Extracto
crecimiento de fibroblastos receptor del factor de 4 (FGFR4) es de vital importancia en el desarrollo temprano y la reparación de tejidos. los niveles de expresión FGFR4 son muy restringidas en los tejidos adultos, salvo en varios tumores sólidos, incluyendo cáncer colorrectal, que mostró sobreexpresión de FGFR4. En este caso, el análisis de mutación FGFR4 descartó la presencia de mutaciones activadoras, aparte de Arg
388, en diferentes líneas celulares de cáncer colorrectal y muestras tumorales. Estable shRNA FGFR4-silenciamiento en líneas de células SW480 y SW48 resultó en una disminución significativa en la proliferación celular, la adhesión, la migración celular y la invasión. Esta disminución de las capacidades tumorigénicas e invasivos de células de cáncer colorrectal fue acompañado por una disminución de Snail, torsión y TGF niveles de expresión génica y un aumento de E-cadherina, causando una reversión a un fenotipo más epitelial, en tres líneas celulares diferentes. Además, FGFR4-señalización activa la oncogénico SRC, ERK1 /2 y Akt en células de cáncer de colon y promueve un aumento en la supervivencia celular. La relevancia de FGFR4 en el crecimiento tumoral fue apoyada por dos estrategias diferentes. inhibidores de la quinasa abrogaron el crecimiento celular relacionados FGFR4 y vías de señalización en la misma medida que las células FGFR4 silenciados. Los anticuerpos específicos FGFR4 segmentación utilizando provocaron una reducción similar en el crecimiento celular. Por otra parte, las células knock-down FGFR4 muestran una capacidad reducida para
in vivo la formación
tumoral y la angiogénesis en ratones desnudos. En conjunto, nuestros datos apoyan un papel crucial para FGFR4 en la tumorigénesis, la invasión y la supervivencia en el cáncer colorrectal. Además, FGFR4 focalización demuestra su aplicabilidad para la terapia del cáncer colorrectal
Visto:. Peláez García-A, Barderas R, S Torres, Hernández-Varas P, J Teixidó, Bonilla M, et al. (2013) El papel FGFR4 en transición epitelio-mesenquimal y su valor terapéutico en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10.1371 /journal.pone.0063695
Editor: Qian Tao, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 9 de noviembre de 2012; Aceptado: 6 Abril 2013; Publicado: 16 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Peláez García y otros. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por conceder BIO2009-08818 del Ministerio de Ciencia e Innovación español, otorgar a los grupos de investigación establecidas (AECC) y otorgar S2011 /DMB-2344 /Colomics2 de la Comunidad de Madrid. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El fibroblasto factores de crecimiento (FGF) han sido implicados en varios procesos biológicos durante el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la hematopoyesis y la angiogénesis [1]. Se unen a cuatro receptores del FGF (FGFR) designados FGFR1-4 [2]. La estructura FGFR incluye un dominio de unión a ligando que contiene tres diferentes dominios de tipo inmunoglobulina (Ig denominado I, II y Ig Ig III). El dominio de ligando es seguido por un único dominio transmembrana y un dominio de tirosina quinasa citoplásmica intracelular. FGFR4 muestra el patrón más restringido de expresión para el desarrollo embrionario y la reparación de tejidos [3], [4], en comparación con los otros tres FGFRs, y sus niveles de expresión disminuyen después del nacimiento. En los adultos, FGFR4 se expresa en miofibroblastos musculares durante la regeneración después de la lesión, pero no en el músculo esquelético maduro [5]. receptores de FGF desregulación se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer. Se han propuesto Estas alteraciones a ocurrir a través de la sobreexpresión, amplificación de genes o mutación [6].
