Extracto
El cáncer es un problema importante de salud pública en todo el mundo. Sólo en los Estados Unidos, 1 de cada 4 muertes se debe al cáncer y para el 2013 se proyecta un total de 1,660,290 nuevos casos de cáncer y 580,350 muertes relacionadas con el cáncer. perfilado integral de varios genomas del cáncer ha revelado un paisaje genético muy complejo en el que un gran número de genes alterados, que varía de un tumor a otro, afecta las vías y los procesos biológicos básicos. Esto tiene implicaciones para el enfoque terapéutico de las redes de señalización en el desarrollo de tratamientos para cánceres específicos. El factor de transcripción NFkB es constitutivamente activa en una serie de tumores sólidos y hematológicos, y muchas vías de señalización implicadas en el cáncer es probable conectado a la activación de NFkB. Un mediador crítico de la actividad NFkB es quinasa activada por TGF-1 (TAK1). Aquí, identificamos TAK1 como una novela que interactúan las proteínas y el destino de FGFR3 (FGFR3) la actividad tirosina quinasa. Además, demuestran que la activación de mutaciones en FGFR3 asociados tanto con el mieloma múltiple y el cáncer de vejiga pueden modular la expresión de genes que regulan la señalización de NFkB, y promover tanto la actividad transcripcional NFkB y la adhesión celular de una manera dependiente de la expresión de TAK1 en ambos tipos de células de cáncer. Nuestros hallazgos sugieren TAK1 como un objetivo potencial terapéutico para el cáncer de FGFR3-asociado, y otros tumores malignos en el que TAK1 contribuye a la activación de NFkB constitutiva
Visto:. Salazar L, Kashiwada T, P Krejci, Meyer AN, Casale M, Hallowell M, et al. (2014) de crecimiento de fibroblastos receptor del factor de 3 interactúa con y activa TGF-tirosina kinasa activada por fosforilación 1 y NFkB señalización en el mieloma múltiple y cáncer de vejiga. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10.1371 /journal.pone.0086470
Editor: Hari K. Koul, centro de Louisiana State University Health Sciences, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Agosto, 2013; Aceptado: 9 de diciembre de 2013; Publicado: 23 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Salazar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el múltiple Myeloma Research Foundation, el Centro de cáncer Chao Integral de la Familia en la UCI, Fundación Elsa U. Pardee, Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa (KONTAKT LH12004), Fundación Científica Checa (P305 /11/0752). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una enfermedad compleja derivada de la adquisición de mutaciones somáticas que dysregulate vías centrales de la proliferación celular y la supervivencia, la angiogénesis y la metástasis de señalización. La desregulación de la señalización de FGFR3 se ha implicado en varios tipos de cáncer, carcinoma urotelial de células más notablemente (UC) y el mieloma múltiple (MM). Los carcinomas de células uroteliales representan más del 90% de los cánceres de vejiga, que tienen una incidencia mundial de más de 350.000 nuevos diagnósticos anuales y el rango como el tercer cáncer más común en los hombres y el décimo más común en las mujeres en los Estados Unidos [1]. La sobreexpresión o activación de la mutación de FGFR3 es la alteración genética más frecuente en la Universidad de California (revisado en [2]). Mieloma múltiple, un cáncer de las células B diferenciadas terminalmente, es el segundo cáncer hematológico más común con una estimación Sociedad Americana del Cáncer de 22.350 nuevos casos para el año 2013. Entre los casos de MM con el peor pronóstico son los 15% con el t (4; 14) translocación, que se dirige tanto FGFR3 y MMSET (revisado en [3] - [5]). Estudios recientes indican que esta translocación puede ser el principal clon momento del diagnóstico o, por el contrario, se observa sólo en el momento de la recaída [6]. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la agresividad de t (4; 14) y mieloma sigue sin estar clara la contribución relativa de FGFR3 y MMSET como oncogenes putativo es controvertida, ya que el 25% de t (4; 14), los tumores no expresan FGFR3. La adquisición de mutaciones activadoras de FGFR3 (5-10% de t (4; 14) de los casos) con la progresión de la enfermedad indica un papel para FGFR3 en la patogénesis MM, y los primeros estudios demuestran el potencial oncogénico de mutante activado FGFR3 [4]. También se demostró recientemente que más de tipo salvaje FGFR3, como se expresa en la mayoría t FGFR3-positivo (4; 14), los tumores, puede contribuir a la oncogénesis de células B [7]. Por otra parte, una gran cantidad de datos preclínicos demuestran la eficacia de los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor y anticuerpos neutralizantes contra las células MM expresa FGFR3 mutaciones activadoras del receptor y de tipo salvaje (revisado en [3] - [5]). Del mismo modo, la inhibición de FGFR3 puede inducir la detención del ciclo celular y /o apoptosis en la Universidad de California [8], [9], tanto
in vitro
y
in vivo
, proporcionando la validación de que FGFR3 y abajo vías de señalización representar dianas terapéuticas potencialmente relevantes para el tratamiento de los cánceres de FGFR3-asociado.
