Extracto
puede obtener su capacidad de invadir y metastatizar por sometidos epitelio-mesenquimal transición ( EMT). La explotación de este mecanismo de plasticidad celular, las células malignas pueden remodelar su citoesqueleto de actina y regular a la baja las proteínas necesarias para los contactos célula-célula. Los mecanismos de reorganización del citoesqueleto que resulta en la morfología mesenquimal y el aumento potencial invasor, son poco conocidos. Actina nucleación forminas han sido implicados como actores clave en la EMT. A continuación, analizamos el que se alteran en forminas escamosas EMT relacionadas con el carcinoma de células. FHOD1, un formin poco estudiada, parecía estar marcadamente upregulated en la EMT. En los tejidos humanos FHOD1 se expresa principalmente en las células mesenquimales, con poca expresión en el epitelio. Sin embargo, las muestras de cáncer de células escamosas orales demostraron sobrerregulación FHOD1 consistentes en las células del mesénquima transformadas en el borde invasivo. Esta regulación al alza se confirmó en un modelo de carcinoma escamoso oral, donde la expresión FHOD1 se incrementó notablemente en la EMT en una forma dependiente de la señalización de PI3K. En las células EMT FHOD1 contribuyó a la morfología y mesenquimales F-actina organización en forma de huso. Además, los ensayos funcionales demostraron que FHOD1 contribuye a la migración celular y la invasión. Finalmente, FHOD1 agotamiento reduce la capacidad de las células de cáncer de EMT para formar invadopodios y para degradar la matriz extracelular. Nuestros resultados indican que FHOD1 participa en cambios en el citoesqueleto de EMT. Además, se muestra que FHOD1 regulación al alza se produce durante celular de cáncer de EMT
in vivo
, lo que indica que FHOD1 puede contribuir a la progresión del tumor
Visto:. Gardberg M, Kaipio K, L Lehtinen, Mikkonen P, Heuser VD, Talvinen K, et al. (2013) FHOD1, un Upregulated Formin en transición epitelio-mesenquimal, participa en la migración celular y la invasión del cáncer. PLoS ONE 8 (9): e74923. doi: 10.1371 /journal.pone.0074923
Editor: Ponto Aspenström, Karolinska Institutet, Suecia |
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: August 7, 2013; Publicado: 26 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gardberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por fondos de la Academia de Finlandia, Finska Läkaresällskapet, Fundación Sigrid Juselius, Fundación K Albin Johansson, La Organizaciones de cáncer de Finlandia y la Universidad de Turku hospital de fondos de investigación. María Gardberg es un Ph.D. estudiante con el apoyo de la Escuela Nacional de Graduados of Clinical Investigation. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El citoesqueleto de actina es una estructura altamente plástico con capacidad de remodelar rápidamente tras muchas señales extra e intracelulares. En la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT), las células epiteliales se disocian sus uniones célula-célula, y la remodelación de su citoesqueleto para formar una célula fusiforme con abundantes fibras de estrés. El hecho de que permite a las células EMT ser móviles es utilizado por cánceres epiteliales para lograr la invasividad. EMT puede ser inducida tanto por factores ambientales, tales como la hipoxia, y por moléculas de señalización extracelular tales como TGF-β. Sobre regulación de factores de transcripción, incluyendo EMT caracol, barra, ZEB1 y ZEB2, conduce a la definición de la EMT-baja regulación de la E-cadherina [1], [2]. Aunque el aumento espectacular de las fibras de actina F y el estrés y la morfología similar a fibroblastos son todas características de la EMT, la actina nucleación que participan en esta remodelación del citoesqueleto han descrito adecuadamente. Actina
forminas están muy conservadas proteínas que son nucleación presente en todos los organismos eucariotas. La 2 (FH2) formin dominio de homología es el elemento clave de forminas. Las regiones que flanquean varían considerablemente entre las proteínas Formin individuales, probablemente, lo que resulta en diferentes funciones celulares y los mecanismos de regulación. Forminas catalizan la nucleación de la actina en el extremo de púas de los filamentos de actina. Durante el alargamiento de los forminas dimerizados permanecen unidos al filamento, protegiendo de este modo que a partir de moléculas de corte [3]. La actividad de forminas está regulada por Rho GTPasas, interruptores moleculares que remodelan el citoesqueleto en diferentes compartimentos celulares, el control conjunto de fibras de estrés, la formación de adhesión focal y el modo de la motilidad en células de cáncer [4], [5].