Anteriormente, nuestro grupo identificó FGFR4 como un objetivo de autoanticuerpos en el cáncer colorrectal (CRC), utilizando microarrays de proteínas [7]. Además, se observó una clara sobreexpresión de FGFR4 en líneas celulares de cáncer colorrectal (en particular, en 2 de 4 líneas celulares de cáncer colorrectal metastásico altamente) con una posible asociación de FGFR4-expresión de las últimas etapas del cáncer colorrectal [8]. FGFR4 se ha informado de que se sobre-expresan en mama, próstata, colon, rabdomiosarcoma, gástricos, pancreáticos, hepatocelular y pituitaria adenocarcinomas humanos [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], donde se puede contribuir a la progresión del tumor por múltiples mecanismos [4], [9]. Por otra parte, los niveles de expresión FGFR4 se asociaron con enfermedad metastásica y pobre supervivencia en gástrico, de pulmón, adenocarcinoma de mama y rabdomiosarcoma [16], [17], [18]. FGFR4 mutaciones somáticas son poco frecuentes en el cáncer [11], [19], [20], [21]; Arg
388 es el polimorfismo de nucleótido único más común (SNP) en FGFR4, lo que provoca mejorado la estabilidad y la activación del receptor prolonga. Se ha asociado con un mal pronóstico para el cáncer de ganglios positivos de mama, sarcomas de tejidos blandos de alto grado, cabeza y cuello y pulmón carcinoma de células escamosas [9], [16], [18], [22], [23].
Entre los ligandos FGF 18, FGF19 se une preferentemente FGFR4 [24], a pesar de que también se une FGFR1. La unión se produce en un complejo de heparina que comprende, FGFR4 y dos moléculas de FGF, lo que desencadena FGFR dimerización, que conduce a la autofosforilación de múltiples residuos de tirosina en el dominio tirosina quinasa intracelular [3], [25]. FGF19-FGFR4 ha sido propuesto para desempeñar un papel en la inducción de la proliferación de hepatocitos y la carcinogénesis [26]. Los anticuerpos dirigidos contra FGF19 han mostrado una promesa terapéutica en diferentes xenoinjertos de tumores [27]. Sin embargo, el bloqueo de FGF19 podría actuar sobre diferentes receptores de FGF [28].
Hemos utilizado diferentes muestras de cáncer de colon y líneas celulares (SW480, SW620, SW48, KM12C y KM12SM) [29], [30], [31] para investigar la presencia de SNPs o mutaciones activantes en FGFR4 y caracterizar su relevancia biológica como oncogén y diana terapéutica en el cáncer colorrectal. células epiteliales KM12C y KM12SM poseen antecedentes genéticos similares, que difieren en sus propiedades metastásicas [31]. SW480 y SW620 son dos líneas celulares de cáncer colorrectal isogénicas. SW480 se aisló de tumor B de Duke un primario de cáncer colorrectal, mientras que la línea celular SW620 se aisló de un ganglio linfático metastásico del mismo paciente [30]. células de cáncer colorrectal SW48 se derivó de un tumor en la etapa C de Duke [30]. Estas cinco líneas celulares difieren también en FGFR4 niveles de expresión de proteínas [8]. En nuestro estudio, no se encontraron nuevos SNPs o mutaciones activadoras en FGFR4. Sin embargo, los experimentos de pérdida de función revelaron un papel importante de FGFR4 en las propiedades tumorigénicas de células de cáncer colorrectal, puesto que su agotamiento abrogó la proliferación, adhesión, migración y la invasión. FGFR4-silenciamiento causado una sobre regulación de la expresión de E-cadherina y la baja regulación de otros mediadores de transición (EMT) epitelio-mesénquima y Caracol. Por último, hemos demostrado que FGFR4 focalización fue capaz de bloquear el crecimiento del tumor
in vitro
y
in vivo
.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
el Comité de ética del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, España) aprobó los protocolos utilizados para el trabajo experimental con ratones.
Líneas celulares, extracción de RNA, y anticuerpos inhibidores
líneas celulares de cáncer colorrectal KM12C y KM12SM [31], [32] se obtuvieron del Dr. I. Fidler (MD Anderson). SW480, las líneas celulares HEK293 fueron SW48 y de la ATCC. Las células se cultivaron de acuerdo con los protocolos establecidos [7]. Se extrajo ARN de líneas celulares y 20 emparejado tejido normal /tumoral de pacientes con cáncer con el Kit RNeasy Mini (Qiagen Inc.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN extraído se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc.).
Se utilizaron un total de 15 anticuerpos diferentes, incluyendo las proteínas relacionadas con la FGFR4 de señalización proteínas de la vía y de control. Fuente, clonalidad y condiciones de uso para todos los casos y la técnica se especifican en la Tabla S1. -FGFR4 específica anticuerpo policlonal (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) y el control de anticuerpo policlonal-GST específico de GE Healthcare fueron utilizados para experimentos FGFR4-orientación. inhibidores de FGFR eran PD173074 (Sigma) y TKI-258 (Novartis). PD173074 es un inhibidor de pan-FGFR que induce la apoptosis [33]. TKI-258 es un inhibidor de la multi-quinasa clínicamente relevante, incluyendo VEGFR y PDGFR quinasas entre otros [34]. Otros inhibidores fueron: PP2 (Sigma) para SRC, JNK Inhibitor II y UO126 (Calbiochem) para MEK1 /2. Fueron utilizados en 3 micras y 15 micras como se informó anteriormente [35].
