Extracto
Hemos demostrado recientemente que el FKBP5 inmunofilinas (también conocido como FKBP51) es una proteína de andamiaje que puede mejorar PHLPP -AKT interacción y facilitar la desfosforilación mediada por PHLPP de Akt Ser473, regulando negativamente la activación de Akt
in vitro
. Por lo tanto, FKBP5 podría funcionar como un supresor de tumor, y niveles de FKBP5 afectaría respuesta de las células a la quimioterapia. En el presente estudio, hemos dado un paso adelante mediante el uso de un xenotrasplante de cáncer ratones modelo de páncreas para demostrar que la regulación negativa de FKBP5 en ratones de xenoinjerto shFKBP5 promueve el crecimiento tumoral y la resistencia a la gemcitabina, un fenómeno consistente con nuestros resultados anteriores en líneas de células pancreáticas. Además, también hemos encontrado que los inhibidores de la orientación de la vía Akt, incluyendo inhibidor de PI3K, Akt inhibidor y mTOR inhibidor tenía un efecto diferente en la sensibilización a la gemcitabina y otros agentes quimioterapéuticos en las líneas celulares, con un inhibidor de Akt específica, triciribina, que tiene la mayor sensibilización efecto. A continuación, prueba la hipótesis de que la adición de triciribina puede sensibilizar el tratamiento con gemcitabina, especialmente en ratones de xenoinjerto de cáncer de páncreas shFKBP5. Se encontró que el tratamiento de combinación con gemcitabina y triciribina tiene un mejor efecto sobre la inhibición de tumores que cualquiera de los fármacos (p & lt; 0,005) y que el efecto de inhibición es más significativa en ratones de xenoinjerto shFKBP5 que los ratones WT (P & lt; 0,05). Estos efectos se correlacionan con el nivel de Akt 473 fosforilación, así como la tasa de proliferación, tal como se indica por la tinción de Ki67 en los tejidos tumorales de xenoinjerto. Estos resultados proporcionan evidencia en apoyo de futuros ensayos clínicos diseñados para adaptar el tratamiento en base a nuestras observaciones
Visto:. Hou J, L Wang (2012) FKBP5 como un biomarcador de selección para los inhibidores de gemcitabina y Akt en el tratamiento del cáncer pancreático . PLoS ONE 7 (5): e36252. doi: 10.1371 /journal.pone.0036252
Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Alemania |
Recibido: 28 Octubre, 2011; Aceptado: 3 Abril de 2012; Publicado: 9 Mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Hou, Wang. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio con el apoyo de los Institutos nacionales de Salud de Estados Unidos otorga K22 CA130828, R01 CA138461, CA102701 P50 y U19 GM61388 (La Red de Investigación Farmacogenómica). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
análogos de citidina como gemcitabina son ampliamente utilizados para tratar una variedad de cánceres. Gemcitabina sigue siendo la terapia estándar para el cáncer de páncreas en el adyuvante y la configuración paliativos [1], [2], [3]. Sin embargo, la tasa de respuesta gemcitabina es muy baja en el cáncer de páncreas, sólo con una tasa de supervivencia a 1 año 18% [4]. Esta tasa de supervivencia pobre es principalmente debido a la falta de la detección temprana y la metástasis frecuente de los tumores primarios en los ganglios linfáticos y órganos circundantes, tales como el hígado y el estómago [5], [6], [7]. Como un paso hacia el tratamiento con gemcitabina individualizada con el fin de lograr mejores resultados, se realizó previamente un estudio de asociación amplia del genoma utilizando 197 líneas celulares linfoblásticas individuales [8], [9] y ha identificado una proteína, FKBP5, que mostró un efecto significativo sobre la respuesta de gemcitabina en las células tumorales, regulando negativamente la fosforilación de Akt en la serina 473 [10], [11]. La fosforilación de Akt activa la vía de Akt, que desempeña un papel crítico en la tumorigénesis y la quimiorresistencia [12], [13], [14], [15]. Por lo tanto, una baja expresión FKBP5 hace que las células tumorales resistentes a muchos agentes quimioterapéuticos, incluyendo gemcitabina [8]. Además, la expresión FKBP5 es baja o perdido en muchas líneas celulares de cáncer de páncreas y muestras de pacientes de cáncer de páncreas, que se correlaciona con aumento de la fosforilación Akt Ser473 [10].
