Extracto
Anfitrión péptidos inmunes, incluyendo catelicidinas, se ha informado que poseen propiedades contra el cáncer. Hemos informado anteriormente de que LL-37, la única catelicidina en los seres humanos, suprime el desarrollo de cáncer de colon. En este estudio, el efecto contra el cáncer potencial de FK-16, un fragmento de LL-37 correspondiente a los residuos 17 a 32, en las células de cáncer de colon cultivadas fue evaluada. FK-16 indujo un patrón único de la muerte celular, caracterizada por la activación simultánea de la apoptosis y la autofagia caspasa-independiente. El primero estaba mediada por la translocación nuclear de AIF y EndoG mientras que la última se caracteriza por una mayor expresión de LC3-I /II, ATG5 y ATG7 y el aumento de formación de autofagosomas LC3-positivo. Desmontables de ATG5 o ATG7 atenuó la citotoxicidad de FK-16, lo que indica la autofagia inducida por FK-16 era pro-muerte en la naturaleza. Mecánica, FK-16 activada por p53 nuclear para regular a la baja upregulate Bax y Bcl-2. Desmontables de p53, la ablación genética de Bax, o la sobreexpresión de Bcl-2 invierte la apoptosis inducida por FK-16 y la autofagia. Es importante destacar que la supresión de la apoptosis dependiente de EndoG FIA /reforzada autofagia FK-16-inducida, mientras que la abolición de la autofagia aumentada FK-16-indujo apoptosis AIF- /EndoG-dependiente. Colectivamente, FK-16 induce la apoptosis independiente de caspasas y la autofagia común a través de la p53-Bcl-2 /Bax cascada en células de cáncer de colon. Nuestro estudio también descubrió regulación recíproca previamente desconocida entre estas dos vías de la muerte celular
Visto:. Ren SX, Shen, J., Cheng ASL, Lu L, Chan RLY, Li ZJ, et al. (2013) FK-16 derivado de la Anticancer péptido LL-37 Induce Apoptosis independiente de caspasas y la autofagia muerte celular en células del cáncer de colon. PLoS ONE 8 (5): e63641. doi: 10.1371 /journal.pone.0063641
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: 4 Abril 2013; Publicado: 20 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Ren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los péptidos antimicrobianos (AMP), también conocido como anfitrión. péptidos de defensa, existen en las células eucariotas como un componente conservada del sistema inmune innato. AMP realizan primera línea de defensa contra la infección, actuando como "antibióticos naturales" por la muerte directa de los microbios patógenos [1], [2]. La selectividad de AMP a las células bacterianas se basa en sus estructuras catiónicos que son cruciales para la interacción con las membranas bacterianas con carga negativa [3], [4]. Nuevas evidencias sugieren que AMP pueden también unirse selectivamente a las células cancerosas a través de las células no transformadas debido a la mayor exposición de la superficie de fosfatidilserina cargada negativamente en el cáncer [5]. Los niveles elevados de mucinas O-glicosilada, potencial de membrana negativo, y una mayor área de fluidez de la membrana y de la superficie celular en las células cancerosas también pueden contribuir a esta selectividad [6]. Numerosos amperios de humano (por ejemplo, β-definsin, LL-37) y no humano (por ejemplo BMAP-28, lactoferricina B, Magainina II, melitina, taquiplesina I) orígenes se han demostrado para ejercer la citotoxicidad en las células cancerosas a través de diversos mecanismos [6 ]. Por ejemplo, lactoferricina bovina B inducida ruta mitocondrial de la apoptosis en la leucemia y las células de carcinoma humano líneas, pero no las células no transformadas a través de la generación de especies reactivas de oxígeno [7]. Magainina II también indujo la muerte celular en células de cáncer de vejiga, pero no los fibroblastos normales a través de la formación de poros en la membrana celular y la posterior lisis celular [8]. β-definsin-1 humano, que exhibió la pérdida específica del cáncer de expresión en el carcinoma renal de células claras, inducida por la apoptosis mediada por la caspasa-3 en la línea celular de cáncer renal SW156 [9]. De acuerdo con la base de datos de AMP (http://aps.unmc.edu/AP/main.php), más de 130 tales péptidos se sabe que tienen propiedades contra el cáncer [10].
