Extracto
Antecedentes
El cincuenta por ciento de los pacientes con cáncer vesical infiltrante (MI-BC) mueren a causa de su enfermedad y el tratamiento de quimioterapia actual sólo marginalmente aumenta la supervivencia. Las terapias innovadoras dirigidas a los receptores tirosina quinasas o oncogenes activados pueden mejorar el resultado. Por lo tanto, es necesario estratificar a los pacientes sobre la base de las mutaciones en oncogenes relevantes. Los pacientes con cáncer de vejiga no músculo-invasivo (NMI-BC) tienen una supervivencia excelente, sin embargo, dos tercios de desarrollar recurrencias. mutaciones específicas del tumor se pueden utilizar para detectar recidivas en los análisis de orina, que presenta un procedimiento de diagnóstico más paciente que la cistoscopia.
Metodología /Principales conclusiones
Para hacer frente a estos problemas, se desarrolló un ensayo de mutación para la detección simultánea de 19 mutaciones posibles en los
HRAS
,
KRAS
, y
ANR
genes. Con este ensayo y ensayos de mutación para la
FGFR3
y
PIK3CA
oncogenes, que exhibió tumores vesicales primarios de 257 pacientes y 184 recidivas de 54 pacientes. Además, en los tumores primarios se obtuvo la expresión de p53 por inmunohistoquímica. De los tumores primarios 64% eran mutantes para
FGFR3
, el 11% de
RAS
, el 24% de
PIK3CA
, y el 26% para p53.
FGFR3
mutaciones eran mutuamente excluyentes con
RAS
mutaciones (p = 0,001) y co-produjo con
PIK3CA
mutaciones (p
=
0,016). la sobreexpresión de p53 se excluyen mutuamente con
PIK3CA
y
FGFR3 mutaciones
(p≤0.029). Las mutaciones en el
RAS
y
PIK3CA
genes no eran predictores de la supervivencia libre de progresión y específica de la enfermedad sin recurrencia. En pacientes que se presentan con el grado de MNI-BC 3 y MI-BC, el 33 y el 36% de los tumores primarios eran mutante. En los pacientes con bajo grado de MNI-BC, el 88% de los tumores primarios lleva a una mutación y el 88% de las recurrencias fueron mutante.
Conclusiones /Importancia
Los ensayos de mutación presentan un diagnóstico de acompañamiento para definir pacientes para terapias dirigidas. Además, los ensayos son un biomarcador potencial para detectar recurrencias durante la vigilancia. Hemos demostrado que el 88% de los pacientes con bajo grado de MNI-BC son elegibles para un seguimiento de este tipo. Esto puede contribuir a una reducción en el número de exámenes cistoscópica
Visto:. Kompier LC, Lurkin I, van der Aa MNM, van Rhijn BWG, van der Kwast TH, Zwarthoff CE (2010)
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
ANR
y
PIK3CA
Las mutaciones en el cáncer de vejiga y su potencial como biomarcadores para la vigilancia y la terapia. PLoS ONE 5 (11): e13821. doi: 10.1371 /journal.pone.0013821
Editor: Venugopalan Cheriyath, Clínica de Cleveland, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Julio, 2010; Aceptado: October 13, 2010; Publicado: 3 Noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Kompier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca Erasmus MC Breedtestrategie de Grant (2002-2006) y la Organización Holandesa para la Investigación y Desarrollo (ZON-MW, 945-02-046) Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el quinto cáncer más común en el mundo occidental [1]. De los tumores de vejiga 15-20% se presenta como enfermedad músculo-invasiva (MI-BC), el grupo restante como tumores no músculo-invasivo (NMI-BC). MI-BC es una enfermedad devastadora ya que más del 50% de los pacientes morirán de la enfermedad metastásica. Recientemente, los nuevos avances en las terapias dirigidas que utilizan inhibidores de la tirosina quinasa del receptor en otros tipos de cáncer han inspirado el posible tratamiento de los pacientes con IM-BC con agentes adyuvantes similares [2]. Para los tumores de vejiga músculo invasivo se está considerando la terapia dirigida FGFR3 [3], [4], [5], [6] y, recientemente, un estudio de fase II ha empezado a investigar la eficacia de TKI258, un inhibidor de FGFR3, en pacientes con avanzado cáncer urotelial (www.ClinicalTrials.gov NCT00790426). Del mismo modo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es frecuentemente sobreexpresado en cáncer de vejiga y por lo tanto podría ser una importante diana terapéutica para MI-BC [7], [8], [9]. Actualmente, se está investigando EGFR tratamiento específico para el cáncer de vejiga en varios ensayos clínicos (CALBG-90102, NCT00088946, NCT00380029). Sin embargo, recientemente se ha puesto en claro que las terapias dirigidas a los receptores tirosina quinasas podrían no ser eficaz cuando los tumores albergan mutaciones en el RAS-MAPK o vías PIK3CA-AKT aguas abajo de los receptores [10], [11], [12], [13] , [14]. Sin embargo, agentes inhibidores de objetivos de abajo en estas vías están en ensayos clínicos. Esto sugiere que la detección de tumores de vejiga mutaciones en genes como
FGFR3
,
RAS
y
PIK3CA
puede ser de importancia para las futuras decisiones terapéuticas. Una prueba sencilla que puede ser implementado en la clínica será, pues, deseable
.