Estos resultados sugieren que FKBP5 podría ser un supresor de tumores y que los niveles de FKBP5 podría determinar la respuesta de los pacientes a la quimioterapia. Si eso es correcto, los pacientes con niveles bajos de FKBP5 y la hiperactivación Akt podrían beneficiarse de la adición de inhibidores dirigidos a la vía de Akt. En el presente estudio, hemos probado esta hipótesis mediante el uso de un modelo de xenoinjerto FKBP5 caída cáncer de páncreas del ratón (shFKBP5) y los resultados de estos experimentos pueden formar una base para futuros estudios de traducción clínicos. Se encontró que los ratones de xenoinjerto shFKBP5 mostraron un aumento significativo en la carga tumoral en comparación con wtFKBP5, y que estos tumores eran más resistentes al tratamiento con gemcitabina. Mientras tanto en ratones WT y xenoinjertos shFKBP5 fueron capaces de beneficiarse de la terapia de combinación con gemcitabina y el inhibidor de Akt, triciribina (TCN), los ratones mostraron shFKBP5 un mayor efecto después del tratamiento de combinación.
Materiales y Métodos
líneas celulares
Las líneas celulares de cáncer de páncreas humano SU86, AsPC1, y BxPC3 fueron regalos de Dr. Daniel D. Billadeau, Clínica Mayo. líneas de mama humanos de células de cáncer HS578T (HTB-126 ™) y MCF7 (HTB-22 ™) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las líneas celulares de cáncer de páncreas se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%, y se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C. Las células de cáncer de mama humano se cultivaron con DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% bajo las condiciones descritas anteriormente.
Plásmidos y ARN de interferencia corto
El FKBP5 shRNA y siRNA usadas en los estudios derribar fueron adquiridos de QIAGEN Inc. (Valencia, CA). . La transfección se realizó dos veces, 24 horas de diferencia, con 200 nM siRNA usando el reactivo Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante
secuencias para shRNA contra FKBP5 fueron:
Primera FKBP5 shRNA
cadena de sentido:. GGG UAA ACA ACG GAU UGA UdTdT
cadena antisentido:... AAU agosto CUC CUG UUU ACC CdGdT
En segundo lugar FKBP5 shRNA
cadena de sentido:. AAU AUC CCU CUC CUU UCC GdTdT
cadena antisentido:. CGG AAA GGA GAG GGA UAU UdGdT
Tanto dúplex FKBP5 shRNA fueron clonados en vectores pSUPER, y agrupado para la transfección. La línea celular de empaquetamiento 293T estaba infectado con retrovirus pSuper-shRNA [16]. El medio se cambió 24 horas más tarde y se recogió 48 o 72 horas después de la transfección. El medio se filtró a través de filtros estériles (filtro de 0,45-M) y se utilizó para infectar células SU86. se seleccionaron las células infectadas con 2 mg /ml de puromicina (Sigma-Aldrich). . Dieciséis puromicina colonias resistentes que fueron verificados por RT-PCR fueron reunidas después y transfectantes estables se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 2 mg /ml de puromicina
secuencias para siRNA contra FKBP5 fueron:
cadena de sentido:. GGG UAA ACA ACG GAU UGA UdTdT
cadena antisentido: Aug CUC CUG AAU UUU ACC CdGdT
Las secuencias de siRNA de control negativo fueron:.