Catelicidinas son una familia de conservado evolutivamente amperios. hCAP-18 es el único catelicidina en los seres humanos. Esta preproteína 18-kDa consiste en una secuencia N-terminal de la señal, un dominio de catelina-como, y un dominio de AMP C-terminal. La escisión proteolítica de hCAP-18 libera un 37 residuos, anfipático, péptido helicoidal conocido como LL-37. Este péptido es secretado por células de médula ósea, leucocitos circulantes, y numerosos tipos de tejidos epiteliales, tales como la piel y la mucosa gastrointestinal. LL-37 no sólo exhibe un espectro de actividades antimicrobianas bordo (por ejemplo, bacterias, hongos, y virus), pero también tiene la capacidad de neutralizar lipopolisacáridos bacterianos. Es importante destacar que, LL-37 podría mediar la inmunidad innata a través de la regulación de la quimiotaxis de los leucocitos (por ejemplo neutrófilos, monocitos, células T, eosinófilos y mastocitos) y la producción de citoquinas en sitios de infección y la inflamación, así como la promoción de la re-epitelización durante la cicatrización de la herida [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. evidencia acumulada a partir de estudios de biología tumoral indica que LL-37 juega un papel importante en la carcinogénesis [15]. Por ejemplo, LL-37 ejerce efectos contra el cáncer en el cáncer gástrico y las células leucémicas T [16], [17]. El fragmento C-terminal de LL-37 también exhibe citotoxicidad hacia las células de carcinoma tanto epitheloid orales sensibles a fármacos y resistentes a fármacos [18]. Nuestro estudio anterior también mostró que la expresión de LL-37 se downregulated notablemente en tejidos de cáncer de colon humano, mientras que exógeno LL-37 la muerte celular apoptótica inducida en células de cáncer de colon cultivadas. Es importante destacar que los ratones con deficiencia de catelicidina exhiben una mayor susceptibilidad a la inducida por azoximetano de colon carcinogénesis [19]. Estos hallazgos sugieren que la LL-37 es un péptido supresor de tumores endógena.
Dada su importancia en la inmunología y la investigación del cáncer, los esfuerzos se han propuesto para estudiar las propiedades estructurales y biofísicas de LL-37. Luna
et al.
Describió por primera vez el uso del sistema de fusión de glutatión S-transferasa para la expresión y purificación de marcado isotópicamente LL-37 en
Escherichia bobina
[20]. El análisis estructural por espectroscopia de RMN demostró que el LL-37 se caracteriza por una larga hélice anfipática que abarca los residuos 2-31 con la molécula entera curvado un tren de cadenas laterales hidrofóbicas [21]. Ramamoorthy
et al.
Mostró que LL-37 orienta cerca de la superficie de bicapas de fosfolípidos y forma estructuras oligoméricas [22]. Con este fin, LL-37 posee la capacidad de alterar la membrana celular [23], [24], [25].
El costo asociado con la síntesis química es uno de los factores limitantes que dificultan el uso de péptidos como agentes terapéuticos. Por tanto, es importante identificar la región funcional de LL-37 de manera que fragmentos más cortos que retienen la actividad biológica del péptido de longitud completa se pueden producir con un coste menor. Anterior análisis de estructura-función de los diferentes fragmentos de LL-37 ha demostrado que LL7-27, un péptido de 21 restos derivado de residuos 7-27 de LL-37, muestra una potente actividad contra los microbios (en particular bacterias Gram-positivas) a través de la interrupción de la estructura de bicapa lipídica [26]. Otro estudio mostró que el fragmento N-terminal LL-12 correspondiente a los residuos 1-12 de LL-37 es inactivo contra las bacterias o células cancerosas mientras que FK-16 correspondiente a los residuos 17-32 retiene antibacterianos y antitumorales efectos [27]. Este fragmento tiene incluso una mejor actividad contra procariotas y células nucleadas que el péptido de longitud completa [28], lo que sugiere que FK-16 puede ser un candidato prometedor para una caracterización adicional como un nuevo péptido contra el cáncer. En el presente estudio, el
se investigó in vitro
efecto anticancerígeno en de FK-16.