como moduladores de la organización celular, el movimiento y el desarrollo, forminas son buenos candidatos para la búsqueda de actina organizadores que permiten a los cambios en el citoesqueleto profundos en la EMT. Sin embargo, el papel de forminas en EMT no se conoce en detalle. Mediante el uso de un modelo de EMT oral del cáncer de células escamosas (SCC), se muestra aquí que FHOD1, un formin principalmente expresado mesénquima, es upregulated específicamente durante la EMT. En otros estudios, se muestra que FHOD1 se expresa también
in vivo
en el frente invasivo de SCC y que es necesaria para el mantenimiento de la morfología mesenquimal, la migración y la invasión eficiente.
Materiales y Métodos línea celular
Las líneas celulares
el carcinoma oral de células escamosas (SCC) UT-SCC-43A se derivó de un tumor gingival primaria de un 75 años de edad, de raza caucásica. El tumor fue puesta en escena como T
4 N
1 M
0, y era histológicamente un grado 2 SCC [6]. UT-SCC-43B se derivó de un tumor recurrente del mismo paciente después de la radioterapia y la cirugía. línea celular 43A-SNA se ha generado mediante la transfección de células 43A con ADNc marcado con hemaglutinina de longitud completa del Snail murino. Las tres líneas celulares se han establecido anteriormente, y anteriormente se han encontrado para mostrar los cambios en el programa de diferenciación de células epiteliales a través de diferentes mecanismos de supresión E-cadherina [7]. Antes de la creación de las dos líneas celulares primarias UT-SCC-43a y UT-SCC-43B para la investigación, la aprobación del Comité Conjunto de Ética de la Universidad de Turku y el Hospital de la Universidad de Turku se obtuvo así como el consentimiento por escrito del donante [ ,,,0],7]. La línea de la telomerasa inmortalizado microvascular humano de células del endotelio (TIME) y la línea de células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMEC) fueron una especie de regalo de Maestría Johannes Keuschnigg (Universidad de Turku, Turku, Finlandia; líneas celulares de origen ATCC). Otras líneas celulares se adquirieron de ATCC y mantenidos de acuerdo con las instrucciones del distribuidor.
Transcriptomic datos de microarrays y en tiempo real-PCR
La expresión génica cuantitativa se analizó usando el Illumina HumanHT-12 BeadChip v4 Expresión en el microarray de Finlandia y secuenciación Centre, Centro de Biotecnología de Turku. ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando RNeasy Mini kit (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se procesa para cDNA con el kit de síntesis de ADNc (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos basadas en matrices en líneas celulares se ha cargado a ArrayExpress (número de acceso E-MTAB-1420).
TaqMan QRT-PCR se realizó con un instrumento de Applied Biosystems 7900HT (finlandés de microarrays y secuenciación Centro). Las sondas y cebadores eran de oligómero, Helsinki, Finlandia. La cuantificación se llevó a cabo con el software de gestor de RQ 1,2 utilizando el método de ΔΔCT (Applied Biosystems). Tres muestras replicadas fueron estudiados para la detección de la expresión del ARNm diana y β-actina se usa como control endógeno. Las cantidades se expresaron como una diferencia de n veces en relación con la línea celular UT-SCC-43A. Los resultados se presentan como medias ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando de Student
t-test y
de Pearson coeficiente de correlación, a menos que se indique lo contrario. Gene primers específicos fueron: DIAPH1 (adelante 5'-cagtcaggggcagcattc-3 ', 3'-revertir cactgttcttggacaccttgg-5'), FHOD1 (hacia adelante 5'cctcagctgacacctccag-3 ', 3'-reversa cagcgcaacctgcttctc-5'), FHOD3 (hacia delante 5'-ggccaggttggaaaggtc-3 ', 3'-revertir tctgctgccagtgactcttg-5'), FMNL3 (adelante 5'-ccatcgaggacatcatcaca-3 ', 3'-reversa ccgagagggtctcagtgg-5')
anticuerpos. FHOD1
Un conejo policlonal monoespecífico FHOD1 anticuerpo anti-humano fue producido por el programa Human Protein Atlas (HPA) [8], y actualmente se encuentra a disposición del público (HPA024468, anticuerpos del Atlas, Estocolmo, Suecia). Además de la caracterización de anticuerpos se describe en la sección Resultados. En algunos experimentos, se utilizó otro anticuerpo policlonal FHOD1 (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). La reactividad de los dos anticuerpos fue idéntico en Blot y immunostainings occidental.