FGFR3 es uno de los cuatro receptores de tirosina quinasa que median los efectos de los FGFs en diversos procesos celulares, incluyendo la proliferación, la diferenciación, y la migración. La activación del receptor desencadena vías de transducción de señales implicados en la oncogénesis, incluyendo el Ras /ERK /MAPK, PLCγ /PKC, PI3K, y las vías de STAT [10]. Una evidencia más reciente indica que la señalización del receptor FGF también puede activar NFKB [11], [12], la activación aberrante de la que se observa con frecuencia en cáncer humano [13], [14] y se correlaciona estrechamente con distintivos de cáncer [15]. Un intermedio clave en la señalización de NFkB, activada por TGF quinasa 1 (TAK1), las funciones de aguas abajo de múltiples vías de señalización, la supervivencia celular regular, la diferenciación y las respuestas inflamatorias [16], y se coloca como IKK-quinasa clave de la vía NFkB canónica [ ,,,0],17]. Química y la inhibición genética de TAK1 promueve la apoptosis en los tumores de la piel [18] y un subconjunto de cánceres de colon [19], así como la disminución de la quimiorresistencia en células de cáncer de mama y de colon [20] y la quimiorresistencia y la actividad NFkB en las células de cáncer de páncreas en la cultura [ ,,,0],21]. Además, la supresión de la señalización de TAK1 reduce la activación de NFkB en la cabeza humana y del cuello escamosas líneas celulares de carcinoma de células [22], las células de carcinoma de ovario [23], y las líneas celulares de cáncer de mama [24], y bloquea la adhesión de células de cáncer de mama, la invasión y la metástasis in vitro [25]. TAK1 no se ha investigado en el contexto de MM o cáncer de vejiga; Sin embargo, es blanco de abajo, NFkB, ha surgido como uno de los más potentes motores de tumorigénesis en MM, con hasta el 82% de las muestras MM que expresan moléculas de activación de firma [26], [27]. En consonancia con este papel oncogénico clave, varios medicamentos que son eficaces contra MM, incluyendo bortezomib, talidomida, lenalidomida y, bloquean la activación de NFkB (revisado en [28]). En la Universidad de California, supresión de la actividad NFkB potencia los efectos apoptóticos de agentes quimioterápicos y citoquinas [29], [30].
El uso de una combinación de dos híbridos de levadura y de microarrays de detección genética junto con los sistemas de análisis de vías, identificamos TAK1 como una novela interactor y el objetivo de la actividad tirosina quinasa FGFR3. Además, demuestran un papel para TAK1 como un regulador positivo de la actividad NFkB aguas abajo de FGFR3 tanto en el mieloma múltiple y carcinoma de células uroteliales, dos tipos de cáncer con afectación FGFR3 demostrado [10], [31], con efectos moduladores sobre la adhesión celular.
Métodos
Cultivo de células y transfección
FGFR3-negativo (RPMI-8226) y líneas celulares de MM humano se obtuvieron de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares de tipo salvaje (LP1) [DSMZ; Braunschweig, Alemania]; FGFR3 mutante células MM (KMS-11; Y373C) derivadas de un paciente MM y establecidos en la Escuela Médica de Kawasaki [32], fueron generosamente proporcionadas por el Dr. P Leif Bergsagel. La línea celular de cáncer de vejiga FGFR3 mutante, MGHU3 (Y375C), una especie de regalo del Dr. Margaret Knowles (Universidad de Leeds, Leeds, Reino Unido), se derivó de un tumor de grado 1 [33]. células MM y UC se mantuvieron en RPMI 1640 (Hyclone; Thermo Scientific, Rockford, IL) y HeLa y células HEK293 (ATCC) en DMEM (Hyclone), ambos medios suplementados con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen). La transfección transitoria de las células HeLa y HEK293 se logró utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies; Grand Island, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante y MM y UC líneas transfectadas utilizando el sistema de neón (Life Technologies). Siguiendo el procedimiento del fabricante, 1 × 10
6 UC o 2 × 10
se suspendieron 6 MM células en solución de suspensión de 100 l que contiene 5 g siRNA (Dharmacon) o plásmido y se pulsan en el programa 3 para la UC y el programa 15 ( KMS-11) o 20 (RPMI-8226) para las células MM.