Para no músculo invasivo cáncer de vejiga (NMI-BC), el principal problema es que después de la resección transuretral de la vejiga inicial (RTU) , 50-70% de los pacientes desarrollan múltiples recurrencias, con una probabilidad de 10-20% que éstas pasarán a MI-BC [15], [16], [17]. El riesgo de recurrencia y el riesgo de progresión requieren una vida de duración de seguimiento por cistoscopia. El estándar actual es realizar una cistoscopia, junto con la citología de orina cada 3-4 meses durante los primeros 2 años y dos veces al año a partir de entonces [18]. Recientemente hemos demostrado que en los pacientes con NMI Holanda-BC se someten a una media de 20 cistoscopías durante los primeros 9 años de seguimiento [17], con una recurrencia detectada en sólo uno de siete de estos momentos de seguimiento. Para los EE.UU. y Europa con una población de 300 y 450 millones de dólares, esto equivaldría a 1 y 1,5 millones de cistoscopías anuales. La reducción del número de cistoscopias por, por ejemplo, una prueba basada en la orina es un objetivo importante con el fin de mejorar la calidad de vida [19], [20], [21]. Además, podría conducir a la reducción de costos. En la actualidad, el cáncer de vejiga es el tipo de cáncer más caro para el tratamiento por paciente [22], [23]. Sin embargo, la citología y muchos de los biomarcadores en orina actualmente desarrollados tienen una sensibilidad limitada para la detección de tumores de bajo grado y estadio que forman el grupo principal que se repiten (revisado en [24] [25], [26], [27], [28, ]). por lo tanto, hay una necesidad de biomarcadores urinarios más sensibles que se pueden implementar en los laboratorios de diagnóstico molecular.
NMI-aC y BC-MI son genéticamente diferentes [29], [30]. tumores NMI-BC se caracterizan por una alta frecuencia de mutaciones en el
FGFR3
oncogén [31], [32] conduce a la activación constitutiva de la vía RAS-MAPK [33], [34], [35] , [36], [37]. En MI-BC, las mutaciones en el
prevalecen TP53
gen. Las mutaciones en
FGFR3
y
TP53 ¿Cuáles son excluyentes entre sí en gran medida lo que sugiere que NMI-BC y el MI-BC se desarrollan a lo largo de las diferentes vías de oncogénesis [38], [39]. Sin embargo, en la etapa de los tumores pT1 que invaden la capa de tejido conjuntivo subyacente al epitelio urinario, que a menudo se presentan juntas [32], [38], [39]. Recientemente, las mutaciones somáticas en el
PIK3CA
oncogén, que codifica la subunidad catalítica de p110α clase IA-PI3-quinasa, se describen en el 13-27% de los tumores de vejiga [40], [41]. Estas mutaciones a menudo coincidieron con
FGFR3
mutaciones. Las mutaciones en los
RAS
oncogenes (
HRAS
,
KRAS
,
ANR
) también se han encontrado en el 13% de los tumores de vejiga y se produjo en todos etapas y grados [41], [42]. Ellos eran mutuamente excluyentes con
FGFR3
mutaciones. Sin embargo, no existen datos en relación con el valor pronóstico, en términos de supervivencia libre de recidiva, libre de progresión y específica de la enfermedad, de los
RAS
y
PIK3CA
mutaciones en el cáncer de vejiga, ya sea solo o en combinación con otras alteraciones. En algunos casos el cáncer tipos
PIK3CA
mutaciones se han asociado con la capacidad de invasión y un peor pronóstico [11], [43], [44], [45], [46]. Por otra parte, existen ejemplos de mutaciones somáticas en lesiones benignas de la piel que no progresan [47], [48]. En cuanto a las alteraciones en la RAS y el pronóstico, en los últimos estudios se han realizado sobre el valor pronóstico de la expresión de la proteína p21 RAS, sin embargo los resultados no fueron concordantes [49], [50], [51]. Un estudio reciente sobre la expresión de
HRAS Hoteles en 48 tumores de vejiga pTa mostró una correlación inversa del valor de expresión con la recurrencia y progresión [52]. Sin embargo, no existe información sobre el valor pronóstico de las mutaciones en los tres
RAS
genes en el cáncer de vejiga.