Vectors, shRNAs, siRNAs y Transfections
pRS vectores que contienen específica shRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 y TI378644) para FGFR4 (NM_022963) y un control shRNA no efectiva contra cualquier secuencia humana (TR30003) eran de Origene. células transfectadas de forma estable se obtuvieron por la infección retroviral. Brevemente, las células fueron transfectadas con HEK293FT vectores PRS y pNGVL-gag-pol y vectores de empaquetamiento pNGVL-VSVG utilizando el reactivo de transfección jetPRIME (Polyplus). Después de incubar las células durante 12 a 15 h en medio libre de suero, se reemplazó el medio con DMEM que contiene 10% de FBS y penicilina /estreptomicina. El día después, se centrifugó medios que contienen partículas lentivirales, se diluyó 01:02-01:10 en DMEM que contenía 10% de FBS y antibióticos y se añadió directamente a las células de cáncer colorrectal SW480 y SW48. Después de tres días de incubación, infectadas se seleccionaron células de cáncer colorrectal SW480 y SW48 usando 1 mg /ml de puromicina (Sigma) durante 2-3 semanas. Luego, las células se cultivaron con 0,5 g puromicina /ml.
FGFR4 siRNAs y los controles fueron adquiridos de Sigma. Para las transfecciones siRNA, 5 × 10
5 células fueron sembradas en placas de cultivo y se mantuvieron en DMEM con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 24 h. Las células fueron transfectadas con 55 pmol siRNA usando 2 l de reactivo de transfección JetPrime en 200 l de tampón de JetPrime. Entonces, 48 h después de la transfección, las células se analizaron por Western blot y semi-cuantitativo PCR [35].
Análisis de Secuencias, semi-cuantitativa y cuantitativa en tiempo real PCR
cDNA se sintetizó usando el kit SuperScript III Primera Strand Synthesis (Invitrogen). Los cebadores utilizados para obtener la secuencia FGFR4 fueron descritas anteriormente [36]. En resumen, cuatro pares de cebadores (A, B, C y D) se utilizaron para obtener toda la molécula por PCR en fragmentos de aproximadamente 1000 pb utilizando el Advantage 2 de la polimerasa (Clontech). Exonucleasa I (USB) y fosfatasa alcalina de gamba (USB) se han añadido a los productos de PCR. Ellos fueron secuenciados directamente en un secuenciador ABI7002 (Applied Biosystems).
cDNA se sintetizó como antes y se usó directamente para el análisis semi-cuantitativo de PCR de los niveles de TGF-beta 1 y de ARNm de GAPDH en líneas celulares de cáncer colorrectal. Las reacciones de PCR se realizaron usando los siguientes cebadores; humano TGF-β1, el sentido 5'-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 ', 5'-antisentido CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3'; GAPDH humana, el sentido, 5'-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ', 5'-antisentido CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3'. primers específicos para FGFR1-3 utilizaron para probar la especificidad de shRNAs y siRNAs dirigidos contra FGFR4 fueron: FGFR1, el sentido 5'-CACAAGCCACGGCGGACT-3 ', 5'-antisentido TGATGCTCCAGGTGGCAT-3'; FGFR2, el sentido 5'-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 ', 5'-antisentido GACAAAATCTTCCGCACCATC-3'; y FGFR3, el sentido 5'-CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 ', 5'-antisentido TGCTGCCAAACTTGTTCT-3'.
Para QRT-PCR, las reacciones se llevaron a cabo utilizando cebadores descritos anteriormente EMT marcadores [37] y SYBR-Green PCR Maestro Mix (Applied Biosystems), por triplicado. PCR y la recogida de datos se realizaron en IQ5 (BioRad). Todas las cuantificaciones se normalizaron usando GAPDH humano. Para la PCR semi-cuantitativa, se utilizó el par de cebadores D para determinar la cantidad de FGFR4 ADNc, utilizando la amplificación con cebadores específicos de GAPDH como control [36].