Resultados
FK-16 frente a LL-37 en la inducción de muerte celular en las células del cáncer de colon
los citotoxicidad de FK-16 y el de larga duración LL-37 fueron investigados inicialmente en dos líneas celulares de cáncer de colon humano (LoVo y HCT116) por ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 1A, tanto FK-16 y LL-37 redujo significativamente la viabilidad de las LoVo y células HCT116 de una manera dependiente de la dosis. Notablemente, FK-16 muestra una mejor actividad contra las células de cáncer de colon que LL-37. Por otra parte, FK-16 tenía un efecto mínimo sobre la viabilidad de las células de la mucosa de colon normal, NCM460 epiteliales humanas. Un péptido de control con la secuencia codificada de FK-16 también tuvo efectos insignificantes sobre LoVo y HCT116, indicando FK-16 mediada por la destrucción selectiva de células cancerosas. Como HCT116 fue más sensible que LoVo a FK-16, HCT116 fue seleccionada para estudio mecanicista posterior y se trató con o bien 20 mM o 40 mM FK-16, en que se produjeron ~ 20% y ~ 50% de citotoxicidad.
(a) Efectos de LL-37, FK-16, y revueltos FK-16 (48 h) en la viabilidad de las células de cáncer de colon (HCT116, LoVo) se determinaron mediante el ensayo de MTT. El efecto citotóxico de FK-16 también se ensayó en células de la mucosa de colon normal, NCM460 epiteliales humanas. (B) externalización fosfotidilserina en las células HCT116 tratadas con o sin FK-16 se determinó por citometría de flujo de células V-manchado /Anexina PI. (C) Efectos de FK-16 en la escisión de PARP y la activación de caspasas en las células HCT116 se determinaron por Western blot. El cisplatino se utilizó como control positivo para la activación de la caspasa. (D) células HCT116-tratamiento Pre con el pan-caspasa inhibidor z-VAD-fmk durante 1 h no a prevenir la pérdida de la viabilidad celular FK-16-inducido tal como se determina mediante el ensayo de MTT (24 h). (E) La expresión nuclear de la FIA y EndoG en las células HCT116 se analizaron por Western blot de las proteínas fraccionadas. GAPDH y Lamin A /C se utilizaron como controles internos para citosólica (Cy) y las proteínas nucleares (NU), respectivamente. (F) Efectos de FK-16 (6 h) en la localización subcelular de AIF (verde) y EndoG (rojo) en HCT116 se determinaron por inmunofluorescencia confocal (400 ×). (G) Derribo de FIA y EndoG parcialmente revertido externalización fosfotidilserina inducida por FK-16 (40 M; 24 h) en HCT116. Las células se expusieron a FK-16 a las 48 h post-transfección de AIF- y EndoG-siRNAs. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *,
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inducción de la apoptosis AIF /EndoG dependiente de FK-16
han demostrado previamente que LL-37 podría inducir apoptosis independiente de caspasas en células de cáncer de colon [19]. Para determinar si la apoptosis mediada por la citotoxicidad de FK-16, la pérdida de la asimetría de la fosfatidilserina, que es una característica de apoptosis, se cuantificó por citometría de yoduro de propidio /anexina V células doble manchado. Como se muestra en la Fig. 1B, FK-16 indujo la externalización de fosfatidilserina sin aumentar la proporción de yoduro de propidio
+ células, lo que indica que FK-16 apoptosis pero la muerte celular no necrótica inducida. En ambos 24 y las 48 horas los puntos de tiempo, el tratamiento FK-16 no aumentó PARP división ni activar las caspasas-3 y 7 (Fig. 1C). Concordantemente, el inhibidor pan-caspasa z-VAD-fmk no pudo invertir la pérdida de la viabilidad celular causada por FK-16 (Fig. 1D). Estos resultados sugirieron que FK-16 induce la apoptosis de una manera independiente de caspasas. FIA y EndoG, localizados originalmente en la mitocondria y translocan en el núcleo tras la activación, son conocidos mediadores de la caspasa-independiente de la apoptosis [29]. Inmunotransferencia utilizando lisados de proteínas fraccionadas demostró que FK-16 aumentó los niveles nucleares de FIA y EndoG (Fig. 1E). Inmunofluorescencia confirmó que AIF y EndoG redistribuidos desde el citosol al núcleo en las células HCT116 tratadas con FK-16 (Fig. 1F). La implicación funcional de FIA y EndoG en la apoptosis inducida por FK-16 fue verificado por experimentos de interferencia de ARN, en el que desmontables de FIA o EndoG atenuada externalización de fosfatidilserina inducida por FK-16 (Fig. 1G). Estos resultados indicaron que, la apoptosis AIF /EndoG-dependiente, pero independiente de caspasas similar a LL-37, FK-16 induce en las células de cáncer de colon.