Western Blot y el norte de líneas celulares humanas
Las líneas celulares MDA-MB-231 (células de cáncer de mama), WM164 (melanoma células), A431 (células de carcinoma de células escamosas), U138MG (células de glioblastoma), HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana), HMEC (células endoteliales microvasculares dérmicas humanas), tiempo, UT-SCC-43A, UT-SCC-43B y 43A -SNA se cosecharon y se lisaron en tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa. Para cada experimento, las muestras se normalizaron para la concentración de proteínas y cantidades iguales de material en tampón de muestra de Laemmli se sometieron a SDS-PAGE y transferidos a filtros de nitrocelulosa. Para inmunotransferencia del anticuerpo anti-HPA FHOD1 se incubó durante la noche a dilución 1:2000 en BSA /TBS /Tween 0,1%, seguido de anticuerpo secundario [conjugado con HRP porcina anti-conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca)]. Las proteínas unidas se detectaron mediante quimioluminiscencia potenciada. En la competición péptido experimento, el anticuerpo se incubó primero con un exceso molar de 100 veces de proteína de fusión GST-FHOD1 que contiene los epítopos antigénicos de 1 hora, o con GST como control. La carga de proteína fue comprobada por inmunotransferencia con un anticuerpo α-tubulina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Epitelial transdifferentation /mesenquimales se comprobó mediante inmunotransferencia con anti-E-cadherina y anticuerpos anti-cadherina N (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Se realizó un análisis de transferencia Northern como se describe [9]. La secuencia de la sonda incluye la mayor parte del epítopo de anticuerpo (NCBI RefSeq RNA clon GenBank NM_013241.2, bases 1517 a 1810).
La inhibición de la MAPK /ERK y PI3K vías de señalización
UT células SCC-43B se sembraron en medio completo y se cultivaron durante 24 horas antes de medio se reemplazó por medio libre de suero y se incubaron durante la noche. A continuación, las células se incubaron durante 4 días en 10μM MEK U0126 medio inhibidor (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) o inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) en medio con suero al 1% durante U0126 y 10 medio de suero% para células de control LY 294002. fueron tratados con el mismo volumen del vehículo. Después de la incubación, la eficacia de la inhibición de la vía MAPK se comprobó mediante inmunotransferencia como se describe anteriormente con 1:1000 diluciones de anticuerpos policlonales anti-fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (p-ERK 1/2) (Cell Signaling Technology) y policlonal anti-ERK 2 (MAPK 2) de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). la inhibición de PI3K se comprobó mediante inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-fosfo-Akt (Ser473) (p-Akt), monoclonal anti-Akt (pan) (ambos de Señalización Celular Tecnología).
El silenciamiento génico
FHOD1 expresión transitoria fue derribado en MDA-MB-231, el tiempo y las células UT-SCC-43B utilizando
Smart
piscina siRNA (Dharmacon Investigación, Boulder, CA). La no focalización piscina siRNA (Dharmacon) se utilizó como control. Las células fueron transfectadas con 1 Dharmafect (Dharmacon) según las instrucciones del fabricante. FHOD1 niveles fueron examinados en lisados de células 72 horas después de la transfección por inmunotransferencia.
in silico
análisis de transcriptómica
La base de datos GeneSapiens se utilizó para estudiar la expresión de ARNm FHOD1 través de todos los seres humanos tejidos normales [10]. Las muestras incluidas en esta base de datos han sido analizados en la plataforma Affymetrix y debido a únicas verificaciones de normalización y de calidad de datos, perfiles de expresión génica obtenidos de diferentes estudios se pueden combinar para generar una visión general del perfil de expresión en tejidos humanos.