Análisis Western Blot
Proteína extractos de células de cáncer colorrectal se prepararon y se cuantificó con el kit de 2D-Quant (GE Healthcare) de acuerdo con los protocolos publicados anteriormente [7]. A continuación, 25 g de proteína de cada extracto se corrieron en paralelo usando 10% de SDS-PAGE. Para la inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C extra) usando el equipo semi-seco (Bio-Rad). Después del bloqueo, las membranas se incubaron con anticuerpos mono- o policlonales específicos contra las proteínas seleccionadas. Las membranas se incubaron a diluciones optimizados con anticuerpos primarios seguidos de incubación, ya sea con HRP anti-ratón IgG (Pierce) a una dilución 1:5000 o HRP-anti-IgG de conejo (Sigma) a una dilución 1:5000. proteínas reactivas específicas se visualizaron con SuperSignal West Pico máxima sensibilidad Substrato (Pierce). La abundancia de las proteínas en ensayos de Western blot se determinó por densitometría usando v4.6 Cantidad Uno de Software de Análisis de 1D (Bio-Rad Laboratories).
adhesión celular, invasión, detección de apoptosis, proliferación, y la Curación de Heridas Los ensayos
Para los ensayos de adhesión celular, placas de 96 pocillos se revistieron con Matrigel (0,4 mg /mm
2) (BD Biosciences) en tampón de recubrimiento (0,1 M NaHCO
3 pH: 8,8) durante la noche a 4 ° C y, a continuación, se incubaron con medio de adhesión (0,5% de albúmina de suero bovino en DMEM libre de suero) durante 2 horas a 37 ° C para bloquear la unión no específica. Las células se mueren de inanición sin suero durante 5 h y se marcaron con BCECF-AM (Molecular Probes) durante 30 min a 37 ° C, individual con EDTA 2 mM en PBS y se resuspendieron en medio de adhesión. Después, se añadieron 10
5 células por triplicado a las placas y se incubaron durante 30 min. Para eliminar las células no adherentes, las placas se lavaron dos veces con DMEM. Las células unidas se lisaron mediante SDS al 1% en PBS y se cuantificó la fluorescencia en un lector de Flash multimodo Varioskan (Thermo Scientific). Para ensayos de invasión de Matrigel, 8 × 10
5 SW480 o SW48 células se resuspendieron en medio invasión filtros de tamaño de poro y se cargó en 8 micras (DMEM que contiene 0,5% de BSA libre de suero) recubiertas con 35 a 50 l de 1 :3 dilución de Matrigel (BD Biosciences) en Transwells (Costar). Los compartimentos inferiores de cámaras de invasión se llenaron con medio que contiene 10% de FBS (Gibco). Después de 22 h de incubación a 37 ° C, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior del filtro, y las células que migraron a través del filtro se fijaron con paraformaldehído al 4% (Sigma), se tiñeron con cristal violeta y las células invasoras contadas bajo un microscopio. Para la cicatrización de heridas, las células SW480 y SW48 se sembraron por triplicado a una densidad de 10
6 células por pocillo en placas de 24 pocillos. Después de la unión, un 1 mm de ancho de la herida se produce en la monocapa de células, el medio de crecimiento fue sustituido y se tomó una imagen (día 0) en un microscopio Olympus CK40 equipado con una cámara Olympus DP12 a 40 × magnificación. Las imágenes del mismo campo se tomaron cada 24 h.
Para los ensayos de detección de la apoptosis, las células fueron incubadas con 1 mM H
2O
2 durante 16 horas sin suero. Luego, las células se separaron y se incubaron con FITC-anexina etiquetada V (Miltenyi Biotec Inc.) y yoduro de propidio según las instrucciones del fabricante, y se analizaron mediante citofluorometría (Coulter Epics XL). Para los ensayos de proliferación celular, los experimentos se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos establecidos [38], [39]. Brevemente, el medio de crecimiento se cambió 24 h después de la siembra (día 0) y las células se incubaron adicionalmente durante tres días. A continuación, se eliminó el medio y las células se tiñeron con 100 l de colorante cromogénico 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (Sigma) a una concentración final de 1 mg /ml en DMEM . Las células fueron incubadas durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO
2. A continuación, el medio se aspiró cuidadosamente y 100 l de DMSO (Sigma) se añadieron a cada pocillo para romper las células. Se leyó la absorbancia a 570 nm. Todos los experimentos se realizaron tres veces por duplicado. Para la reducción de la proliferación, la viabilidad celular fue representado comparar el efecto de anti-FGFR4 o anti-GST (como control) anticuerpos o inhibidores específicos en comparación con las células sin tratar (100% de la proliferación) se incubaron en las mismas condiciones [39].