cadena de sentido:. NVND UCC GAA UGE GUC ACG UdTdT
cadena antisentido: ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT
Drogas y celular Ensayos de proliferación
La gemcitabina fue proporcionado por Eli Lilly (Indianapolis, IN). Triciribina (TCN), rapamicina y LY 294002 se adquirieron de EMD Biosciences (San Diego, CA). El etopósido y paclitaxel se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los ensayos de citotoxicidad con las líneas de células tumorales se realizaron con el CellTiter 96® acuosa celular no radiactivo Ensayo de proliferación (Promega Corporation, Madison, WI) tal como se describe anteriormente [17]. La citotoxicidad se evaluó mediante el trazado de la supervivencia celular frente a la concentración de drogas (en una escala log). El fenotipo IC50 (dosis eficaz que mata 50% de las células) se calculó usando un modelo logístico de cuatro parámetros y se utilizó para la comparación estadística entre los diferentes tratamientos.
Los efectos inhibidores de crecimiento de gemcitabina, etopósido y paclitaxel como así como los efectos del tratamiento de combinación con TCN, la rapamicina y LY 294002 en BxPC3, AsPC1, SU86, MCF7 y células Hs578T también se determinaron utilizando el ensayo de MTS. Los resultados reportados representan los promedios de tres repeticiones independientes.
transfección transitoria y ARN de interferencia
BxPC3 humano y líneas celulares de cáncer de páncreas AsPC1, así como el cáncer de mama MCF7 y HS578T líneas celulares se utilizaron para llevar a cabo la estudios de siRNA. El reactivo de transfección Hiperfect (QIAGEN) se utilizó para la transfección siRNA inversa. Específicamente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se mezclaron con siRNA-complejo, que consiste en 10 nM de control específico o negativo siRNA (QIAGEN) y 0,1 l de lipofectamina ™ reactivo RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA).
cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa PCR
ARN total fue aislado de las células cultivadas con el kit Qiagen RNeasy (QIAGEN Inc. Valencia, CA), seguido de QRT-PCR realizada con la 1-paso, Brilliant SYBR Green QRT-PCR kit mezcla maestra (Stratagene, La Jolla, CA). Específicamente, los cebadores adquiridos de Qiagen fueron utilizados para realizar QRT-PCR usando el sistema de detección ™ Real-Time PCR Stratagene Mx3005P (Stratagene). Todos los experimentos se realizaron por triplicado con β-actina como control interno. A transcripción inversa del ARN de referencia universal humano (Stratagene) se utilizó para generar una curva estándar. Las reacciones de control carecían de molde de ARN.
Los análisis Western Blot
SDS-PAGE y Western blot se realizó como se describe anteriormente [10]. anticuerpos FKBP5 se plantearon contra proteínas de fusión GST que contienen residuos amino-terminales 1-100 de FKBP5. Los anticuerpos contra Akt (# 9272), fosfo-Akt (Ser473) (# 9271), fosfo-Akt (Thr308), FoxO1 (# 9454), fosfo-FoxO1 (Thr 24) (# 9464), GSK3 (# 9315) y fosfo-GSK3 (# 9316) se adquirieron de Cell Signaling Inc (Boston, MA). especímenes tumorales se procesaron para transferencia de Western como se describe previamente usando un tampón de lisis Triton X-100 que contiene [10]. Las transferencias se desarrollaron con el reactivo Super Señal de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL).
atímicos Nude ratón tumor Formación Ensayo
Todos los ratones utilizados en este estudio se mantuvieron en la instalación de cría de animales de la Clínica Mayo. Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Mayo Clinic Institucional Cuidado de Animales y el empleo (protocolo no. A14008), y se realizaron todos los estudios de acuerdo con los procedimientos aprobados en el protocolo.
SU86 células que expresan establemente FKBP5 shRNA y se inyectaron células simuladas por vía subcutánea en la región inguinal izquierda de 4 semanas de edad, los ratones recesiva atímicos hembra nude /nude (atímicos NCR-nu /nu: Instituto Nacional del cáncer-Frederick), utilizando agujas de calibre 19 [18], [19] . Cada ratón recibió una inyección de 5 × 10
6 células en 200 DMEM libre de suero l. Los animales fueron controlados para la actividad y condición física todos los días, y las determinaciones de peso corporal y la medición de la masa tumoral se realizaron cada 3 días. El crecimiento tumoral se controló durante 6 semanas, y el volumen del tumor se calculó como 1 /2a ×
2 b, donde "a" significa el diámetro largo y "b" es el diámetro corto [18], [19]. Los tumores fueron removidos quirúrgicamente a continuación y se procesan.