inmunohistoquímica
se recogieron los tejidos normales, fijas y tiñe inmunohistoquímicamente como se describe [9]. La colección de tejidos normales de este estudio fue aprobado por el Comité Conjunto de Ética de la Universidad de Turku y el Hospital de la Universidad de Turku, así como el consentimiento por escrito de los donantes. Las muestras SCC orales embebidos en parafina 10 se recogieron desde el archivo de tejido del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario de Turku con la aprobación del Comité Conjunto de Ética de la Universidad de Turku y el Hospital de la Universidad de Turku. De acuerdo con la legislación finlandesa (Ley sobre el uso de muestras de tejido para la investigación, [11, 20 §]), el permiso para utilizar las muestras recogidas con fines de diagnóstico, se concede por las autoridades institucionales locales en situaciones en las que no se incluye la información del paciente. Por lo tanto, los pacientes no han dado su consentimiento, pero la autorización ha sido concedida por el comité de ética local y el director médico del Hospital de la Universidad de Turku. El anticuerpo HPA FHOD1 se utilizó a una dilución 1:250. tejidos y tipos celulares individuales se evaluaron al anotar la intensidad de la tinción de clasificación de 0 (sin manchas) a +++ (tinción fuerte).
La inmunofluorescencia y cuantificación de F-actina
UT células -SCC-43a y UT-SCC-43B se cultivaron en cubreobjetos de gelatina recubierto, y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 15 min. Las células se permeabilizaron con acetona fría durante 4 min. Después de 30 min en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, se incubaron las células durante 1 h con el anticuerpo FHOD1 (1: 250), seguido de un anticuerpo secundario, Alexa 568-conjugado de cabra anti-conejo (1:500 , Molecular Probes, Eugene, OR, USA). F-actina se visualizó con Alexa 488 faloidina conjugada (Molecular Probes). Los medios de montaje contenían DAPI para la tinción de los núcleos (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Invadopodios se visualizaron por tinción de inmunofluorescencia con anti-1:200 cortactin (Millipore). Se identificaron las células plasmáticas con anti-CD138 mAb (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EE.UU.). Alexa Fluor 568 conjugado de cabra anti-ratón se utilizó como anticuerpo secundario (Molecular Probes). Las células se obtuvieron imágenes con microscopía de inmunofluorescencia o un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocal (Carl Zeiss, 63 × objetivo Plan de Apochromat, Göttingen, Alemania). Se utilizó el software Image J 1.42q (NIH, EE.UU.) en los análisis de imagen. La cuantificación de la F-actina en células UT-SCC-43B se llevó a cabo mediante el análisis de tinción Alexa 488 faloidina conjugada a partir de imágenes confocal de 20 células de cada experimento. La media de intensidades fluorescentes se midieron desde el citoplasma de la célula. La importancia del experimento se calculó utilizando Estudiantes muestras independientes
t-test
.
La cicatrización de heridas y ensayos de invasión
La migración de las células UT-SCC-43B o tratados con FHOD1 no director siRNAs se estudió en gelatina revestido con 24 pocillos de placas. Una herida fue creado por raspado manualmente la monocapa de células con una punta de pipeta de 10 l. Las células se lavaron con PBS, y se añadió medio filtrado. Una imagen de células que migran en la herida fue tomada en intervalos de 10 min durante 24 h. software ImageJ se utilizó para medir el área de la herida a intervalos de 1 h. Las heridas se analizaron mediante análisis repetido mediciones de la varianza (RMANOVA). Momento en que se llevó a cabo como efecto repetido y grupo como efecto fijo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el sistema SAS para Windows, versión 9.2 (SAS Institute Inc, Cary, NC, EE.UU.). El efecto de silenciamiento FHOD1 en la capacidad invasiva de las células UT-SCC-43B se estudió utilizando el sistema de imágenes en tiempo real IncuCyte (Essen BioScience, Ann Arbor, Michigan, EE.UU.). células UT-SCC-43B tratados con FHOD1 siRNA o siRNA no codificante y el control de las células no tratadas se sembraron en placas de 96 pocillos (placa ImageLock, Essen BioScience, MI) recubiertas con factor 50 l 10% de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences) después el cual se permitió que las células se unieran O /N a + 37 ° C. Una herida se rayó a través de cada uno (Fabricante de la herida, Essen BioScience) bien y se retiró el medio de crecimiento. Las células fueron luego cuidadosamente cubiertas con 50 l 25% de Matrigel en medio de crecimiento normal y se incubaron en 37 ° C durante 2-3 horas para permitir la gelificación, después de lo cual 100 l de medio de crecimiento se añadió cuidadosamente a cada pocillo. La tasa de invasión (cierre de la herida a través de la matriz) se controló cada hora con el software de imágenes Incucyte (Essen BioScience) durante 72 horas. eficiencia de la invasión se determinó como porcentaje de la confluencia de la herida relativa en comparación con respectivo control negativo (considerado como 100%).