Microscopía confocal
las células fueron fijadas con paraformaldehído al 1% y se permeabilizaron con PBS-0,5% de Triton X-100 antes de la incubación con el anticuerpo específico FGFR4 o TRITC-faloidina durante 1 hora a 37 ° C . FGFR4 o anticuerpos E-cadherina se detectaron con el anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con AlexaFluor 488. Las células fueron observadas con un microscopio confocal (TCS-SP5-AOBS-UV, Leica Microsystems-) después núcleo contratinción con DAPI. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de inmersión en aceite de 63 × utilizando el Leica Confocal Software. imágenes mostradas fueron capturados en las mismas secciones en las diferentes muestras.
En vivo
xenoinjertos de tumores
ratones desnudos suizos (Charles River) se utiliza para la metástasis tumorales y estudios de xenoinjertos . El Comité Ético del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, España) aprobó los protocolos que se utilizan para el trabajo experimental con ratones.
En xenoinjertos de tumores, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea en el flanco derecho por medio de 1 × 10
7 SW48 establemente transfectadas con células de cáncer colorrectal en 0,2 ml de PBS en Matrigel diluido 1:03. tamaños de los tumores fueron controlados al menos dos veces por semana y cada animal fue sacrificado mediante una cámara de CO 2
de conformidad con las Directrices para puntos finales Humanos para el Uso de Animales en Investigación Biomédica.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos, salvo que se indique, se realizaron con Microsoft Excel. Los datos se presentan como mediana ± desviación estándar. Para la evaluación de la significación estadística en comparación entre los grupos de todos los
P
valores se obtuvieron a partir de una prueba estadística de dos colas con un intervalo de confianza del 95%.
p
valores & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
FGFR4 mutacional de estado en líneas celulares de cáncer colorrectal y de muestras de tejido
Se investigaron las mutaciones FGFR4. en líneas celulares de cáncer colorrectal y cáncer de muestras que podrían contribuir al anticuerpo reconocimiento por la sobreexpresión o activación. El ARN total se aisló y se cDNA sintetizado por retrotranscripción. cDNA se utilizó como plantilla para determinar la presencia de mutaciones.
En total, encontramos 3 SNPs en el ADNc FGFR4 en líneas celulares de cáncer colorrectal 4 y 20 muestras de cáncer (Tabla 1 y Figura S1). Hemos observado tres mutaciones en el dominio extracelular y transmembrana de FGFR4 en muestras de pacientes. Además de Arg bien caracterizado
388 SNP [9], [15], encontramos V10L localizada en el péptido señal y P136L entre dominios de inmunoglobulina 1 y 2 (Figura S1). Estos dos SNPs se ha informado anteriormente, sin correlación con manifestaciones patológicas [40], [41]. En KM12C y KM12SM células de cáncer colorrectal, se observó la presencia de la Arg
388 SNP, mientras que SW480 y SW48 no contenían este SNP. En 20 muestras de cáncer colorrectal, 60% de los pacientes presentó el polimorfismo Arg
388, mientras que la prevalencia de las otras dos mutaciones era 55% para P136L y 15% para V10L. Estos datos están de acuerdo con los datos publicados anteriormente, donde el 50% de los tumores presentan la Arg
388 SNP, el 53% del P136L polimorfismo y el 30% de los tumores contienen V10L [9].
no se encontró ninguna mutación activadora en FGFR4 o cualquier cambio de nucleótido sobre el previamente reportado para FGFR4. A continuación, estos datos sugieren que el aumento de la expresión de FGFR4 podría ser responsable de la inducción de autoanticuerpos en pacientes con CCR y una mayor invasión y la metástasis en el cáncer de colon.