Los anticuerpos y reactivos
anticuerpo FGFR3 (B-9, C-15) y /2/4 anticuerpos eran de FGFR1 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos frente a TAK1, ERK, fosfo-ERK, fosfo-tirosina (4G10), p65 y p84 eran de Millipore (Billerica, MA), como era IgG de conejo normal. FGF1 humano recombinante se obtuvo de R amp y; D Systems (Minneapolis, MN) y PD173074 de Sigma (St. Louis, MO). No focalización y siRNA TAK1-específica (tanto en TARGETplus SMART-piscina) fueron adquiridos de Dharmacon (Thermo Scientific). El colágeno humano de tipo IV fue de Sigma.
Plásmido construcciones
Untagged o C-terminal construcciones FGFR3-FLAG etiquetados se han descrito anteriormente [34], así como los constructos de FGFR2, y -4 [ ,,,0],35], [36]. El vector de expresión de FGFR1 se generó por clonación de longitud completa FGFR1 humano ORF en el vector pcDNA3.1 (Life Technologies), de acuerdo con el protocolo del fabricante. HA-etiquetados TAK1 murino fue proporcionado amablemente por el Dr. Hiroaki Sakurai (Universidad de Toyama, Toyama, Japón). NF-kB-Luc fue de Agilent Technologies (Santa Clara, CA), y el control de PRL-TK
Renilla
de Promega (Madison, WI).
levadura de 2 híbridos
Una pantalla de dos híbridos de levadura se llevó a cabo como se describe anteriormente [37]. En pocas palabras, de tipo salvaje o secuencias constitutivamente activos (K650E) de los dominio citoplásmico aminoácidos FGFR3 humanos 399-806) se fusionaron con el dominio de unión a LexA-DNA en el plásmido pBTM116 y utilizarse para cribar una biblioteca de proteínas de fusión de condrocitos humanos con el de codificación dominio de activación Gal4 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) en la cepa L40 de
Saccharomyces cerevisiae
. Los transformantes se cultivan 3-4 días en medios selectivos y las colonias resultantes deberán someterse a un ensayo de liberación de filtro β-galactosidasa. La posterior dominio de la cartografía se realizó de manera similar, el uso de secuencias de dominio citoplásmico truncado FGFR3 como cebo, se combina con secuencias TAK1 de longitud completa o C-terminales como presa.
inmunoprecipitación y análisis por inmunotransferencia
Las células se lavaron en PBS frío que contiene ortovanadato de sodio 1% y se lisaron en tampón de Nonidet P-40 de lisis 1% (20 mMTris-HCl, pH 7,5, NaCl 137 mM, 1% Nonidet P-40, EDTA 5 mM, NaF 50 mM, 1 mM ortovanadato de sodio, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10 mg /ml de aprotinina). Los lisados se pre-borran con perlas de proteína A-Sepharose (Millipore) y inmunoprecipitaciones realizadas durante la noche con anticuerpo de 2 mg. Los inmunoprecipitados se lavaron 3 veces con tampón de lisis, hervido 5 min en tampón de muestra y resuelto por 10% SDS-PAGE. Las membranas se bloquearon con tampón de partida de bloqueo del bloque (Thermo Scientific) y se sondearon como se indica. La unión del anticuerpo se detectó utilizando SuperSignal West Pico o SuperSignal West Dura sustrato quimioluminiscente (Thermo Scientific). Para Reprobe con otros anticuerpos, las membranas fueron despojados de los anticuerpos unidos utilizando Restaurar tampón de extracción (Thermo Scientific). Donde se indique, la densitometría se realizó usando ImageJ. Cabe señalar que la co-inmunoprecipitaciones de la Figura 1E se realizaron utilizando 30 l Dynabeads lavadas (Life Technologies) en lugar de perlas de proteína A-Sepharose y sin una etapa de preaclarado, pero fueron tratadas de otro modo como se describe anteriormente.