Terapia Evaluación
Los ratones portadores de tumores wtFKBP5 SU86 y SU86 shFKBP5 subcutáneos entraron en el estudio cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm
3 (día 0) y fueron asignados al azar a grupos de tratamiento, con 5 ratones en cada grupo. La gemcitabina se administró i.p. cada 3 días a concentraciones de 25, 50 o 100 mg /kg. Para el estudio de gemcitabina /TCN, se incluyeron cuatro grupos de tratamiento: (a) vehículo, (b) TCN, a una dosis de 0,5 mg /kg /d en bicarbonato de sodio 1,5% (Thermo Fisher) w /v en agua, pH 8,0 , administrado en 100 mL inyección intraperitoneal una vez al día de lunes a viernes durante 4 semanas, (c) gemcitabina, a una dosis de 50 mg /kg en solución salina, ip administrada cada 3 días durante 4 semanas, o (d) una combinación de los dos tratamientos. No hubo evidencia de toxicidad bruta en los animales tratados con el fármaco, según lo determinado por la pérdida de peso. La tasa de crecimiento tumoral se calculó con el tamaño medido en cada punto de tiempo normalizado con el volumen inicial del tumor en el día 0, cuando los tumores de los ratones de xenoinjerto shFBKP5 y wtFKBP5 alcanzaron 100 mm
3. Los resultados del efecto del tratamiento fueron representados por razón de inhibición del tumor, que se define como la tasa de crecimiento del tumor de los ratones shFKPB5 corregidos de la de los ratones wt FKBP5. supresión máxima del crecimiento del tumor se utilizó para la comparación estadística entre los diferentes grupos de tratamiento.
tinción inmunohistoquímica
Las secciones de tejido se desparafinaron en xileno, sumergido en la disminución de las concentraciones de alcohol etílico, y después rehidratadas en agua destilada agua. la recuperación de antígenos para Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) se llevó a cabo mediante la colocación de las diapositivas en EDTA precalentada como la solución de recuperación en un vapor a 98 ° C durante 30 minutos. El procedimiento de tinción se llevó a cabo en un Dako Autostainer Plus. Específicamente, las secciones de tejido se trataron con peroxidasa Reactivo bloqueante (Dako, Carpinteria, CA) durante 5 minutos y luego se lavaron con tampón de lavado 1X (Dako, Carpinteria, CA), seguido de tratamiento con la proteína libre de suero Block (Dako, Carpinteria , CA) durante 5 minutos. Las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo primario Ki67 durante 60 minutos a temperatura ambiente, seguido de incubación con el anticuerpo secundario (Dako, Carpinteria, CA) durante 15 minutos. diaminobencidina de alta sensibilidad (DAB +) sistema de sustrato cromogénico (Dako, Carpinteria, CA) fue utilizado para la visualización colorimétrica.
