuación, se realizó un análisis qRT-PCR por triplicado. veces de incremento en los niveles de mRNA p21 se calculó utilizando el método ddC (t) con β-actina como control de carga. Representación gráfica de la media combinada ± SEM de tres experimentos se demuestra. (B) Se extrajo ARN de FAK sub-confluente - /- y las poblaciones de células FAK en peso 2 horas después de 0, 2, 5, 10, 20, y 30 Gy de irradiación. entonces cDNA se generó y QRT-PCR para p21 realizado como se describe anteriormente. (C) Los extractos de proteína se prepararon a partir FAK - /- poblaciones de células y FAK en peso de 2,5 horas después de la exposición a varias dosis de radiación. Los extractos se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, y se transfirieron con anti-p21 (paneles superiores) y anti-β-actina (paneles inferiores). Se incubaron (D) las células WT FAK durante 2 horas, ya sea con el inhibidor de FAK PF-562271 a 0,5 M, o sólo el 0,1% de DMSO, a continuación, irradiados con 5 Gy. Los extractos de proteína se prepararon a 0, 2, 4, y 6 horas y las inmunotransferencias se sondaron con anti-p21 (paneles superiores), y anti-β-actina (paneles inferiores). inmunotransferencias representativas del 0,1% de DMSO (izquierda) y 0,5 M de drogas tratadas (derecha) se muestran las poblaciones de células.
Como era de esperar, los niveles de p21 en estado estacionario en las células SCC fueron al menos parcialmente dependiente de p53, y p21 inducida por la radiación en las células SCC fue inhibida por knock-down de p53 usando siRNA (Fig. 5A-C). Sin embargo, también señaló que la inducción de p53 después de la irradiación no era particularmente fuerte y fue similar en ambos FAK - /- y FAK en peso SCC células (Figura 5D.), Lo que indica que la presencia de la FAK estaba dando lugar a cierta disociación de p53 y p21 de inducción , y la sensibilidad a la irradiación en estas células cancerosas. La densitometría se llevó a cabo para cuantificar los cambios veces en los niveles de p21 y la proteína p53 después de la irradiación de las células SCC-FAK FAK dominio y deficientes (Figura S1). Estos resultados implican que un aumento sustancial de la transcripción y la expresión de la proteína p21 se produce en FAK - /- células después de la dosis clínicamente relevantes de la radiación ionizante, y que esta respuesta es mitigado por la presencia de FAK. Por lo tanto, las funciones de FAK en estas células de cáncer avanzado para suprimir la transcripción dependiente de p53 de p21 después de la irradiación. Esto no está vinculado de forma visible a la diferencia de la inducción de la detención del ciclo celular (Figura S3 (determinado como se describe en Métodos S1)) o apoptosis, que es difícil de detectar después de la irradiación de células SCC, a juzgar por la falta de contenido de ADN sub-G1 (no mostrado) . Esto es a pesar de la regulación diferencial de la expresión del gen diana PUMA p53 (Figura S4) que puede estar asociada con la apoptosis
(A) FAK -. /- Células se transfectaron con 100 nM siRNA (piscina o p53 revueltos siRNA) en 50% de confluencia. Después de 24 horas, los extractos de proteína se prepararon y inmunotransferencias sondadas con anti-p53 (panel superior), anti-p21 (panel medio) y anti-β-actina (panel inferior). (B) Densitometría comparación de los niveles de p21 en FAK - /- se llevó a cabo extractos de proteínas tratados con una piscina revueltos de siRNA o p53 siRNA. Los niveles de proteína p21 se normalizaron a beta-actina y los resultados mostrados son representativos de uno de tres experimentos separados. (C) FAK - /- células en 50% de confluencia fueron transfectadas ya sea con 100 nM revueltos siRNA o 100 nM siRNA p53, se incubaron durante 24 horas, luego se irradió con 5 Gy. Los lisados se recogieron en los puntos temporales indicados y inmunotransferencias sondadas con anti-p53 (panel superior), anti-p21 (panel medio) y anti-β-actina (panel inferior). (D) Los extractos de proteína se prepararon a partir FAK - /- células WT y FAK 2 horas después de la exposición a varias dosis de radiación (0-30 Gy). Los extractos se separaron por SDS-PAGE e inmunotransferencias sondadas con anti-p53 (paneles superiores) y anti-β-actina (paneles inferiores). El carril de la derecha en cada gel contiene extractos de proteínas de FAK - /- células o FAK wt expuestas al tratamiento durante la noche con 0,1 M de actinomicina D.