Medición de la degradación de la matriz extracelular y la cuantificación invadopodios
Para analizar la influencia de la caída FHOD1 en la matriz extracelular (ECM) degradación y invadopodios formación de células UT-SCC-43B, se trataron las células con no codificante siRNA y FHOD1 siRNA como se describe anteriormente y se sembraron en portaobjetos de vidrio de 8 pocillos pre-recubiertas con gelatina marcada con Cy3 según instrucciones del fabricante (QCM gelatina invadopodios Ensayo (rojo), Millipore). Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñó para la microscopía de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-Cortactin o faloidina. La degradación de ECM era visible como focos oscuro desprovisto de fluorescencia. Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio de fluorescencia Olympus BX60 (Olympus microscopios, Essex, Reino Unido). cavidades de degradación producidos por las células se fotografiaron y las zonas de reabsorción por célula (px) se midieron con el software ImageJ. Para cada grupo, se comparó la degradación media de 100 células de ocho pocillos. Para evaluar la formación de invadopodios, se comprobaron las células de protuberancias comet- o en forma de anillo de actina-ricos con tinción positiva Cortactin en la superficie ventral. El porcentaje de células que contienen invadopodios fue contado a partir de 10 campos diferentes en cada grupo. Las diferencias entre grupos se realizarán las pruebas de significación por ANOVA (Tukey post hoc) en ambos experimentos.
Resultados
Regulación transcripcional de forminas durante la EMT asociada al cáncer
Se utilizaron tres modelos líneas celulares para evaluar alteraciones en la expresión formin durante la EMT asociada al cáncer. UT-SCC-43A es una línea celular CCE oral del tumor primario y UT-SCC-43B es una línea desde el mismo tumor recurrente después de la cirugía y la radioterapia. El tumor recurrente ha sido objeto de un EMT espontánea, como se ha demostrado por varios marcadores [7]. La línea celular de tercera, 43A-SNA, se estableció mediante la transfección de células UT-SCC-43A con Caracol para inducir EMT
.
Análisis Transcriptomic reveló que las líneas de células mesenquimales UT-SCC-43B y 43A-SNA tienen 35 hasta reguladas genes (logFC ≥2, p≤0.001) y 153 genes regulados (logFC ≤ -2, p≤0.001) en común (Figura 1 a; listas de genes que se presentan en la Tabla S1). En UT-SCC43B y 43A-SNA, establecidos EMT-marcadores tales como N-cadherina, vimentina y colágenos fueron hasta reguladas (Figura 1 B), mientras que los marcadores epiteliales, tales como E-cadherina, queratinas, integrinas y laminina estaban abajo de forma simultánea reguladas que indica que las alteraciones de transcriptómica son consistentes con la EMT.
A) de microarrays de perfiles transcriptómica de UT-SCC-43A, UT-SCC-43B y 43A-SNA células. Las transcripciones alterado de manera significativa en las células UT-SCC-43B en comparación con las células UT-SCC-43A se indican con el círculo azul y transcripciones alterado en las células 43A-SNA en comparación con UT-SCC-43A se indican con el círculo verde. El número de genes alterados en ambas comparaciones se muestra en la zona de solapamiento. El número de genes regulados se muestra en los genes principales y las reguladas en la parte inferior. B) alteraciones en los niveles de ARNm para epitelial seleccionado (parte superior) y los genes mesenquimales (abajo). genes representados codifican proteínas siguientes: CDH1 = E-cadherina, CLDN3 = 3 Claudín, CLDN 7 = 7 Claudín, KRT5 = 5 Queratina, la queratina KRT6B = 6b, CDH2 = N-cadherina, VIM = vimentina. C) los niveles de ARNm para forminas con alteraciones significativas en ambas células UT-SCC-43B y 43A-SNA que fueron confirmados posteriormente por RT-PCR. D) los niveles de ARNm para forminas confirmados por RT-PCR.