( a) Representación esquemática de dominios FGFR3 y TAK1 utiliza para la levadura de dos híbridos de selección y posterior mapeo de la interacción en la levadura. (B) endógena TAK1 interactúa con quinasa muerta (K508M), de tipo salvaje, y constitutivamente activa (K650E) FGFR3 en células HeLa. Los valores numéricos representan la relación de TAK1 co-precipita con FGFR3. (C) FGFR3 y TAK1 (tanto endógenas) interactúan en LP1 (FGFR3WT) y KMS-11 (FGFR3Y373C) varias líneas celulares de mieloma. La línea 8226 es negativo para el FGFR3. (D) endógena TAK1 interactúa con FGFR3 en células de cáncer de vejiga MGHU3 transfectadas con el tipo salvaje FGFR3. MGHU3 también expresan el FGFR3 mutación activadora, Y375C. (E) TAK1 (endógeno) interactúa con overexpressed FGFR1, -2, -4 y en células HEK293. TAK1 en el lisado total de FGFR1 transfectadas es detectable después de la exposición más larga (datos no mostrados). Para todos los borrones (B-E), inmunoprecipitaciones se realizaron a partir de lisado total de 1 mg utilizando el anticuerpo indicado. Las transferencias se ensayaron primero para la pareja de interacción que se está probando, a continuación, desnudado y re-probaron para la proteína inmunoprecipitada. 20 g de lisado total se sondeó de manera similar para controlar la expresión y la carga. La flecha indica TAK1. FGFR3 bandas múltiples representan diversos intermedios de glicosilación y aparecen como publicados anteriormente [45], [85]. Cuatro experimentos independientes se realizaron para cada panel.
Espectrometría de Masas Análisis
HEK293 células fueron transfectadas con plásmidos de expresión para TAK1 y constitutivamente activa (K650E) FGFR3. Después de 24 horas, los lisados celulares se prepararon como se describe [38], [39]. complejos inmunes TAK1 se precipitaron con anticuerpo anti-TAK1 a 4 ° C durante la noche, se recogen con Proteína A-Sepharose durante 2 horas adicionales, y después se digirieron con tripsina. Los péptidos fueron analizados por el Fondo de Proteómica de la Sanford-Burnham Medical Research Institute usando afinidad de metal cromatografía de cromatografía /ionización por electrospray espectrometría de masas inmovilizada /nano-líquido (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39].
FGFR3
in vitro Ensayo de quinasa
Los ensayos quinasa FGFR3 se llevaron a cabo como se describe anteriormente [40]. En pocas palabras, las reacciones de quinasa se realizaron en 50 l de tampón de quinasa (60 mMHepes-NaOH pH 7,5, MgCl 3 mM
2, MnCl 3 mM
2, 3 M Na
3Vo
4, 1,2 mM TDT) suplementado con 2,5 g de PEG, ATP 100 mM y TAK1 humana recombinante (500 ng; Abnova, la ciudad de Taipei, Taiwán) como sustrato. se utilizó a 300 ng por reacción
Procedimientos de microarrays y Análisis
Las células se transfectaron con 5 mg no director, el dominio intracelular recombinante activa FGFR3 (SignalChem, Richmond, CA 397-End). o siRNA TAK1 específica y se dejó recuperar durante la noche. El día siguiente, las células se mantuvieron sin tratamiento o recibieron 100 nM PD173074 durante 48 horas antes del aislamiento de ARN. Cada tratamiento se preparó como muestras por triplicado. El ARN total se procesó según lo recomendado por Affymetrix, Inc. En resumen, el RNA fue aislado utilizando Trizol (Life Technologies) y se hace pasar a través de columnas de centrifugación RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) para limpiar más arriba. El Fondo para el ADN UCI Microarray Core cuantificó el ARN total por NanoDrop (Thermo Scientific) y la prueba de la pureza utilizando el Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). El kit Ambion expresión WT (Life Technologies) se utilizó para preparar las muestras de ARN para el análisis de toda transcriptoma de microarrays. Dos ug de la etiqueta, fragmentada ADNc de cadena sencilla se hibrida a la sonda se pone en una matriz humana AffymetrixGeneChip 1.0ST. Las matrices fueron escaneados utilizando el escáner GeneChip 3000 7 G y la consola de comandos de software v. 3.2.3. Los resultados están disponibles a través de la Expresión Génica Omnibus (GEO) repositorio (número de acceso GSE52452)
Los datos fueron importados en el software Partek Genómica Suite versión 6.6 con las siguientes operaciones que se realizan para preparar los datos para el análisis estadístico:. 1) RMA corrección de fondo, 2) cuantil normalización, 3) logaritmo en base 2 de transformación, y 4) Resumen de la sonda fija utilizando valor medio. El análisis estadístico consistió en un modelo lineal con una sola variable categórica, y las listas de genes fueron generados por esos genes con factor de cambio de magnitud & gt; 2 y p-valor con una tasa de falso descubrimiento (FDR). & lt; 0,05
gene listas fueron importados en Ingenuity Systems Pathway Analysis software (IPA), que tiene funciones para la generación de redes de genes, selección de genes en diferentes categorías funcionales y de otro, y por la superposición de genes en las vías de señalización conocidas, la coloración por el cambio veces o alguna otro valor.