El trabajo previo ha establecido una relación clara entre la FAK y p53 que promueve la supervivencia después de la señalización inducida por estrés (en las células que carecen de p21),
vía
el dominio FAK FERM unión a p53 en el núcleo, lo que facilita la degradación de p53 y la supervivencia [46]. Por lo tanto, immunoprecipitated FAK a partir de lisados de células FAK en peso SCC antes y después de 5 Gy de irradiación, y immunoblotted para p53 y para Src (como control positivo). Como era de esperar, Src estaba obligado a FAK, y esto no fue modificado por la irradiación (Figura S2A (determinada como se describe en Métodos S1)). Sin embargo, se encontró que FAK no interaccionan con p53 (Fig. S2A). Los lisados se probaron para la FAK, Src y p53 para garantizar la igualdad de carga (Fig. S2 B). También se encontró que p53 se transloca eficientemente al núcleo en ambos FAK - /-. células y FAK en peso después de la irradiación (no mostrado)
Desde p21 se ha asociado con la resistencia y la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN, incluyendo radiación ionizante, el próximo agotados p21 mediante siRNA. Hemos alcanzado alrededor del 90% de derribo de p21 en las células SCC (Fig. 6A y 6B). Clonogenicidad se evaluó a continuación, a los 0, 4, y 8 Gy y la comparación hecha entre las poblaciones de células transfectadas con siRNA p21, revueltos poblaciones siRNA o de células de control que habían sido transfectadas falsamente. Se encontró una diferencia significativa en la fracción de supervivencia a 8 Gy (p = 0,0129) entre la siRNA- revueltos y células siRNA tratados con p21, de modo que p21 promovido de radio-resistencia en las células SCC (Fig. 5C). Por tanto, existe una fuerte relación entre p21 inducida por la radiación en las células FAK-deficiente (pero no en sus homólogos FAK-expresión) y el hallazgo de que la pérdida de FAK induce la radio-resistencia en el que p21 tiene un papel causal en las células SCC.
(a) FAK - /- células SCC se transfectaron con 100 nM siRNA (ya sea una piscina revueltos o siRNA p21) a 50% de confluencia. Después de la incubación durante 24 horas, los extractos de proteínas se inmunotransfirieron y se sondaron con anti-p21 (panel superior) y anti-β-actina (panel inferior). (B) Densitometría comparación de los niveles de p21 en FAK - /- se llevó a cabo extractos de proteínas tratados con una piscina revueltos de siRNA o siRNA p21. Los niveles de proteína p21 se normalizaron a nivel de ß-actina y los resultados mostrados son representativos de uno de tres experimentos separados. (C) FAK - /- células fueron transfectadas de forma simulada o transfectadas con 100 nM de cualquiera de una piscina siRNA revueltos o siRNA p21 en 50% de confluencia. Después de 24 horas las poblaciones de células se tripsinizaron y se diluyeron en medio de cultivo a una concentración final que permita el crecimiento de colonias individuales. 100 l de esta suspensión a continuación, se añadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de la incubación durante 6 horas para permitir la fijación de las células, las placas se irradian con 0, 4, 8 o Gy. Las placas se establecieron por triplicado para cada dosis de radiación. Después de 7 días se contó el número de colonias por placa y la fracción superviviente calcula. El gráfico muestra la media ± SEM de tres experimentos independientes. fracciones supervivientes de células tratadas p21 siRNA se compararon con las células tratadas ARNsi revueltos en cada dosis de radiación y la significación estadística evaluada por la prueba t de Student para datos independientes, * indica p & lt; 0,05, n = 9.
Por último , se evaluó si la deficiencia de FAK afectada características más generales asociados con el daño del ADN. Se encontró que los niveles de mRNA de varios genes diana de p53, que están implicados en la reparación después de la radiación ionizante, es decir,
GADD45
,
p53R2
y
DDB2
, y son conocidos que las reguladas por c-Myc [47], fueron estimulados en FAK - /- células SCC, pero consistentemente menos en sus homólogos FAK-expresión (Fig. 7). Esto fue particularmente cierto para los
DDB2
en el punto de tiempo de 2 horas, para
GADD45
en puntos de tiempo posteriores, y por
p53R2
lo largo de las 0-24 horas después de la irradiación ( la Fig. 7A, B y C). Puesto que hemos demostrado que FAK es necesario para c-Myc regulación aguas abajo de
Apc
deleción en intestino de ratón [22], puede ser que perjudica FAK expresión inducida por la radiación de los genes de mantenimiento de la integridad del genoma en las células SCC
a través de
la represión mediada por c-Myc. Sin embargo, hemos observado que BRCA1 proporciona un ejemplo de un gen sensible daño de ADN que sólo se ve afectado mínimamente por la pérdida de FAK; de hecho, la expresión de BRCA1 se suprime por la deficiencia de FAK en momentos posteriores después de la irradiación (Fig. 7D). Por lo tanto, concluimos que la transcripción inducida por la radiación de un sub-conjunto de genes sensible a p53 está modulada por la presencia o ausencia de FAK, y así no se debe simplemente a la disfunción p53 general.