La inducción de la autofagia muerte celular por FK-16 pero no LL-37
para determinar el efecto de FK-16 en otra vía de la muerte celular independiente de caspasas, a saber, la muerte celular autofágica [30], se analizó la expresión de la proteína LC3 (particularmente LC3-II que se sabe que se correlacionan con la extensión de la autofagia) y otras dos proteínas relacionadas con la autofagia, es decir ATG5 y ATG7. Los resultados mostraron que FK-16 aumentó LC3-I y LC3-II, así como la expresión de proteínas ATG5 y ATG7 (Fig 2A & amp;. 2B). FK-16 también induce la formación de LC3
+ vacuolas autofágicos en HCT116 (Fig. 2C). Tanto la inducción de LC3-I de expresión /II y la formación de LC3
+ vacuolas autofágicas por FK-16 podrían ser bloqueados por 3-metiladenina, una clase III phosphoinositide inhibidor de 3-quinasa. Por el contrario, el LL-37 péptido de longitud completa tuvo un efecto mínimo en LC3-I de expresión /II (datos no mostrados). El análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica reveló que un 48 h-exposición a FK-16 vacuolización masiva inducida en células HCT116, en el que se observaron laminares y estructuras de mielina como se asemeja a vacuolas autofágicas finales (Fig. 2D). La formación de orgánulos vesiculares ácidos, que es un sello distintivo importante de la autofagia, también se mejoró por FK-16, determinada por tinción vital de las células HCT116 con naranja de acridina, un tinte que emite fluorescencia de color rojo brillante en vesículas ácidas pero emite fluorescencia verde en el citoplasma y el núcleo (Fig. 2E). La formación de autolisosomas también se incrementó en las células tratadas con FK-16 como visualizaron por tinción monodansylcadaverine (datos no mostrados). El aumento en el flujo autophagic causada por FK-16 se confirmó mediante el tratamiento de las células HCT116 con FK-16 y bafilomicina A
1 (un agente lysosomotropic), solo o en combinación. La inhibición de la función lisosomal por bafilomycin A
1 aumentó los niveles tanto de LC3-I y -II inducida por FK-16 (Fig. 2F), lo que sugiere que FK-16 aumentó flujo autofagia. Dependiendo del contexto celular, la autofagia puede servir como un pro-muerte o mecanismo de pro-supervivencia. Para determinar el papel funcional de la autofagia inducida por FK-16, se utilizó un enfoque de interferencia de ARN para suprimir la autofagia por la orientación ATG5 y ATG7, ambos de los cuales son necesarios para la formación de autofagosomas en la primera etapa. Desmontables de ATG5 o ATG7 redujo significativamente el efecto citotóxico de FK-16 (Fig. 2G), lo que sugiere que FK-16 induce la muerte celular autofágica en células de cáncer de colon.
Células HCT116
(A) mostró aumento de la expresión de proteínas de LC3-I /II después del tratamiento con FK-16 durante 24 hy 48 h. expresión inducida por LC3 FK-16 se suprimió por el inhibidor de la autofagia 3-MA (5 mM, 1 h antes del tratamiento). (B) FK-16 también indujo la expresión de proteínas ATG5 y ATG7. (C) HCT116 tratamiento con FK-16 durante 24 h o 48 h destacada mejora la formación de vacuolas autofágicas como se determina por tinción de inmunofluorescencia para LC3 (400 ×). La formación de LC3
autofagosomas + inducidos por FK-16 fue bloqueada por 3-MA. análisis (D) ultraestructural mediante microscopía electrónica reveló la formación de autophagosome o lisosomas secundarios con el material digerido residual en las células HCT116 tratadas con FK-16 (40 M; 48 h). (E) La acumulación de orgánulos vesiculares ácidos, que emite fluorescencia de color rojo brillante, inducida por FK-16 (40 M) se visualizó mediante tinción con naranja de acridina (400 ×). (F) El aumento de flujo de autofagia fue confirmado por las células HCT116 co-tratamiento con FK-16 y bafilomycin A
1. El tratamiento con bafilomycin A
1 (10 nmol /L) no impidió que la regulación al alza de LC3-I /II en las células incubadas con el FK-16 (40 M). (G) Desmontables de ATG5 o ATG7 atenúa el efecto citotóxico del tratamiento de 48 h de FK-16 (40 M) en HCT116. Los datos se presentan como medias ± S.D. de tres experimentos separados. *,
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& lt; 0,01 significativamente diferente del grupo de control respectivo.