RT-PCR cuantitativa
El ARN total se aisló de MGHU3 y células KMS-11 por medio de TRIzol (Life Technologies) y se hace pasar a través de columnas RNeasy spin (Qiagen) para limpiar más arriba. la síntesis de ADNc cebado al azar se realizó en 1 mg de ARN total usando el Kit de superíndice III RT (Life Technologies). Todos los pares de cebadores fueron intrón-que abarca y se incluyó un control sin RT. Los pares de cebadores fueron los siguientes: La actina inversa AGGTGTGGTGCCAGATTTTC y transmita GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH y GCCAGTGGACTCCACGAC CAACTACATGGTTTACATG adelante atrás, DFNA5
revertir
CAGGTTCAGCTTGACCTTCC y
hacia adelante
ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 CCGTGCATTGAAGTAGTGGA y ACGGTGACAGCGTTTAACAA adelante atrás, PSCA GTTCTTCTTGCCCACGTAGT retroceso y CAGGTGAGCAACGAGGAC hacia adelante, marcha atrás BAMBI GAAGTCAGCTCCTGCACCTT y transmita TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 inversa CGCTGTTTTCCTGCCATTTC y transmita GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 inversa TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT y transmita CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.
NFkB ensayo de luciferasa
Las células se transfectaron con 5 mg o no focalización TAK1 siRNAs específicos de. Veinticuatro horas después, las células fueron transfectadas con NF-kappa B-Luc y control pRL-TK
Renilla
en una proporción de 3:01 y se les permitió recuperarse durante 24 horas. Donde se indique, las células se transfectaron simultáneamente con los plásmidos indicados FGFR3. Las células fueron privadas de suero durante la noche, seguido de un tratamiento de 8 horas con 40 ng /ml FGF1. La actividad de luciferasa se detectó usando un ensayo de indicador de doble luciferasa (Promega: Madison, WI). Las diferencias en la actividad NFkB siguientes TAK1 silenciamiento bajo cada condición de tratamiento se analizaron estadísticamente utilizando una prueba t de dos colas no apareada.
Cell fraccionamiento
MGHU3 células fueron transfectadas con 5 mg o no focalización TAK1 siRNAs específicos de. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células fueron privadas de suero durante la noche, después se trataron con 40 FGF1 ng /ml durante 0, 5 o 60 minutos. Las células se recogieron entonces fraccionado, utilizando un protocolo adaptado de [41].
ensayo de adhesión celular
Las células se transfectaron con 5 mg no la focalización o siRNA TAK1-específico y se dejaron recuperar durante la noche. El día siguiente, las células se mantuvieron sin tratamiento o recibieron 50 nM PD173074 durante 48 horas antes de chapado del ensayo de adhesión. Las células tratadas con FGF1 eran privaron de suero durante la noche y se trató con ligando 1 hora antes de la galvanoplastia y durante toda la duración del ensayo. ensayos de adhesión se llevaron a cabo 72 horas después de la transfección. Brevemente, placas de noventa y seis pocillos se recubrieron durante la noche a 4 ° C con 1 mg /ml de colágeno IV, se bloquearon con 1% de BSA durante 1 hora a 37 ° C, y se lavaron dos veces con PBS y una vez con medio libre de suero. Se recogieron las células y se sembraron a 5 x 10
4 en las placas pre-recubiertas, en presencia de el tratamiento indicado. Las células se dejaron adherir 3 horas a 37 ° C, los pocillos se lavaron 3 veces con PBS para eliminar las células no adherentes, y la adhesión determinaron después de 4 horas de incubación con calceína-AM (Life Technologies) mediante la medición de intensidad de fluorescencia a Ex /Em 490 /520 nm. El análisis estadístico de las diferencias en la adhesión celular siguientes TAK1 silenciamiento bajo cada condición de tratamiento se realizó mediante una prueba t de dos colas no apareada.