ARN fue extraído de subconfluent FAK - poblaciones celulares y FAK en peso en varios puntos de tiempo después de 5 Gy de irradiación - /. QRT-PCR análisis se realizó utilizando cebadores dirigidos contra DDB2 (A), GADD45 (B), p53R2 (C) y BRCA1 (D), y estos eran todos normalizado a ß-actina.
mencionado, no hubo la detención del ciclo celular apoptosis o diferencial fácilmente detectable que se puede atribuir a la condición de FAK. Por lo tanto, el próximo examinado la fosforilación de la serina 139 de la histona γH2AX que se produce en respuesta a la radiación [48] ionizante y se considera que es un sustituto fiable de doble capítulo romper la reparación. Cuantificación del porcentaje de núcleos que contienen y lt; 5 o ≥5 focos γH2AX mostró que ambos FAK - /- poblaciones y FAK wt tenían ≥5 γH2AX focos en prácticamente todas las células 1 hora después de la irradiación con 5 Gy (Fig 8A.). Sin embargo, los FAK - /- las células comenzaron a despejar estos focos dentro de las 6 horas y éstas volvieron a nivel basal a las 24 horas; en contraste FAK re-expresión en las células FAK wt causado una focos tasa de aclaramiento más lento (comparar 6 y 24 puntos de tiempo por hora, (Fig 8A) Esto es consistente con la actividad de reparación de ADN más eficiente en los FAK -.. /- las células, y una menor tasa de reparación cuando FAK está presente imágenes representativas de γH2AX inmunofluorescencia en FAK -. /- células (antes y 1 hora después de 5 Gy de irradiación) se muestran (figura 8B.) también se encontró que FAK -. /- células SCC apareció a tener niveles generalmente superiores de focos γH2AX en condiciones de control (0 horas) que sus contrapartes FAK-expresión de (imágenes no se muestra), con la mayoría de FAK - /- células que muestran varios focos y alrededor de 10-15% se presentan ≥5 focos (Fig. . 8A, 0 horas) esto sugiere que las células SCC FAK deficientes pueden tener una mayor inestabilidad genética que sus contrapartes en peso de FAK, por lo menos, parece que la FAK - /- células SCC generalmente han mejorado las funciones de reparación del ADN y esto se correlaciona con radio-resistencia . Curiosamente, no se encontró ninguna diferencia en la regulación de FAK dependiente de la fosforilación inducida por la radiación de cualquiera de p53 o Chk2 (fig. S5)
() FAK A -. /- Células y FAK en peso se colocaron en placas a baja densidad en cubreobjetos de vidrio, se incubaron durante 24 horas y se irradiaron con 5 Gy. En varios puntos de tiempo, las células se fijaron, permeabilizaron, se tiñeron con anti-fosfo-γH2AX (serina 139) y se visualizaron mediante microscopía confocal. El número de focos por núcleo (& lt; 5 focos o ≥5 focos) fue documentada en al menos 100 células. Los resultados mostrados son representativos de uno de los dos experimentos separados. (B) Imágenes representativas demuestran des-irradiado y se irradiaron FAK - /- se muestran las células en 1 hora después de 5 Gy, verde - fosfo-γH2AX y azul - DAPI (barra de escala, 20 micras), la flecha en la caja superior derecha muestra a un núcleo con. & lt; 5 focos y la flecha rota en el cuadro de la derecha inferior apuntando a un núcleo con ≥ 5 focos
Discusión
aquí mostramos que, en marcado contraste con una informe previo en el que FAK knock-down sensibiliza las células de cáncer de páncreas a la radiación [43], la supresión de FAK (y un inhibidor de quinasa FAK) ionizante puede suprimir la señal de, la inducción mediada por p53 inducida por la radiación de p21, y esto está relacionado con radio- resistencia en las células SCC avanzados. Creemos que es importante registrar que el papel de la FAK en las respuestas celulares a la radiación, y tal vez la señalización en general a favor de la supervivencia ionizante, puede depender del contexto, y que es necesario que haya precaución al considerar combinaciones terapéuticas de los inhibidores de la FAK y la radioterapia, ya que esto no siempre puede ser clínicamente beneficiosa
.
en el trabajo que se describe aquí, nos muestran que la supresión de la FAK (o la inhibición de su actividad quinasa) puede liberar limitaciones lugares FAK en la señalización de p53 para la inducción de varios genes diana, es decir, p21 y al menos un sub-conjunto de genes regulados por p53 que participan en la reparación del ADN en las células SCC. Por otra parte, FAK - /- células SCC parece ser más eficiente en la reparación después de daño en el ADN inducido por radiación. Sin embargo, en estas células no encontramos ningún efecto significativo de la FAK supresión de estabilidad de la proteína p53 (ya sea en respuesta a la irradiación o ADN dañando las drogas), la fosforilación de p53 o la capacidad de p53 para trasladar al núcleo, y no pudimos encontrar evidencia de un complejo FAK /p53 que se ha informado para operar en otros contextos. Por lo tanto, nuestro trabajo se suma a un creciente cuerpo de evidencia de que no es funcional cruzada entre las vías de señalización FAK y p53, pero demuestra que hay otras formas en que esto puede ocurrir. A pesar de que no entendemos completamente el mecanismo, se encontró que en las células SCC desde el que podíamos eliminar FAK por recombinación genética, funciones FAK para suprimir las funciones de reparación del ADN inducidas por la radiación de p53 mediante el bloqueo de la inducción de p21, y que esto está vinculado