De los 13 miembros de la familia Formin incluido en la matriz (DAAM1, DAAM2, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, FHOD1, FHOD3, FMN1, FMN2, FMNL1, FMNL2, FMNL3, INF2), dos fueron consistentemente hasta regulada y cuatro se redujeron regulado durante la EMT. La sobre regulación más significativa se observó con FHOD1, que se aumentó 2,3 veces en la UT-SCC-43B y de 3,2 en 43A-SNA, en comparación con UT-SCC-43A (Figura 1 C). Las diferencias significativas de la transcripción se verificaron más de QRT-PCR, que demostró la regulación positiva de forminas FHOD1 y FMNL3 y regulación a la baja de FHOD3 y DIAPH1 tanto en células UT-SCC-43B y 43A-SNA (Figura 1 D).
caracterización de FHOD1 humana y su patrón de expresión
Como FHOD1 fue el más formin hasta reguladas en la EMT, decidimos estudiar más a fondo esta proteína mal caracterizado. El perfil de expresión de FHOD1 humana no se conoce, en gran parte debido a la falta de anticuerpos adecuados. Nos aprovechamos de un anticuerpo FHOD1 planteado por el proyecto Human Protein Atlas. En la transferencia Western, el anticuerpo se hizo reaccionar con varias líneas endoteliales y células de cáncer humano. Una sola banda de 145 kDa, que es ligeramente mayor que el predicho 127 kDa, se detectó en todas las líneas celulares ensayadas (Figura S1 A). Una banda similar también fue visto con otro anticuerpo FHOD1. La amplia reactividad está en consonancia con las conclusiones anteriores que demuestra la expresión FHOD1 en la mayoría de las líneas celulares inmortalizadas [11].
A fin de probar la especificidad del anticuerpo HPA, la reactividad fue bloqueada con el fragmento antigénico o GST GST-FHOD1 . Como FHOD1 se considera que es un formin endotelial [12], hemos utilizado lisados a partir de tres líneas de células endoteliales: HMEC, el tiempo y HUVEC. La incubación con el GST-FHOD1-péptido prácticamente abolido la detección de los 145 kDa bandas en todas las líneas celulares (Figura S1 B), mientras que la incubación con GST no tenía ningún efecto. Finalmente, se confirmó la especificidad mediante la transfección de células MDA-MB-231 con pequeño (si) RNA FHOD1 interferir o con el control no director siRNA. Después del tratamiento FHOD1 siRNA, la reactividad de los anticuerpos se redujo significativamente, mientras que la reactividad en las células transfectadas con ARNsi de control no fue afectado (Figura S1 C).
La transcripción FHOD1 en las líneas celulares se analizó por transferencia de Northern. El análisis reveló una única transcripción de 4,0 kb en las cinco líneas celulares, igualando el resultado del análisis de Western blot (Figura S1 D).
Para investigar sistemáticamente qué tejidos y tipos celulares expresan FHOD1, tinción inmunohistoquímica utilizando el HPA anticuerpo FHOD1 se realizó en 26 tejidos humanos diferentes. En casi todas las muestras de las células endoteliales capilares fueron inmunorreactivas, aunque con intensidad de la tinción variable. La tinción más intensa FHOD1 se observó en los pequeños vasos sanguíneos del bazo (Figura 2 A), endometrio (Figura 2 B), ovario (Figura 2 C) y en los vasos peritoneales por debajo del mesotelio. En la mayoría de los tipos de tejidos y células, las células del parénquima demostraron poca o ninguna reactividad FHOD1. Por ejemplo, en el cerebro, ni las células nerviosas ni células gliales expresan FHOD1 (Figura 2 D). Las células endoteliales de los capilares cerebrales, por otra parte, expresaron FHOD1. Un pequeño subconjunto de linfocitos en los ganglios linfáticos (Figura 2 E), el bazo, la médula ósea (Figura 2 F) y la mucosa intestinal (Figura 2 G) tiñe intensamente. En el pulmón, la expresión moderada se observó en los macrófagos alveolares (Figura 2 H). Los resultados del análisis inmunohistoquímico se presentan en la Tabla 1. La tinción subsiguiente con marcadores de linfocitos subtipo específicos reveló que el subconjunto de linfocitos que expresaban FHOD1 consistía en CD138-positivo células plasmáticas (Figuras 2 I y J).