Análisis estadístico
Los datos experimentales se expresan como media ± SEM. Las diferencias entre el control y los grupos tratados se determinaron mediante el uso de pares de
t
prueba o ANOVA, p. & Lt; 0,01 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Desmontables de resultados FKBP5 un aumento del crecimiento del tumor de páncreas y la resistencia gemcitabina
estudios previos han demostrado que la expresión FKBP5 es el regulado en el cáncer de páncreas y han sugerido que FKBP5 puede estar involucrado en el proceso tumoral de cáncer de páncreas. La línea celular de cáncer de páncreas SU86 se transfectadas establemente con agrupada FKBP5 shRNA. a continuación, se determinó el efecto de FKBP5 en la formación de tumores de xenoinjertos. Hubo un aumento dramático del tamaño del tumor en ratones desmontables FKBP5 en comparación con los ratones de control, lo que indica que FKBP5 es un supresor de tumores potencial (Figura 1A). Como se muestra en la Figura 1A, el volumen de los tumores fue significativamente mayor en los ratones shFKBP5 que en los ratones de control. Al día 18, el volumen medio fue de 200 ± 101 mm
3 en los animales de control (n = 5 ratones /grupo), y 937 ± 103 mm
3 en ratones shFKBP5 (n = 5; p & lt; 0,001). Esta tendencia fue consistente hasta 30 días cuando se sacrificaron los ratones (ratones shFKBP5: 2999 ± 298 mm
3, y ratones wtFKBP5: 1190 ± 243 mm
3; n = 5; p & lt; 0,001). Desde nuestros estudios anteriores mostraron que el nivel de expresión de FKBP5 se correlacionó con la sensibilidad de las células de cáncer de páncreas a los fármacos quimioterapéuticos [10], A continuación se determinó si la caída de FKBP5 podría afectar a la quimiosensibilidad de xenoinjertos SU86 a la la gemcitabina
in vivo
. Primero probamos el efecto de la dosis de gemcitabina con xenoinjertos de ambos WT y shFKBP5 SU86 una vez que los tumores alcanzaron el mismo tamaño, 100 mm
3. Una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento del tumor se observó con gemcitabina para todos los xenoinjertos de SU86 (Figura 1B y C). FKBP5 tipo salvaje xenoinjertos SU86 mostraron una respuesta estadísticamente significativa a 100 mg /kg de tratamiento con gemcitabina en comparación con los xenoinjertos shFKBP5 SU86 tratados con la misma dosis de gemcitabina (Figura 1D, p & lt; 0,05), lo que sugiere que la baja expresión de FKBP5 puede causar resistencia a la gemcitabina . También se encontró que a las concentraciones más bajas de gemcitabina, la wtFKBP5 también exhibió una tendencia hacia una mejor respuesta que los ratones de xenoinjerto shFKBP5, aunque (no se muestran los datos) no estadísticamente significativas. Todos los tratamientos fueron bien tolerados, sin pérdida significativa de peso corporal (Figura 1E y F).
Los ratones portadores de tumores wtFKBP5 SU86 y SU86 shFKBP5 subcutáneos entraron en el estudio cuando los tumores alcanzaron ~ 100 mm
3 (día 0 ). Todos los ratones se asignaron al azar para controlar o grupos de tratamiento y se trataron con vehículo o gemcitabina a dosis de 25, 50, y 100 mg /kg por vía intraperitoneal dos veces por semana. (A) La formación del subcutánea (s.c.) tumores en peso y shFKBP5 SU86 inyectó ratones desnudos. Los resultados se representan por el volumen del tumor medido en cada punto de tiempo. ** P & lt; 0,001 (5 ratones /grupo) en comparación entre xenoinjertos wtFKBP5 y shFKBP5 tratados con solución salina. (B y C) Respuesta de gemcitabina de xenoinjertos en ratones WT o shFKBP5. Los resultados se representan por el volumen del tumor medido en cada punto de tiempo corregido a día 0, cuando los ratones entraron en el estudio. (D) xenoinjertos shFKBP5 son resistentes a gemcitabina
in vivo
. Los resultados se representan por la relación de inhibición del tumor, definido como las mediciones de volumen del tumor en cada punto de tiempo normalizado a día 0 para los ratones shFKPB5, corregidos por la de los ratones wt FKBP5. ** P & lt; 0,001; * P & lt; 0,05 (5 ratones /grupo) como una comparación de la relación de inhibición del crecimiento tumoral entre wtFKBP5 y shFKBP5 tratados con 100 mg /kg de gemcitabina. (E y F) Las mediciones de peso corporal para xenoinjertos wt y shFKBP5. El peso corporal se registró para cada ratón cada 3 días durante todo el experimento. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de dos vías.