Resultados
FGFR3 interactúa con TAK1
La la identificación de las interacciones proteína puede proporcionar información crítica sobre las vías de señalización específicas e identificar potenciales nuevas dianas terapéuticas. En MM, el papel específico de FGFR3 ectópica expresó en un subconjunto de casos sigue siendo controvertido, mientras que en el cáncer de vejiga, FGFR3 Recientemente se ha implicado como un importante motor de la proliferación [42]. Tomamos un enfoque sistemático para lograr una mejor comprensión de FGFR3 de señalización en los cánceres asociados a través de la identificación de nuevas interacciones proteína FGFR3 utilizando un ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H). El dominio citoplásmico de FGFR3 humano (aminoácidos 399-806), que contiene la secuencia de tipo salvaje o de la fuerte activación de la mutación K650E, se utilizó como cebo para seleccionar una biblioteca de ADNc de condrocitos humanos primarios (Fig. 1A) como se describe [37]. Esta biblioteca fue elegido como FGFR3 es altamente expresado en los condrocitos, y la mutación K650E fuertemente la activación, presente en un subconjunto de los dos MM y UC [43], está presente en el dominio de tirosina quinasa intracelular. interacciones potenciales fueron identificados mediante el ensayo de β-galactosidasa de liberación de filtro, secuenciados, y de nuevo a prueba para la interacción en la levadura. Entre las interacciones identificadas fueron las proteínas de transducción de señales, incluyendo la subunidad reguladora p85 de PI3-quinasa [37], y TAK1. El plásmido de levadura presa constaba de los C-terminales 138 aminoácidos de TAK1 (aminoácidos 441-579), indicando que esta región de TAK1 está implicado en la unión FGFR3. Se determinó además por Y2H usando construcciones de dominio de FGFR3 (Fig. 1A) que la región que abarca la segunda mitad del dominio de tirosina quinasa de FGFR3, que contiene el bucle de activación del receptor y la cola C-terminal de FGFR3 (aminoácidos 589-806) , es suficiente para la interacción FGFR3-TAK1. Para confirmar la interacción FGFR3-TAK1 en células de mamífero y, en concreto, las líneas celulares de cáncer de FGFR3-asociado, construcciones FGFR3 humanos, incluidos los de tipo salvaje, quinasa-muertos y secuencias constitutivamente activos (K650E), se expresaron de forma transitoria en células HeLa. TAK1 co-inmunoprecipitó con todas las secuencias de FGFR3 probados; lo que demuestra que FGFR3 y TAK1 interactúan en células de mamífero y que la activación del receptor no se requiere (Figura 1B). FGFR3 endógeno en dos t (4; 14) de líneas celulares de MM, LP-1 (en peso) y KMS-11 (Y373C) [44], [45], también interactuado con TAK1 por co-inmunoprecipitación (Figura 1C). Como hemos observado niveles de FGFR3 fueron considerablemente más bajos en MGHU3 que las líneas de MM, FGFR3
WT se sobreexpresa adecuada para la detección de una interacción TAK1-FGFR3 en MGHU3 (Figura 1D). Tenga en cuenta que las células MGHU3 UC llevan la misma mutación FGFR3 como las células MM-11 KMS. Una interacción FGFR3-TAK1 también se evaluó en células UC RT-112, que expresan un FGFR3 (aminoácidos 1-758) truncada de tipo salvaje en fusión con la transformación de ácido espiral de la bobina (3) TACC3 secuencias (residuos 433-838) [46 ]. No hemos podido detectar de manera convincente la interacción en esta línea, apoyando además la importancia de FGFR3 secuencias C-terminales en la interacción con TAK1 (datos no mostrados). Por último, también utilizó la espectrometría de masas para caracterizar proteínas recuperadas en inmunoprecipitados TAK1. Después de la expresión de ambos activan FGFR3-K650E y TAK1 en células HEK293, inmunoprecipitados TAK1 se analizaron por afinidad de metal inmovilizado cromatografía /espectrometría de nano-cromatografía líquida de masas de ionización /electrospray (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. En tres muestras independientes, además de la cobertura significativa de TAKI como era de esperar, los péptidos derivados de FGFR3 que representa una cobertura del 48% en general se identifican de forma inequívoca, tal como se presenta en la Tabla 1. En conjunto, estos resultados proporcionan evidencia de una nueva interacción entre el FGFR3 y que hace TAK1 no requiere la activación del receptor. Hay precedencia para esto con el adaptador FRS2, que interactúa con receptores de FGF constitutivamente, sin embargo, sólo se activa la señalización corriente abajo (ERK /MAPK) tras la activación del receptor [47]. Además, demuestran que FGFR1, 2 y 4 transitoriamente expresado en células HEK293, también interactúan con TAK1 (Figura 1E), lo que sugiere que la interacción es muy relevante para la señalización del receptor de FGF.