tejidos humanos normales incluidos en parafina se tiñeron con anticuerpos FHOD1. A) En el bazo, las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos muestran intensa inmunorreactividad FHOD1. B) estroma endometrial y las glándulas expresan poco FHOD1. Las células endoteliales en paredes del vaso sanguíneo son teñidas fuertemente (puntas de flecha). C) En el ovario, los ovocitos (o) y las células del folículo (asterisco) expresan poco FHOD1. D) En el cerebro, ni neuronas ni las células gliales muestran tinción FHOD1. Las células endoteliales de los capilares minuto (flechas) mancha débilmente. E) En el ganglio linfático, la mayoría de los linfocitos mancha débilmente. Ocasionales células con tinción fuertemente tienen una morfología de células plasmáticas (puntas de flecha abiertas). F) En la médula ósea, las células eritropoyética no expresan FHOD1. células mielopoyéticas y megacariocitos mancha (M) débilmente. células pequeñas ocasionales que expresan fuertemente FHOD1 (puntas de flecha abiertas) son células plasmáticas. G) En la mucosa del colon, las células epiteliales muestran ser débil tinción FHOD1. células plasmáticas del estroma (puntas de flecha abiertas) expresan FHOD1 fuertemente. H) epitelio alveolar en los pulmones manchas débilmente para FHOD1, mientras que los macrófagos alveolares (MP) muestran tinción moderada FHOD1. I, J) Doble tinción de inmunofluorescencia de células inflamatorias FHOD1-positivos demuestra que las mismas células expresan CD138 (puntas de flecha). La morfología celular y CD138 indican que son células plasmáticas. En A-H barra de escala = 100 micras.
Llegamos a la conclusión de que FHOD1 se expresa en muchos tejidos, pero en tipos de células única restringidas. Es de destacar que todos los tipos de células fuertemente tinción son de origen mesenquimal. Esto coincide con el
in silico
perfil ARNm obtenido a partir de una búsqueda de base de datos GeneSapiens [10] (Figura S2). La expresión ubicua FHOD1 baja en todos los tejidos normales podría ser atribuible a la expresión en las células endoteliales. la expresión más alta se puede ver en los tejidos donde las células del parénquima también se tiñeron en inmunohistoquímica,
es decir.
músculo esquelético, mama y ovario. Aunque el nivel de ARNm en muestras de tejidos mesoteliales es relativamente alta, las células mesoteliales no se tiñen con el anticuerpo FHOD1. Los altos niveles de ARNm se deben probablemente al endotelio abundante en los capilares debajo del mesotelio. En estos vasos, tinción inmunohistoquímica FHOD1 era fuerte.
EMT lleva a la vía PI3K-dependientes FHOD1 la sobrerregulación y morfológicas alteraciones
A pesar de que los resultados inmunohistoquímicos y en
silico
perfil ARNm sugirieron expresión FHOD1 mínimo en tipos de células epiteliales, nuestros resultados transcriptómica y GeneSapiens bioinformática encuesta de carcinomas (no mostrados) indica los niveles de mRNA moderadas en ciertos tipos de cáncer. Por ejemplo, el valor de la expresión normalizada media de adenocarcinoma de pulmón fue de 850, en comparación con 400 en el sistema respiratorio, y el valor de SCC oral fue de 800, en comparación con 100 en la piel normal (valores de mucosa oral no estaban disponibles). Para investigar si la regulación al alza de FHOD1 ocurre en CCE oral clínica, elegimos al azar diez muestras SCC orales para el análisis inmunohistoquímico. Como se cree que se produzca EMT
in vivo
en el borde invasivo de cánceres epiteliales, no se podía utilizar microarrays de tejidos. No encontramos ninguna reactividad en el no neoplásico epitelio escamoso estratificado de la mucosa oral en cualquiera de los casos, mientras que de moderada a fuerte tinción FHOD1 se observó consistentemente en las células SCC invasivos con una morfología en forma de huso mesenquimales (Figura 3 A). Curiosamente, FHOD1 inmunorreactividad era leve o ausente en las zonas bien diferenciadas de cáncer invasivo, lo que indica que la masa tumoral que consta de áreas celulares con diferenciación epitelial expresa poco FHOD1.