Adhesión FGFR4 derribo reducido, migración e invasión de Colorectal Cancer Cells
Para estudiar el papel de la sobreexpresión FGFR4 en la tumorigénesis y metástasis, se estudió el efecto de la expresión FGFR4 en SW48, SW480 y líneas celulares de cáncer colorrectal SW620, que no contenía la Arg
388 polimorfismo. células SW480 y SW48 fueron transfectadas de forma estable con cuatro shRNAs dirigidos FGFR4 más un control mezclado shRNA. células SW620 fue silenciada en forma transitoria con siRNA. shRNA#41 mostró la mayor disminución en la expresión FGFR4 proteína (Figura 1A) y los niveles de mRNA (Figura 1B) en ambos tipos de células. shRNA#44 también fue eficaz en la reducción de la expresión de proteínas, en particular en células SW48. niveles de reducción similares se obtuvieron con el silenciamiento de siRNA transitoria en células SW620. Para estudiar el efecto de silenciar FGFR4 en otros miembros de la familia, se llevó a cabo la RT-PCR. los niveles de ARNm de FGFR1, FGFR2, FGFR3 y permanecieron inalteradas tras FGFR4- silenciamiento, lo que confirma la especificidad de FGFR4 (fig. 1B). El análisis de inmunofluorescencia mostró que la expresión FGFR4 se redujo significativamente en SW480 y SW48 después de la transfección con shRNA 41 vectores, aunque se observó algo de tinción residual en el núcleo de las células SW48 (Figura S2).
Cuatro shRNAs dirigidos contra diferentes exones de FGFR4 y un shRNA revueltos se utilizaron para obtener células de cáncer colorrectal transfectadas establemente después de la selección con puromicina. Además, transitoria siRNA FGFR4-silenciamiento se llevó a cabo en células de cáncer colorrectal SW620. A. Análisis de transferencia Western de la expresión de FGFR4 en líneas de células SW480 y SW48 transfectadas de forma estable, y transitoriamente transfectadas las células SW620. Tubulina se utilizó como control de carga. B. análisis de PCR semi-cuantitativa de FGFR1, FGFR2, FGFR3, y la expresión FGFR4 utilizando iniciadores específicos en tres líneas celulares diferentes. GAPDH se utilizó como control. C. La proliferación se determinó mediante ensayos de MTT después de 24 horas de cultivo. La densidad óptica se redujo significativamente por FGFR4 desmontables (*, p & lt; 0,01; **, p & lt; 0,001). D. revueltos y se cultivaron las células silenciadas hasta la confluencia y sus capacidades migratorias se analizaron en un ensayo de cicatrización de la herida cada 24 h hasta confluencia. se muestran imágenes representativas del ensayo de cicatrización de heridas. migración de velocidad (m /h) de las células revueltos y silenciados-FGFR4 se calculó como la distancia recorrida en 96 horas. E. La adhesión celular a Matrigel de las células silenciadas-FGFR4 o revueltos, después de morir de hambre las células durante 5 h en medio solo. F. SW480 y SW48 revueltos células mostraron aproximadamente 2 veces más alta que la invasión shRNA#41 FGFR4 células transfectadas de forma estable. Los datos de todos los experimentos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes.
se muestran los valores de p
de todos los experimentos.
Para evaluar las propiedades oncogénicas, se determinó el crecimiento celular, la adhesión, la migración y la invasión de las células FGFR4 silenciados. El uso de ensayos de MTT, FGFR4-silenciados SW480 o células SW48 mostraron una tasa de proliferación reducida en comparación con las células revueltos (Figura 1C). líneas de células SW480 y SW48 Para investigar el efecto de FGFR4 sobre la migración, silenciados-FGFR4 se sembraron en placas de 24 pocillos y se analizaron mediante ensayos de cicatrización de heridas. células FGFR4 silenciados fueron incapaces de cerrar la herida, incluso después de 96 h (Figura 1D). La migración retardada era más importante para SW48 (3 veces) que SW480 células (2 veces). Estos resultados son similares a los reportados previamente usando dos líneas celulares de CRC diferentes, HCT116 y HT29, y diferentes ensayos [15].
Además, utilizando ensayos de Matrigel, hubo una disminución importante en la capacidad de adhesión y la invasión de las células FGFR4-silenciado en ambas líneas celulares. células SW480 disminuyeron su capacidad de adhesión en 2,5 veces, mientras que las células SW48 mostraron respeto reducción casi 4 veces a las células revueltos (Figura 1E). La invasión fue aproximadamente 2 veces reducida por FGFR4 caída en ambas líneas celulares (Figura 1F). En conjunto, estos datos apoyan un papel importante en la tumorigénesis de FGFR4 y la invasión de cáncer colorrectal, siendo más relevante para las células metastásicas SW48.