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. & Lt; 0,01 significativamente diferente del control de siRNA células transfectadas tratadas con FK-16
Exigencia de p53 inducida por apoptosis-FK-16 y autophagic muerte celular
La proteína supresora tumoral p53 se conoce a participar tanto en la caspasa-dependiente y la muerte celular -independiente, incluyendo FIA /Endo-dependiente de la apoptosis y la autofagia [31], [32]. Aquí, hemos demostrado que FK-16 activa directamente p53 para mediar en ambas vías de la muerte celular. Como se muestra en la Fig. 3A, FK-16 aumentó el nivel nuclear de p53 y regula positivamente la expresión de PUMA y Bax. Consistentemente, FK-16 redujo la expresión de Bcl-2. Para dilucidar la implicación funcional de p53 en AIF /Endo-dependiente de la apoptosis y muerte celular por autofagia provocada por FK-16, p53 fue derribado por siRNA. Desmontables de p53 no sólo restaura la expresión de Bax y Bcl-2, pero también inducida por FK-16 notablemente reducida LC3-I /II, la expresión ATG5 y ATG7 así como la expresión nuclear de AIF y EndoG, lo que sugiere que p53 era un común activador de ambas vías de la muerte celular (Fig. 3B). Por consiguiente, desmontables de p53 redujo externalización fosfatidilserina (Fig. 3C), la formación de LC3
+ vacuola autophagic (Fig. 3D) y la pérdida de la viabilidad celular (Fig. 3E) inducida por FK-16.
(a) las células HCT116 se incubaron con FK-16 durante 24 h o 48 h. Citosólica y nuclear p53 y la expresión total de Bcl-2 miembros (PUMA, Bcl-2, Bax y Bak) se determinaron por Western blot. GAPDH y Lamin A /C se utilizaron como controles internos para las proteínas citosólicas y nucleares, respectivamente. (B) Derribo de p53 invierte la regulación positiva de factores pro-autofágicos (ATG5 y ATG7) y los factores pro-apoptóticos (Bax, Bak, FIA nuclear y ENDOG nuclear), así como regulación por disminución de Bcl-2 por FK-16. (C) FK-16 no pudo externalización fosfotidilserina inducida en las células HCT116 p53-agotado. Después de la transfección con control- o p53-siRNA durante 48 h, las células fueron tratadas con o sin FK-16 (40 M) durante otras 24 h, seguido de yoduro de propidio /anexina V-tinción doble. (D) Desmontables de 53 redujo notablemente el número de LC3
+ vacuolas autofágicas en las células tratadas con FK-16 (40 M; 48 h) como se determina por inmunofluorescencia confocal (400 ×). Los núcleos (azul) se tiñeron con DAPI. (E) Desmontables de p53 invierte parcialmente el efecto inhibidor de FK-16 sobre la viabilidad celular en HCT116 como se determina mediante el ensayo de MTT. Los datos se presentan como medias ± S.D. de tres experimentos separados. *,
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& lt; 0,01 significativamente diferente del grupo de control respectivo.
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p Hotel & lt; 0,01 significativamente diferente del control de siRNA células transfectadas tratadas con FK-16
alteraciones en la expresión de Bcl-2 y Bax durante FK-. 16 inducida por apoptosis y la muerte celular autofágica
Dado que la familia Bcl-2 se ha informado para regular tanto la apoptosis independiente de caspasas y la autofagia en otros contextos biológicos [30], [32], el próximo cuestionó si FK- muerte de las células del cáncer de colon inducida por 16 fue mediada a través de Bcl-2 y Bax, ambos de los cuales eran aguas abajo de p53 (Fig. 3B). Los resultados mostraron que la restauración de Bcl-2 expresión por transfección con Bcl-2 de codificación de plásmido o ablación genética de Bax usando Bax
- /- células HCT116 abolieron expresión inducida por FK-16 de LC3-I /II, ATG5 y ATG7 así como la expresión nuclear de AIF y EndoG (Fig 4A & amp;. B), lo que sugiere que la regulación por disminución de Bcl-2 y la regulación positiva de Bax se requiere para la autofagia inducida por FK-16 y la señalización de apoptosis. En línea con estos descubrimientos, la restauración de Bcl-2 expresión o la ablación genética de Bax reduce la formación de LC3
+ vacuola autophagic (Fig. 4C) y la pérdida de la viabilidad celular (Fig. 4D) inducida por FK-16. Estos hallazgos indican que FK-16 actuaba a través de la vía de p53-Bcl-2 /Bax para inducir simultáneamente AIF /EndoG dependiente de la apoptosis y la muerte celular autofagia mediada.