A) En normal o estratificado no neoplásico epitelio escamoso, sin FHOD1 se puede detectar (arriba). En los carcinomas de células escamosas invasivo, de moderada a fuerte inmunorreactividad FHOD1 se ve en las células en forma de huso en el frente invasivo que por razones morfológicas han sufrido EMT (parte inferior, más detalles en el recuadro). En la mayor parte del tumor, que se compone de células con una morfología epitelial, solamente inmunorreactividad débil está presente. Barra de escala: 200 micras. B) Western blot de líneas celulares muestran que el epitelio línea celular SCC UT-SCC-43A no expresa detectable FHOD1, mientras que tanto la línea celular EMT espontánea UT-SCC-43B y la línea celular EMT inducida por Caracol 43A-SNA expresan FHOD1. UT-SCC-43A expresa el marcador epitelial E-cadherina, pero no N-cadherina, mientras que UT-SCC43-B y 43A-SNA expresan N-cadherina, pero no la E-cadherina. C) la organización de la actina F de UT-SCC-43A (panel superior) es típicamente epitelial, con teléfonos distintos filamentos y fibras de estrés submembraneous escasos. UT-SCC-43B muestra características de la organización mesenquimales (panel central). contactos célula-célula son pocos, las células son alargadas y contienen fibras lamellopodia, filopodios y el estrés. El inserto (panel inferior) muestra que una fracción de FHOD1 co-localiza con fibras de estrés en células UT-SCC-43B (puntas de flecha). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). D) FHOD1 regulación al alza en células UT-SCC-43B es dependiente de la señalización de PI3K. El tratamiento con MEK U0126 medio inhibidor reduce la fosforilación de ERK 1/2, pero no influye en la expresión FHOD1. Por el contrario, la inhibición de PI3K por LY294992 reduce marcadamente la expresión FHOD1. La reducción de p-Akt indica que la vía se inhibe de manera eficiente.
A continuación, se estudió si la expresión FHOD1 se asocia con alteraciones morfológicas y funcionales en la EMT. De las tres líneas de células SCC orales, detectable FHOD1 se observó en UT-SCC-43B y 43A-SNA, pero no en UT-SCC-43A, lo que indica que también a nivel de proteínas, FHOD1 regulación se produce en EMT tanto en la espontánea y caracol inducida por el modelo (Figura 3 B). Como era de esperar, UT-SCC-43A expresó la E-cadherina, pero no N-cadherina, mientras que UT-SCC-43B y 43A-SNA expresan N-cadherina, pero sin la E-cadherina (Figura 3 B).
La líneas celulares también mostraron características morfológicas distintas y organización del citoesqueleto de actina. células UT-SCC-43A tenían un fenotipo epitelial típica, ya que forman capas de células con contactos célula-célula y las fibras de estrés escasos (Figura 3 C, panel superior). UT-SCC-43B, por otra parte, consistió en células ligeramente alargado con muchos filopodios y fibras de estrés abundantes (Figura 3 C, el panel medio). La distribución de FHOD1 fue en parte punctuate y citoplásmico, pero también claramente localizada subrayar fibras (Figura 3 C, panel inferior).
En SCC oral, vías de señalización activadas comúnmente en EMT incluye el fosfatidilinositol-s- quinasa (PI3K) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK /ERK 1/2) vías [13]. Para investigar si la regulación al alza FHOD1 era dependiente de la activación de cualquiera de estas vías de señalización, las células se trataron con PI3K y /2 inhibidores de MEK1. La inhibición de MEK1 /2 no influyó en la expresión FHOD1, aunque la vía se inhibió de manera eficiente. En contraste, la inhibición de PI3K reduce sustancialmente la expresión FHOD1 (Figura 3 D). Este hallazgo indica que la expresión FHOD1 en UT-SCC-43B es dependiente de la señalización de PI3K.
FHOD1 caída reprime la morfología mesenquimal, la migración y la invasión en células UT-SCC-43B
La importancia funcional de