Recientemente hemos demostrado que con
FGFR3
análisis de la mutación en la orina muestras de pacientes con cáncer de vejiga que fue posible detectar tumores recurrentes [53], [54]. El rendimiento técnico de la
FGFR3
ensayo de mutación en estos estudios fue excelente. Sesenta y tres por ciento de los pacientes con NMI-BC son mutantes para
FGFR3
. Un objetivo adicional del presente estudio fue investigar si la adición de
RAS
y
PIK3CA
análisis de la mutación a la
FGFR3
detección de mutaciones podrían contribuir a aumentar el porcentaje de pacientes que puede ser monitorizado utilizando ensayos basados en orina para estas mutaciones. Además, estos ensayos podrían ser de utilidad en la clínica para definir los pacientes que podrían beneficiarse de terapias dirigidas. Por ello, hemos desarrollado un ensayo de mutación múltiplex para la detección de las más frecuentes
HRAS
,
KRAS
, y
ANR
mutaciones en el cáncer de vejiga. Este ensayo se basa en ensayos que hemos desarrollado previamente [53], [55], [56]. En nuestra experiencia, estos ensayos son sensibles, fácil de realizar y de interpretar, y requieren sólo unos pocos nanogramos de ADN. Los ensayos también tienen éxito en el ADN de parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) los tejidos o en la orina [53], [54], [56].
posteriormente investigó el espectro de mutaciones de
FGFR3
,
HRAS
,
KRAS
,
ANR
y
PIK3CA
en una gran serie de tumores primarios de 257 pacientes con NMI-BC y MI- ANTES DE CRISTO. estado de mutación también se comparó con la expresión de p53. La distribución de las alteraciones en estos seis genes juntos no se ha investigado en los tumores de vejiga antes. Hemos examinado más de 184 repeticiones de 54 pacientes para determinar si el estado de mutación es consistente en las recurrencias con el fin de examinar si es útil para iniciar un estudio longitudinal sobre la vigilancia de estos ensayos de mutación para la detección de cáncer de vejiga recurrente en las muestras de orina espontánea de los pacientes . La frecuencia de mutaciones en
RAS
y
PIK3CA
en un entorno longitudinal que contiene múltiples repeticiones de un mismo paciente tampoco ha sido aún investigado antes.
Llegamos a la conclusión de que la mutación Los ensayos presentan un diagnóstico de acompañamiento para estratificar a los pacientes con IM-BC para terapias dirigidas. Además, dado que el 88% de los tumores primarios de pacientes con bajo grado de MNI-BC llevado a una mutación en el
FGFR3
,
RAS
, y /o
PIK3CA
genes y 88% de las recurrencias fueron mutante, los ensayos son una herramienta potencial para detectar recurrencias en el ADN obtenidos a partir de muestras de orina durante la vigilancia, que pueden contribuir a una reducción en el número de exámenes cistoscópica y vale la pena investigar.