FGFR4 silenciamiento redujo la expresión de inductores del fenotipo mesenquimal
Desde la adhesión celular, la migración y la capacidad invasiva de las células epiteliales se asocian a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), decidimos investigar alteraciones en los inductores de la EMT. Después de FGFR4 silenciamiento, se estudiaron los cambios en los niveles de mRNA expresión de Snail 1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, y E-cadherina (CDH1) por PCR en tiempo real o PCR semi-cuantitativa (TGFß1). En SW480 y SW620, FGFR4 caída causó una disminución significativa en los inductores de la EMT TGFß1, SNA1 y TWIST acompañados de un gran aumento en el marcador epitelial CDH1 (Figura 2A, B). células SW48 mostraron una mayor reducción en SNA1, TGFß1 y TWIST1and un aumento menor en CDH1. ZEB1 disminución fue más significativo en SW480 que en las líneas celulares metastásicas SW620 y SW48. marcadores epiteliales y mesenquimales se analizaron a nivel de proteínas por transferencia de western. Caracol y E-cadherina confirmaron los resultados de ARNm. La vimentina, un marcador mesenquimal, se redujo después de FGFR4 silenciamiento en las tres líneas celulares (Figura 2C). Sólo se detectaron cambios menores en la expresión de MT1-MMP en células SW480 y SW48 después FGFR4-silenciamiento. Sin embargo, se observó un gran aumento de la expresión de MT1-MMP en células SW620, que es paralelo a los niveles de expresión de E-cadherina indicativo de una reducción del fenotipo mesenquimal.
A. ADNc sintetizado a partir de ARN total a partir de células de forma estable y transitoriamente con silenciador y de control se sometió a QRT-PCR utilizando cebadores específicos para los inductores de la EMT Snai1, TWIST1, ZEB1 y CDH1, usando GAPDH para la normalización. Los datos representan la media ± SD de dos experimentos. B. El mismo ADNc se sometió a análisis RT-PCR semi-cuantitativa para amplificar TGFß1, usando GAPDH como control. C. SW480 y SW48 revueltos y las células FGFR4 silenciados se lisaron y se sometieron a análisis WB utilizando anticuerpos específicos contra las proteínas indicadas y los marcadores de EMT. La abundancia de cada proteína se cuantificó por densitometría. Tubulina se utilizó como control de carga. D. Análisis de inmunofluorescencia de E-cadherina en las células SW480 y SW48 revueltos y silenciados. DAPI se utilizó para la contratinción del núcleo en azul. E-cadherina tinción estaba en verde.
El aumento de la expresión de E-cadherina, después de FGFR4 desmontables, en las uniones adherentes y contactos célula-célula se confirmó por inmunofluorescencia (Figura 2D). Las diferencias en la expresión de E-cadherina fueron más evidentes en la membrana celular, lo que sugiere que FGFR4 silenciamiento facilitó la expresión de funcional E-cadherina en la superficie celular y de la reversión a un fenotipo epitelial. En conjunto, estos datos usando tres líneas celulares de cáncer colorrectal diferentes confirman que FGFR4 es un efector importante en EMT. FGFR4 knock-down provoca una reducción de caracol y un aumento de la E-cadherina con el consiguiente efecto sobre la adhesión, la migración y la invasión.
Análisis de señalización en las células FGFR4 silenciados. Papel de FGFR4 en la celda Supervivencia
Para determinar el efecto de la actividad FGFR4 de señalización corriente abajo, se analizó el efecto de FGFR4-silenciamiento de las vías de señalización después de la activación con FGF19 ± heparina en comparación con medio libre de suero. Después de FGFR4 caída, la activación de phosphoSRC, phosphoERK1 /2 y phosphoAKT fueron significativamente más bajos en SW480 y SW48 (Figura 3A). ERK1 en particular, mostró una reducción casi completa. En cuanto a AKT, este efecto sugiere un efecto mediado por FGFR4 través de AKT en EMT y la supervivencia celular. Para probar el efecto de FGFR4 en la supervivencia, las células fueron sometidas a la apoptosis inducida por el peróxido de hidrógeno. células FGFR4-silenciado mostraron una disminución significativa de 20 a 30% en la supervivencia en comparación con células codificados después de tratamiento con peróxido de hidrógeno (Figura 3B). Sin tratamiento, revueltos y células de cáncer colorrectal silenciados-FGFR4 SW480 y SW48 mostraron niveles similares de la apoptosis. Este efecto FGFR4 en apoptosis de las células en respuesta al estrés oxidativo puede jugar un papel en el cáncer colorrectal avanzado, facilitando la supervivencia de células de cáncer colorrectal metastásico.