FGFR3 puede fosforilar la tirosina TAK1
in vitro
activación TAK1 en requiere Ser /Thr en la fosforilación de múltiples residuos en el bucle de activación (revisado en [48], [49]). Aunque la fosforilación de tirosina de TAK1 no se ha informado anteriormente, las funciones de FGFR3 como una tirosina quinasa; Por lo tanto, se evaluó la posibilidad de que el FGFR3 puede fosforilar la tirosina TAK1. De hecho, encontramos que TAK1 fue tirosina fosforilada en células HEK293 que expresan transitoriamente constitutivamente activa FGFR3 (K650E), pero no la quinasa muerta receptor (K508M), indicando que activa FGFR3 puede directa o indirectamente tirosina fosforilar TAK1 (Figura 2A). TAK1 fosforilación de la tirosina, se observó en un ensayo de quinasa libre de células usando TAK1 recombinante y el dominio intracelular quinasa activa de FGFR3, lo que indica que TAK1 puede ser un objetivo directo de la actividad de tirosina quinasa FGFR3 (Figura 2B)
.
Las células HEK293 (a) transfectadas con FGFR3
K508M o FGFR3
K650E. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lisaron y se inmunoprecipitaron TAK1 de 1 mg lisado total. Los inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron, y se sondaron con anticuerpo 4G10. La flecha indica TAK1. Representante de seis experimentos. (B) Un ensayo de quinasa libre de células se realizó utilizando TAK1 humana recombinante tiene un sustrato para FGFR3 humana recombinante (dominio de tirosina quinasa). Fosforilación de la tirosina se visualizó mediante inmunotransferencia con anticuerpo 4G10. Representativos de cuatro experimentos.
análisis de expresión génica Identifica NFkB como un centro de señalización de FGFR3 y TAK1 Integración
TAK1 es un mediador clave de las cascadas de señalización que conducen a la activación del NFkB y AP factores de transcripción -1, que cada uno modulan la expresión de genes implicados en la oncogénesis y la apoptosis (revisado en [16], [50]). Para comenzar a investigar la integración de TAK1 y FGFR3 señalización en las células cancerosas, se realizó un análisis de microarrays comparativo de la expresión génica en la línea celular de cáncer MGHU3 vejiga, que expresa la Y375C FGFR3 mutación que activa y exhibe una fuerte respuesta a la PD173074 específico del receptor de FGF inhibidor según la evaluación de la fosforilación de ERK [9]. Para identificar los genes que son dependientes de las dos señales de FGFR3 y TAK1, MGHU3 células fueron transfectadas con la orientación no-o TAK1-siRNA, y cada subconjunto trata adicionalmente con PD173074, o control del vehículo. Una forma ANOVA con el cambio veces magnitud & gt; 2 y p-valor con FDR & lt; 0,05 se utilizó para generar listas de genes. TAK1 siRNA frente a muestras no siRNA dirigidos produjo 39 cambios en los genes que reflejan los genes específicos TAK1 en presencia de la señalización de FGFR3. TAK1 siRNA además PD173074 en comparación con muestras no siRNA dirigidos a más de 105 PD173074 produjeron cambios en los genes que reflejan los genes específicos TAK1 en ausencia de señalización de FGFR3. Para discernir cambios que dependen tanto FGFR3 y TAK1, genes que muestran cambios en los genes estadísticamente significativas derivadas de TAK1 knockdown sólo en la presencia de FGFR3 de señalización, pero no en su ausencia se seleccionado. La superposición de genes del conjunto de 105 TAK1 cambios genéticos en ausencia de señalización de FGFR3 se retiraron de los 39 TAK1 cambios genéticos en la presencia de la actividad de FGFR3. Los 13 genes únicos que permanecían modifican, de manera significativa en estas condiciones representan los genes que reflejan tanto TAK1 y la señalización de FGFR3 (Tabla 2).