Métodos
características de los pacientes y la ética de los estados
parafina fijado con formalina incorporado (FFPE) muestras de tumores primarios de un grupo no seleccionado de 257 pacientes se obtuvieron del Centro Médico Erasmus y San Franciscus Gasthuis, Rotterdam, Holanda. Las muestras de tumores representan un subgrupo de 286 muestras que hemos descrito anteriormente [32]. No tejido estaba disponible más para las 29 muestras que faltan. La edad media de este grupo de pacientes al momento del diagnóstico fue de 65,7 años y la razón hombre /mujer fue de 3/1. Los tumores se clasifican de acuerdo a la clasificación del tumor de metástasis en los ganglios de 1997 [57] y las calificaciones fueron clasificados de acuerdo a los criterios de la Organización Mundial de la Salud de 1973 [58]. Entre los tumores primarios, había 166 PTA, 57 pT1, y 34 tumores pT2-4. La distribución de grado fue del 84 grado 1, grado 2 117 y 56 tumores de grado 3. De los 54 pacientes que fueron tratados en el Erasmus MC y habían desarrollado una o más recurrencias, se recogió tejido incluido en parafina y fijado en formalina de 184 repeticiones consecutivas. Los datos clínicos de los tumores se obtuvieron de historia clínica del paciente. Los datos fueron analizados de forma anónima. FFPE muestras se utilizaron de acuerdo con las normas presentadas en "El Código de Uso secundario apropiado de los tejidos humanos en los Países Bajos" (http://www.federa.org/). por lo tanto, no era necesario el consentimiento informado a obtener. Esto fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional. Una recidiva se define como un tumor eliminado en la resección transuretral que posteriormente se confirmó que el tejido tumoral por un patólogo. Los tumores retirados dentro de los tres meses después de la resección transuretral no se considera una recurrencia. La progresión se define como la progresión en la fase y /o al grado 3. supervivencia específica de la enfermedad se definió como el tiempo desde el diagnóstico de muerte de cáncer de vejiga. Periodo de seguimiento se contará a partir de la fecha de diagnóstico. Censura de los pacientes se produjo en su última visita clínica o cuando un paciente falleció. En general, los pacientes fueron seguidos y tratados de acuerdo con las directrices de la Asociación Europea de Urología [18]. El comité de ética médica de la Universidad Erasmus y el Hospital Universitario de Rotterdam aprobó el estudio (METC 168.922 /1998/55).
aislamiento del ADN y análisis de la mutación
Se utilizaron hematoxilina-eosina manchadas diapositivas para el diagnóstico histológico y sirvió como plantillas para la disección micro manual desde los respectivos bloques de tejido. Las muestras de tumores disecados contenían un mínimo de células tumorales 70%. Las muestras tumorales fueron extraídos de parafina tejido tumoral fijado en formalina por de-la depilación con cera con xileno y etanol. Se aisló el ADN utilizando el kit DNeasy Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con el protocolo. P53, MIB-1 y p27
Kip1 inmunotinción se obtuvo a partir van Rhijn
et al.
[32].
Los cebadores para el ensayo multiplex RAS-BC fueron diseñados de tal manera que las hebras individuales de los productos de PCR contenía tan poco estructura secundaria potencial como sea posible con el fin de facilitar el recocido eficaz de las sondas de detección de mutación. Diseño de cebadores se propone, asimismo, lograr temperaturas de hibridación idénticos para permitir la amplificación simultánea de los exones correspondientes de los tres
RAS
genes en una reacción de PCR. Además, las regiones a amplificar se inspeccionaron en busca de la presencia de polimorfismos en la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. No se observaron polimorfismos en estas regiones. sondas de detección de la mutación para la detección múltiplex de
HRAS
,
KRAS
y
NRAS
mutaciones fueron diseñados para hibridar con cualquiera de los dos el avance o la hebra inversa directamente adyacente al sitio potencial de mutación . Con el ensayo, 19 posibles mutaciones en 10 codones en los 3
RAS
genes pueden ser detectados. Juntos representan el 96% de todo el somática
HRAS
,
KRAS
y
ANR
mutaciones encontradas en los carcinomas uroteliales por el Instituto Sanger (www.sanger.ac.uk /genética /CGP /cósmica). Para permitir distinguir las sondas por tamaño, se añadieron poli (dT) las colas de diferentes longitudes. Todas las sondas se diseñaron para tener temperaturas de recocido similares y fueron seleccionadas por la ausencia de estructuras secundarias y el apareamiento de bases con otras sondas. secuencias de cebadores y sondas y las concentraciones de los tres ensayos de mutación múltiplex para
FGFR3, las ANR, HRAS, KRAS
y
¿Cuáles son PIK3CA se representa en la figura 1 y 2.