Restauración
(A) de Bcl-2 expresión de transfección con Bcl-2-plásmido que codifica invierte la regulación por incremento de pro-autophagic (ATG5, ATG7 y LC3-I /II) y pro-apoptóticos (AIF nuclear y EndoG nuclear) factores inducida por FK-16 (40 M; 48 h) en HCT116. (B) la ablación genética de Bax (Bax KO) en HCT116 revirtió las señales de apoptosis y la autofagia inducida por FK-16. Bax
+/- HCT116 tratados con o sin FK-16 se utilizó como control. (C) Restauración de la Bcl-2 expresión o la ablación genética de Bax en HCT116 suprimió la formación de LC3
+ vacuolas autofágicas inducidos por FK-16 (40 M; 48 h) como se determina por inmunofluorescencia confocal (400 ×). (D) Restauración de Bcl-2 expresión o la ablación genética de Bax invierte parcialmente el efecto inhibidor de FK-16 sobre la viabilidad celular en HCT116 como se determina mediante el ensayo de MTT. Los datos se presentan como medias ± S.D. de tres experimentos separados. *,
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& lt; 0,01 significativamente diferente del grupo de control respectivo.
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p Hotel & lt; 0,01 significativamente diferente de vacío vector transfectadas o Bax
+/- células tratadas con el FK-16
regulación recíproca entre. la apoptosis independiente de caspasas y la autofagia muerte celular
Para dilucidar la diafonía de potencial entre la muerte celular por autofagia y apoptosis AIF /EndoG-dependiente en la acción de FK-16, estos dos procesos celulares fueron abolidas por la interferencia de ARN. Las eficacias de derribo de Atg5-, Atg7-, AIF- y ENDOG-siRNAs fueron confirmados por Western blot (Fig. 5A). La inhibición de la autofagia por Atg5- o ATG7-siRNA aumenta sustancialmente la expresión nuclear de la FIA y EndoG inducida por FK-16 (Fig. 5B). Concordantemente, desmontables de ATG5 o ATG7 también mejoró FK-16 inducida por fosfatidilserina externalización (Fig. 5C), lo que sugiere que la inhibición de la autofagia intensificó la apoptosis inducida por AIF FK-16 /EndoG-dependiente. Recíprocamente, la supresión de la apoptosis AIF /EndoG dependiente por AIF- o EndoG-siRNA expresión mejorada ATG5 y ATG7 inducida por FK-16 (Fig. 5D), indicando que la inhibición de la apoptosis AIF /EndoG dependiente magnifica la señal autophagic en FK- células de cáncer de colon 16-tratar. Concordantemente, AIF- y EndoG-siRNAs mejoran la expresión de LC3-I /II. Estos resultados indican la existencia de una regulación recíproca no declarada entre la muerte celular por autofagia y apoptosis AIF /EndoG-dependiente.