A. Codificados y se mueren de inanición células SW480 y SW48 FGFR4 silenciados, y se incubaron con FGF19, heparina, o FGF19 más heparina durante 30 minutos en DMEM. Luego, las células se lisaron y se sometieron a análisis WB usando anticuerpos específicos contra la AKT fosforilada y total, ERK1 /2 y SRC. Tubulina se utilizó como control de carga. B. Las células se incubaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y antibióticos en presencia o ausencia de H
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2 para 16 horas, y se sometieron a ensayos de detección de apoptosis. Unt., Células no tratadas. Los datos mostraron los resultados de un experimento representativo de tres. C. La invasión a través de Matrigel de las células revueltos y silenciados tratados con inhibidores de MEK1 /2 (UO126), JNK y SRC (PP2) como se indica. Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes.
Para estudiar un efecto sinérgico para mejorar la inhibición FGFR4 en las vías de señalización en la invasión de células, se utilizaron inhibidores específicos de las células específicas y revueltos. UO126 (a MEK1 2 /inhibidor de aguas arriba de ERK1 /2) y PP2 (inhibidor de SRC) reduce la capacidad de invasión de las células SW480 y SW48. Esta reducción fue mucho más pronunciado en revueltos que en las células silenciadas (Figura 3C). El inhibidor de JNK causó un efecto mínimo en la capacidad de invasión de las células SW480 y SW48 revueltos y silenciados. En conjunto, estos resultados indican que FGFR4-caída causó una reducción significativa de SRC y MEK1 /2-ERK1 /invasión en las células SW480 y SW48, similar a la causada por los inhibidores específicos de las células revueltos 2-mediada.
FGFR4 como diana terapéutica en el cáncer colorrectal
Hemos seguido dos estrategias diferentes para demostrar el valor terapéutico de FGFR4 en el cáncer colorrectal. En primer lugar, hemos probado dos inhibidores de la quinasa PD173074 y TKI-258. A continuación, se utilizó células FGFR4-silenciado para estudiar la dependencia de FGFR4 para el crecimiento tumoral en xenoinjertos de ratón. líneas de células metastásicas (SW48 y KM12SM), que expresan más FGFR4, eran más sensibles a los inhibidores químicos que líneas mal o no metastásico de células (KM12C, SW480) (Figura 4A). Multi-quinasa inhibidor de TKI fue más eficaz que pan-FGFR PD inhibidor para reducir la proliferación del cáncer colorrectal de una manera dependiente de la dosis (
valor p
& lt; 0,001), en particular en líneas de células metastásicas. A 80 nM de concentración, la inhibición fue mayor en líneas celulares de cáncer colorrectal metastásico (20% en SW48 y 60% en KM12SM) que en células no metastásicas o las células de control. En las células KM12, la inhibición de TKI fue eficaz hasta una concentración de 1 nM. línea celular HEK293 referencia, que expresa bajos niveles de FGFR4, se inhibió en un grado menor. La inhibición del crecimiento celular se asocia con la inhibición de los reguladores aguas abajo mismos afectados por vías FGFR4 de señalización (Figura 4B). Los efectos más significativos se obtuvieron con TKI-258. Se observó una gran reducción (& gt; 90%) en la activación de SRC, una disminución significativa (50-80%) en phosphoERK1 /2 y una débil reducción en phosphoAKT en ambas líneas celulares (Figura 4B). La disminución en la activación de vías de señalización FGFR4 fue similar a la observada después de FGFR4-silenciamiento, lo que confirma la implicación de FGFR4. Para confirmar la especificidad FGFR4, hemos utilizado anticuerpos anti-FGFR4 comerciales en las células de cáncer colorrectal SW480 y SW48. Se observó una inhibición significativa de la proliferación, dependiente de la dosis, en comparación con las células control (
valor p
& lt; 0,01) (Figura S3). líneas celulares de cáncer colorrectal SW480 y SW48 mostraron inhibición del crecimiento después del tratamiento de anticuerpos, hasta el 75% y el 60% a 400 nM y 40% y 55% a 100 nM, respectivamente.