Cada reacción de PCR multiplex se realizó en un volumen total de 15 l que contenía dNTPs 0,17 mM (Roche, Basilea, Suiza), MgCl2 1,5 mM, glicerol al 5% (Fluka, Buchs SG, Suiza), 0,3 a 1,2 M de la combinación apropiada del cebador (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 x tampón de PCR, y 0,5 unidades de ADN polimerasa Taq Go (Promega, Madison, WI), utilizando 5 ng de ADN genómico como plantilla. El ciclo térmico consistió en una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de cada uno de 95 ° C durante 45 s, 55 ° C durante 45 seg, y 72 ° C durante 45 seg. La etapa de elongación final fue de 72 ° C durante 10 min. cebadores y desoxinucleótidos trifosfato no incorporada fueron retirados de los productos de PCR mediante la adición de 2 unidades de exonucleasa I (Exoi) y 3 unidades de fosfatasa alcalina de gamba (SAP, USB, Cleveland, Ohio, EE.UU.).
Los productos de PCR fueron analizados posteriormente por mutaciones usando sondas para cada uno de los posibles sitios de mutación y el Kit de Snapshot® Multiplex (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de detección de mutación se realizaron en un volumen total de 10 l que contiene 2,5 l de instantánea Multiplex Reaction Mix Ready, 2 l BigDye tampón de secuenciación, 1 l de mezcla de sonda y 1 l de SAP /ExoI tratada producto de PCR. reacciones de extensión que constan de 25 ciclos de desnaturalización a 96 ° C durante 10 seg y recocido /extensión a 58,5 ° C durante 40 seg, se realizaron en un termociclador. Después de la extensión, el exceso de trifosfatos de didesoxinucleótidos marcados se eliminó por tratamiento con 1 unidad de fosfatasa alcalina de camarón a 37 ° C durante 60 min y 72 ° C durante 15 min. cebadores extendidos fueron desnaturalizados a 95 ° C durante 5 minutos y se separaron por electroforesis capilar en un secuenciador automático (ABI PRISM analizador 3130 XL genética, Applied Biosystems, Foster City, CA), y la presencia o ausencia de una mutación se indican con el fluorescente etiqueta en el nucleótido incorporado. Los detalles de colores de los mutantes y de tipo salvaje picos se dan en la Figura 2. Los datos se analizaron mediante análisis GeneScan Software versión 3.7 (Applied Biosystems) y la versión de software 1.7 GeneMarker (SoftGenetics LLC, State College, EE.UU.).
análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS (versión 15.0, SPSS, Inc., Chicago, IL, 2003). Las diferencias se consideraron significativas si p
& lt; 0,05
. Las relaciones entre el estado de mutación y las variables clínicas y patológicas se analizaron mediante la prueba t de Student, test de Chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher de dos caras. Se analizó libre de recidiva, libre de progresión y la supervivencia específica de la enfermedad por el estado mutacional mediante curvas de Kaplan-Meier. Se realizó la prueba de log-rank de dos caras para comparar las curvas.
Resultados
El cáncer de vejiga específicas RAS-BC ensayo de mutación
Las mutaciones somáticas en el
HRAS
,
KRAS
y
ANR
genes en el cáncer de vejiga afectan a los codones 12, 13 y 61. con el fin de facilitar la detección de
RAS
mutaciones que han desarrollado un multiplex RAS-BC ensayo de mutación que las pantallas de 19 mutaciones de forma simultánea, lo que representa el 96% de todas las posibles mutaciones conocidas en los 3
RAS
genes en el cáncer de vejiga (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). El ensayo requiere sólo unos pocos nanogramos de ADN y funciona bien en el ADN de tejido fijado con formalina. La Figura 3 muestra ejemplos de ensayo de la RAS-BC con el panel A representa la situación de tipo salvaje y con mutaciones específicas representadas en los paneles B-D
Panel A:. De tipo salvaje de la muestra, paneles B-D: muestras con mutaciones. Posición de los codones interrogados, nucleótidos y genes se representa en la parte inferior.