(A) Las eficacias de derribo de AIF-, EndoG-, Atg5- y ATG7-siRNAs fueron confirmados por regulación a la baja de los niveles de proteína de los objetivos respectivos en HCT116. (B) Derribo de ATG5 o ATG7 mejorado basal y FK-16 inducida (40 M; 6 h) la expresión nuclear de la FIA y EndoG. inducida por FK-16 (C) Derribo de ATG5 o ATG7 aumentó (40 M; 48 h) fosfotidilserina exteriorización determinada por tinción con anexina V y citometría de flujo. (D) Derribo de FIA o EndoG basal mejorada y FK-16-inducida (40 M; 48 h) y ATG5 ATG7 expresión de la proteína. (E) Derribo de ATG5 o ATG7 abolida mientras que Desmontables de FIA o EndoG mejorada FK-16 inducida (40 M; 48 h) LC3-I de la expresión /II en HCT116. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Discusión
La inducción de la apoptosis en las células tumorales ha sido reconocida como un enfoque fundamental para la terapia del cáncer [33]. Sin embargo, la resistencia intrínseca de algunas células tumorales a la apoptosis y el rápido recrecimiento del tumor después de la respuesta inicial a los agentes quimioterapéuticos siguen siendo los principales acertijos clínicos. Por lo tanto, hay un interés creciente en la comunidad científica en el estudio de la gama completa de la muerte celular independiente de caspasas y la identificación de agentes que actúan principalmente a través del mecanismo de la caspasa-independiente. En el presente estudio, hemos demostrado que el tratamiento con el péptido contra el cáncer FK-16 redujo fuertemente la viabilidad de las células de cáncer de colon en ausencia de la activación de caspasas o permeabilización de la membrana, lo que sugiere que ni la apoptosis ni necrosis clásica dependiente de caspasa fue el responsable de su citotoxicidad . Con este fin, las células expuestas características bioquímicas y morfológicas consistentes con AIF /apoptosis EndoG dependiente y la muerte celular autofágica FK-16-tratada. Por encima de todo, desmontables de genes centrales de estos dos procesos celulares atenúa la citotoxicidad de FK-16. Estos hallazgos sugieren que FK-16 es un activador de modo dual de la muerte celular independiente de caspasas. Sin embargo, también vale la pena notar que en algunos parámetros experimentales (Figura 1G & amp;. 3C), FK-16 modestamente aumento de la tinción de yoduro de propidio. Esta observación podría explicarse por el estrés celular aumentada asociada con siRNA transfección, lo que podría hacer que las células sean más susceptibles a los efectos de la membrana de alteración de FK-16.
Una serie de tensiones celulares, incluyendo daño en el ADN y oncogén activación, se ha demostrado que activar p53. Dependiendo del estímulo inicial y el contexto celular, la activación de p53 podría desencadenar un repertorio de respuestas, incluyendo la detención del ciclo celular, apoptosis, la senescencia celular, la diferenciación y la autofagia [34]. Dado que la pérdida de expresión de p53 es común en los cánceres humanos, la restauración de la actividad de p53 es un enfoque atractivo para la terapia del cáncer. A este respecto, se han identificado un número de agentes anticancerosos experimentales p53 restauración (por ejemplo CP-31398 y Nutlin) [35]. Aquí nos muestran que el FK-16 es un nuevo activador de la señalización de p53. FK-16 no sólo aumentó la acumulación de p53 nuclear, sino que también induce la expresión de PUMA y Bax, ambos de los cuales son conocidos transcripcional objetivos de p53 [36], [37]. Desmontables de p53 también revirtió la apoptosis inducida por FIA-FK-16 /EndoG-dependiente y la muerte celular por autofagia. Por otra parte, el efecto pro-apoptóticos y pro-autofagia de FK-16 requiere la regulación positiva de p53 dependiente de Bax y la regulación a la baja de Bcl-2. En líneas con estos hallazgos, se ha informado de las funciones centrales de la p53 Bax /Bcl-2 en cascada de la apoptosis y la autofagia dependiente EndoG FIA /. Por ejemplo, un análogo de la ciclofosfamida droga que daña el ADN y un importante polifenol del té verde se ha demostrado para activar p53 y Bax para desencadenar reubicación nuclear de AIF y EndoG para mediar la apoptosis en células tumorales [32], [38]. p53 como un factor de transcripción también estimula la autofagia través de la inducción de múltiples genes pro-autofágicos, incluyendo
DRAM
,
SKP2
,
SESN2
, y
ULK1 /2
, además de
PUMA
y
BAX
[30]. Por otra parte, la activación de p53 podría promover la disociación del complejo Bcl-2-Beclin-1 y por lo tanto desinhibir Beclin-1 dependiente de la autofagia [39].