Elegimos 6 genes de la lista de 13 para la validación en función de su relevancia en el cáncer, y encontraron que los cambios observados fueron reproducibles por qPCR, tanto en MGHU3 y la línea MM KMS-11 tratado con TAK1 desmontables y /o inhibición del receptor de FGF como se describe anteriormente para el análisis de microarrays (Tabla 2). La única excepción es GSTA1, que tiene niveles muy bajos de expresión en células de MM. Por último, la entrada de la lista de los 13 genes en la herramienta de análisis Ingenuity Pathway Sistemas (IPA) resultó en un solo gen de red (red de anotar 40) con un gran eje en torno al NFkB (Figura 3). Estos resultados sugieren una relación fundamental entre FGFR3 y la señalización TAK1 que pueda afectar la activación de NFkB y por lo tanto la patogénesis del cáncer en los cánceres de FGFR3-asociado. Un segundo cubo centrado alrededor de PI3K es consistente con nuestros resultados previos que muestran una interacción entre el FGFR3 y la subunidad reguladora p85 de PI3K [37].
El 13 de FGFR3 único y los genes dependientes TAK1 (Tabla 1) fueron evaluados por el ingenio Análisis vía software (IPA), la producción de una sola red (puntuación de la red de 40) que contiene los principales centros de NFkB y PI3K. formas moleculares de la API incluyen: Complejo /grupo (NFkB, PI3K), citoquina /factor de crecimiento (IKBKG, SGK1), enzima (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), canal de iones (SCNNIG), regulador transcripcional (TEAD1, VGLL1), el transportador (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3), y otra (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST Clase A, HDGFRP2, ins1, insulina, MT2A, PKC (s), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . IPA: Relaciones líneas continuas indican una interacción directa; las líneas discontinuas indican la interacción indirecta; flechas llenas indican "actúa sobre"; flechas abiertas indican "se transloca al"; - | indica "inhibe" y - | ▸ indica "actúa sobre y desactivaciones. Verde /rojo indica los genes abajo /arriba-regulada en el microarray (Tabla 1).
Activado FGFR3 regula positivamente la actividad NFkB través TAK1
La activación de NFkB contribuye a la patogénesis MM, mejorando el crecimiento, la supervivencia, y la metástasis (revisado en [28]), y también promueve la supervivencia de las células de cáncer de vejiga [29], [30]. En base a la importancia potencial de la actividad de NFkB y perfiles de expresión génica resultados que implican la señalización de NFkB como un objetivo para la interacción FGFR3 y TAK1, se evaluó la contribución combinada de FGFR3 y TAK1 a la actividad NFkB en las células cancerosas usando un ensayo de indicador de NFkB-luciferasa. Como se muestra en la evaluación inicial de las líneas de MM (Figura 4A), la expresión de mutantes de FGFR3 constitutivamente activos aumentó dramáticamente NFkB actividad transcripcional. Para determinar si se requiere para la activación de NFkB TAK1 por FGFR3, se evaluó siRNA desmontables de TAK1 en líneas MM y UC que expresan FGFR3 endógeno. En todas las líneas, ya sea expresando de tipo salvaje o mutante FGFR3, se observó reducción significativa tras la activación de NFkB desmontables de TAK1 (figuras 4 B, C). Además del ligando mejorado este efecto en las células MGHU3, probablemente mediante la activación de otros receptores de FGF [42]. Como prueba final de la activación de NFkB, se evaluó la localización nuclear de la subunidad p65 activa de NFkB. MGHU3 células se ensayaron y mostraron un aumento de p65 nuclear en el tratamiento ligando FGF1, y los niveles de p65 nuclear se redujeron a TAK1 caída, que es consistente con los datos de la luciferasa NFkB (Figura 4D). Notablemente, TAK1 no se requiere para la principal vía de señalización MAPK FGFR3-respuesta, como lo demuestra la incapacidad de TAK1 desmontables para alterar la fosforilación de ERK por FGFR3 (Figura 4E).