Las mutaciones en los tumores primarios
Con la RAS-BC ensayo de mutación y ensayos para
y
PIK3CA
, hemos examinado los tumores de vejiga primarios de 257 pacientes en busca de mutaciones (Figura 4A). En general, el 64% (164/257) de los tumores contenía un
FGFR3
mutación, un total de 28 muestras (11%) eran mutantes para uno de los
RAS
genes y 61 (24 %) albergaba un
PIK3CA
mutación. Tabla 1 muestra el tipo de las mutaciones identificadas. Las más frecuentes
RAS
mutaciones fueron
KRAS
G12D y
HRAS
Q61R.
KRAS Opiniones y mutaciones
HRAS
ocurrieron con la misma frecuencia, mientras que
ANR
mutaciones no eran frecuentes en el cáncer de vejiga. En el
PIK3CA
gen, las mutaciones se concentraron en el dominio codones helicoidales E545K y E542K. En general, el 18% (11/62) de la
PIK3CA mutaciones
había ocurrido en los dominios quinasa y el 82% en los dominios helicoidales. No se detectó la E545A alteración indicativa de un polimorfismo en el
PIK3CA
pseudogen de los cuales la función es desconocida [59]. En tres tumores primarios, dos diferentes
FGFR3
mutaciones estaban presentes (S249C junto con A393E, G372C o R248C). Un tumor primario contenía dos
PIK3CA
diferentes mutaciones en los dominios helicoidales (E542K y E545K). No hubo obvia co-ocurrencia o la exclusión mutua entre los diferentes tipos de
RAS
y
PIK3CA mutaciones
.
Las frecuencias de todos los tumores de vejiga primario (A) (n = 257), y en etapas específicas de tumores:. PTA /T1-G1 /G2 (B) (n = 194), PTA /T1G3 (C) (n = 29) y los tumores del músculo invasiva (D) (n = 34)
Los tumores primarios fueron estratificados posteriormente en tres subgrupos basados en la etapa y el grado; tumores de bajo grado (NMI-BC pTaG1-2 y pT1G2), de alto grado de MNI-BC (pTaG3 y pT1G3) y los tumores del músculo invasivo (≥pT2). En la Figura 4B-D, las distribuciones de
FGFR3
,
PIK3CA
y
RAS
mutaciones en estos subgrupos se ilustran. En el grupo de PTA T1G1-2 88% de los tumores primarios albergan una mutación en al menos uno de los cinco oncogenes investigados. La detección de
PIK3CA
y los tres
RAS
genes mutantes aumentaron los tumores de porcentaje con 10% en comparación con
FGFR3
solo. En los grupos de tumores de grado 3 y músculo-invasivo, el porcentaje total de mutaciones en los oncogenes es mucho menor con 33% y 36%, respectivamente. En tumores de grado 3, la proporción de
RAS
mutaciones es relativamente grande, mientras que
PIK3CA
mutaciones son más prominentes en los tumores del músculo invasivo. La adición de
PIK3CA
y
RAS
ensayos de los resultados en la detección de 13% de los tumores primarios mutantes adicionales en el grupo de grado 3 y el 15% en el grupo de músculo invasivo.
Co-ocurrencia de mutaciones
de los 257 tumores primarios, el 26% tenía la sobreexpresión de p53, lo que es indicativo de mutaciones sin sentido. Cuando se combinan las mutaciones del oncogen con los del
TP53
gen supresor de tumores (Tabla 2), se observa que sólo 27 tumores (11%) eran de tipo salvaje para todos los genes examinados. Hubo 9 tumores primarios con un co-ocurrencia de 3 alteraciones. Se observó una asociación positiva del mutante
FGFR3
con
PIK3CA
mutaciones (p
=
0,016), con un 77% de la
PIK3CA mutaciones
centros mixtos que ocurre con
FGFR3 gratis (Figura 5).
FGFR3
mutaciones eran fuertemente mutuamente excluyente con
RAS
mutaciones (p
=
0,001). Sólo el 3,5% de los tumores primarios contenía una mutación en ambos genes. Curiosamente, la exclusividad mutua de los
FGFR3
y
RAS
mutaciones se mantuvo significativa en el subgrupo de PTA /T1 G1 /2 tumores primarios, mientras que
PIK3CA
y
FGFR3
mutaciones son significativamente co-ocurrente en tumores de grado 3. Tanto
FGFR3
y
PIK3CA
mutaciones eran mutuamente excluyentes con la sobreexpresión de p53 (p
& lt;
0,001 yp
=
0,029, respectivamente).