Un hallazgo interesante que emerge de este trabajo es el descubrimiento de una recíproca mecanismo de regulación entre las dos vías de la muerte celular independiente de caspasas. Nuestros datos indican que la abolición de la apoptosis AIF /EndoG dependiente aumenta la muerte celular autofágica y viceversa, lo que indica que estas dos vías median la citotoxicidad de FK-16 de una manera cooperativa. Aunque la autofagia inducida por FK-16 se encuentra para ser pro-muerte en la naturaleza, el bloqueo de la autofagia, paradójicamente, induce la apoptosis independiente de caspasas en las células tratadas-FK-16. Una explicación a este dilema es que el bloqueo de la autofagia inducida por FK-16 previene la muerte celular, pero todavía activa la apoptosis independiente de caspasas de una manera compensatoria y el resultado neto es la preservación de la viabilidad celular en comparación con células en las que ambas vías de la muerte celular son activado. Con este fin, la contribución directa de la autofagia a la muerte celular se ha informado ampliamente a pesar de las recientes disputas sobre la existencia real de la "muerte celular por autofagia" [40], [41], [42], [43]. Si bien co-activación de la autofagia y la caspasa-independiente apoptosis se ha documentado en varios contextos biológicos [44], [45], [46], sólo hay estudios esporádicos en la literatura que han tratado de dilucidar la relación entre estos dos procesos. De acuerdo con nuestros hallazgos, Zheng
et al.
Y Eimer
et al. Hola, ha encontrado que la autofagia podría proteger contra la apoptosis independiente de caspasas en Hoechst 33342 tratados con células HeLa y células de glioblastoma tratados con erlotinib, respectivamente [47], [48]. La inhibición de la autofagia por 3-metiladenina también acelera rottlerin inducida por apoptosis independiente de caspasas en células de fibrosarcoma humano HT1080 [49].
Identificación de péptidos contra el cáncer de la base de datos existente AMP es un enfoque eficaz para el desarrollo de cáncer de novela terapéutica. En este estudio, FK-16, un fragmento de LL-37, presenta una mejor actividad contra el cáncer que el péptido de longitud completa. FK-16 también se acopla a una vía de muerte celular adicional, a saber, la muerte celular por autofagia. La longitud acortada de FK-16 también puede reducir el costo de producción asociados con la síntesis de péptidos. En su conjunto, el péptido contra el cáncer FK-16 induce AIF /EndoG dependiente de la apoptosis y la muerte celular a través de la autofagia común p53-Bax /Bcl-2 en cascada en las células de cáncer de colon (Fig. 6). Nuestros datos también desvela una nueva regulación recíproca entre estas dos vías de la muerte celular independiente de caspasas.
Materiales y Métodos
Péptidos
El LL-37 sintético (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES ), FK-16 (FKRIVQRIKDFLRNLV) y revueltos (DQVLRFRNFRIKLVKI) péptidos con una pureza & gt; 16 FK-. 95% fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.)
Cultivo de células y la viabilidad celular Ensayo
el cáncer de colon HCT116 líneas celulares humanas y LoVo se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Bax
- /- y Bax
+/- HCT116 células fueron generados por la orientación de genes [50] y proporcionados por el profesor Bert Vogelstein (Ludwig Center en la Universidad Johns Hopkins). La línea de células epiteliales de la mucosa del colon humano hormal NCM460 fue adquirido de incell Corporation. Las células se mantuvieron en sus respectivos medios de cultivo recomendado, suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 U /ml, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire . La viabilidad celular se midió mediante MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro] ensayo. En resumen, se sembraron 5000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Después del tratamiento, se añadió solución de MTT disuelto en el medio de cultivo a la concentración final de 0,5 mmol /L a cada pocillo y las placas se incubaron durante otras 4 h. a continuación, se añadió sulfóxido de dimetilo para solubilizar cristal de tetrazolio MTT. Por último, se determinó la densidad óptica a 570 nm usando un lector de microplacas Benchmark Plus (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.).
La cuantificación de células fosfatidilserina Exteriorización
Para la medición de la externalización de fosfatidilserina, tratado se resuspendieron en tampón que contenía yoduro de propidio y la anexina V isotiocianato de fluoresceína (Invitrogen, EE.UU.) tinción. Después de la incubación durante 15 minutos en celdas oscuras, doblemente marcadas se analizaron mediante el programa System FACSCalibur y CellQuest.
extracción de proteínas nucleares y Western Blot
Se realizó el aislamiento de proteínas nucleares y citosólicas usando NucBuster Kit Protein Extraction (EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el aislamiento de proteínas de células enteras, se recogieron las células en tampón de radioinmunoprecipitación que contiene inhibidores de proteinasas y fosfatasas.