RAS
mutaciones no eran mutuamente excluyentes con
PIK3CA
y mutaciones de p53 en la cohorte total, ni en los diferentes subgrupos estadio y grado tumoral.
Las correlaciones de mutaciones con el estadio, grado
posteriormente investigó la relación entre el estadio y el grado y las diferentes mutaciones (Figura 6). En los tumores primarios hubo una correlación significativa de
FGFR3
con baja etapa y el grado y una correlación de la sobreexpresión de p53 con alta estadio y grado, como se indica anteriormente [39]. Sin embargo, no se observó una asociación significativa entre el
RAS
estado de la mutación y la etapa o grado. La distribución según la etapa fue del 10% (PTA 16 de 166), el 18% pT1 (10 de 57), y el 6% de los tumores músculo-invasivo (2 de 34). En cuanto a
PIK3CA
, la prevalencia de mutaciones fue mayor en los tumores de bajo grado: 30% de grado 1 (25 de 84), 23% de grado 2 (27 de 117), y 16% de grado 3 (9 de 56 ), sin embargo esta asociación no fue estadísticamente significativa (p = 0,061). No se observó correlación con el estadio.
La correlación de estas alteraciones en los tumores de vejiga primarios de 257 pacientes con estadio (A) o de grado (B) se indica mediante los valores de p (χ
2).
valor pronóstico
el cincuenta y nueve por ciento (154/257) de los pacientes de nuestro estudio desarrollado una o más recurrencias, 10% tuvieron progresión en el escenario y /o de grado 3, 19% murió de enfermedad. Ninguna de las alteraciones investigados en
FGFR3
,
RAS
,
PIK3CA
y p53 en el tumor primario fue un predictor para el desarrollo de una recurrencia (supervivencia libre de recidiva p & gt; 0,05). La frecuencia de mutación de
PIK3CA Hoteles en pacientes con recidivas fue similar en comparación con los pacientes sin recurrencias del 24% (37/154) en comparación con el 23% (24/103). Para
RAS
mutaciones, estas frecuencias fueron 12% y 10%. También hubo ninguna relación entre el estado de la mutación de
RAS
y
PIK3CA
y la tasa de recurrencia. Como hemos demostrado anteriormente, los pacientes con un
FGFR3
tumor primario mutante tener un menor riesgo de progresión y una mejor supervivencia específica de la enfermedad, mientras que los pacientes con sobreexpresión de p53 tienen alto riesgo de progresión y la supervivencia específica de la enfermedad baja [32 ], [39]. Sin embargo,
PIK3CA
o
RAS
mutaciones no se asociaron significativamente con la progresión (p
=
0,129, p
=
0,694) o la supervivencia específica de la enfermedad (p
=
0,205, p
=
0,447) en toda la cohorte, ni en los diferentes subgrupos estadio y grado tumoral. La combinación de
RAS
y
PIK3CA
estado de mutación proporcionan resultados similares. Por otra parte, la adición de
RAS
o
PIK3CA
estado de mutación de
FGFR3
o p53 no dio lugar a una mejor predicción de la supervivencia libre de progresión o específica de la enfermedad sin recurrencia en comparación con
FGFR3
o p53 solo. También hubo ninguna correlación significativa del individuo
RAS
isoformas y
PIK3CA
mutaciones en los dominios helicoidales o quinasa con el estadio, grado o de recidiva, progresión y la supervivencia específica de la enfermedad. Por otra parte, no se encontró correlación significativa entre la
RAS
o
PIK3CA
mutaciones y alterado Ki-67 (p = 0,413, p = 0,227) o p27
Kip1 (p = 0,126 yp = 0,580) expresión, marcadores indicativos de un peor pronóstico en el cáncer de vejiga [60], [61].
Las frecuencias de las mutaciones en las recurrencias
a partir de 54 pacientes que fueron tratados en el Erasmus MC y tenía desarrollado una o más recurrencias, el tejido se disponía de 184 recurrencias (incluyendo recurrencias multifocales). Aquí, hemos querido investigar si persiste el estado de mutación en múltiples recurrencias de los mismos pacientes con el fin de examinar si es valioso para iniciar un estudio longitudinal futuro de la vigilancia con los ensayos de mutación mediante el análisis de muestras de orina. Nosotros sólo examinamos el estado de mutación de los genes para los que hemos desarrollado el ensayo de mutación basada Snapshot (es decir,
FGFR3
,
PIK3CA
y
RAS
). la sobreexpresión de p53 no se determinó en las recurrencias. La frecuencia de la sobreexpresión de p53 también fue baja (6/54) en los tumores primarios de este grupo de pacientes que consisten principalmente en tumores NMI-BC. Una descripción detallada de estadio, grado y estado de la mutación de estos tumores se presenta en la Figura 7. En los pacientes con un tumor primario de tipo salvaje, las recurrencias fueron en su mayoría de tipo salvaje (49/54 recurrencias), mientras que el 5 albergaba un
FGFR3
mutación. Un tumor recurrente contenía dos diferentes
PIK3CA mutaciones
(E542K y E545K). Curiosamente, en las recurrencias
PIK3CA mutaciones
además de un
FGFR3
mutación se asocia a un mayor grado en comparación con las recurrencias que alberga un
FGFR3
mutación por sí sola (p = 0,012). Si nos estratificar a los pacientes con un tumor primario mutante, el 81% de las recurrencias fueron también mutante y las frecuencias individuales fueron el 75% (98/130) de
FGFR3
, el 23% (30/130) para
PIK3CA
, y el 10% (13/130) de
RAS
. Curiosamente, no había una consistencia 100% en el tipo de mutación para
RAS
y
PIK3CA
entre diferentes tumores del mismo paciente. Nos anterior observamos que algunas recurrencias fueron de tipo salvaje cuando el tumor primario fue mutante para
FGFR3
[17]. En el presente estudio, había 20 de 130 recurrencias (15%) en el subgrupo de pacientes con un tumor primario mutante que había progresado a cáncer de vejiga con invasión muscular (Figura 7) grado 3, o CIS. De estos, 90% (18/20) fueron mutante y por lo tanto se pudo detectar con el ensayo de mutación. Las recurrencias de tipo salvaje en este grupo de pacientes no progresan con mayor frecuencia que las recurrencias mutantes; 8% (2/25) de las recurrencias de tipo salvaje había progresado hasta la CEI y de grado 3 (Figura 7), en comparación con el 17% de recidivas mutantes. Una de estas recurrencias de tipo salvaje co-produjo junto con dos tumores mutantes. Se determinó además el punto de tiempo en que se produjeron las recurrencias de tipo salvaje durante el seguimiento. La mayoría de las recurrencias de tipo salvaje (18 de 25) co-produjo junto con una recurrencia mutante o más tarde fueron seguidos por una recurrencia mutante, mientras que el 7 se produjeron como de tipo salvaje por sí solo al final del período de seguimiento cuando no hay más datos estaba disponible
A:. mutante tumores primarios y sus recurrencias; B: Los tumores primarios de tipo salvaje y sus recurrencias. La primera columna indica el tumor primario. Las cajas indican sucesivas recurrencias temporalmente secuenciales retirados en diferentes de resección transuretral (indicados por un número de secuencia en la parte superior). tumores multifocales retirados al mismo resección transuretral se colocan debajo de la otra. Etapa y el grado de los tumores, el estado de mutación (indicado por un color) y la identificación del paciente de los 54 pacientes se indica.
Uno de los propósitos de este estudio fue investigar si los ensayos de mutación son una herramienta potencial para la detección de recurrencias con el fin de reducir el número de exámenes cistoscópica y si es útil para iniciar un estudio longitudinal grande con estos ensayos de mutación para la detección de los tumores recurrentes de la vejiga usando ADN extraído de células urinario. Los pacientes que son elegibles para un seguimiento de este tipo son las que presentan con un mutante o pTaG1-2 pT1G2 tumor primario. Para este subgrupo de pacientes la frecuencia de mutaciones en el
FGFR3
,
PIK3CA
y
RAS
genes cuando contado por evento recurrencia (es decir, en caso de múltiples tumores retirados en transuretral resección, los datos de mutación se combinaron) se ilustran en la figura 8. La figura muestra que en este grupo de pacientes una mutación está presente en 88% de los eventos de recurrencia.