Hemos demostrado previamente que activa la señalización Akt se asocia con niveles bajos de FKBP5 en células de cáncer de páncreas [10]. Por lo tanto, hemos examinado la actividad de la vía Akt en muestras tumorales para cada línea celular. En xenoinjertos shFKBP5, Akt fosforilada-Ser473, FOXO1and GSK3 se incrementaron significativamente en comparación con el control (Figura 2, p & lt; 0,01). La adición de gemcitabina no tuvo ningún efecto sobre los niveles de fosforilación de estas proteínas. Estos resultados fueron consistentes con nuestros hallazgos anteriores utilizando líneas de células pancreáticas [10]. En conjunto, esta serie de experimentos sugiere que las funciones FKBP5 como un supresor tumoral, regulando negativamente la vía de Akt
in vivo
. Además, el nivel de FKBP5 afecta a la sensibilidad al tratamiento con gemcitabina asociado con su efecto sobre la fosforilación de Akt en el modelo de xenoinjerto de páncreas.
muestras de tumores de wtFKBP5 SU86 o shFKBP5 SU86 xenoinjertos se prepararon y analizaron para la fosforilación de Akt y aguas abajo moléculas de señalización por Western blot.
Akt inhibidor sensibiliza las células tumorales con baja FKBP5 a los agentes quimioterapéuticos
in vitro
El fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt es una vía de supervivencia celular que es importante para el crecimiento normal de las células y la proliferación [20], [21], [22], [23]. Esta vía es también un objetivo importante para el tratamiento del cáncer, incluyendo mamíferos objetivo de rapamicina inhibidores (mTOR), los inhibidores de PI3K y los inhibidores de Akt que ya han demostrado eficacia clínica para diferentes tumores [24]. Desde FKBP5 regula negativamente la actividad de Akt, esperaríamos que la adición de inhibidores de la orientación de la vía Akt podría revertir la resistencia a la gemcitabina. Para probar esta hipótesis, se realizó una serie de
in vitro
experimentos utilizando tres líneas de células pancreáticas tumor (AsPC1, BxPC3 y SU86) y dos líneas celulares de cáncer de mama (MCF7 y Hs578T). Se seleccionaron tres inhibidores de la vía de Akt diferentes, incluyendo un inhibidor de aguas arriba de PI3K, LY294002, un inhibidor de Akt específica, triciribina (TCN), que inhibe la fosforilación de las tres isoformas de Akt, y un inhibidor de mTOR, la rapamicina. A continuación, evaluaron el efecto de citotoxicidad de la gemcitabina en combinación con LY294002, TCN, y rapamicina, respectivamente. La Tabla 1 resume los valores de IC50 de cada tratamiento para estas cinco líneas celulares. Nuestros datos confirman, una vez más, que desmontables de las células insensibilizados FKBP5 a la gemcitabina en el tratamiento de todas las líneas celulares ensayadas (Tabla 1 y Figura S1). LY294002, TCN y rapamicina tuvieron efectos muy modestos cuando se utiliza solo, ya sea en desmontables células FKBP5 o células de control, especialmente a las concentraciones (10 M de TCN, 1,4 M LY294002, y 1 nM rapamysin) que usamos para tratamientos de combinación (Figura S2) . TCN sensibilizado tanto desmontables células FKBP5 a gemcitabina (Tabla 1, y, P & lt; 0,005) y el control. Sin embargo, el efecto de sensibilización TCN fue mayor en desmontables células FKBP5 que en las células wtFKBP5 (P & lt; 0,001) (Tabla 1 y Figura S1). Los efectos de sensibilización de LY294002 y rapamicina fueron mucho menor que el de TCN (Tabla 1 LY294002, p = 0.0023~0.3412; rapamicina, p = 0.0171~0.931).
Nos había encontrado previamente que el nivel de FKBP5 también afecta a la respuesta a otros agentes quimioterapéuticos, incluyendo etopósido y taxanos [10]. Por lo tanto, hemos probado si TCN también podría sensibilizar a los agentes en las cuatro líneas celulares estudiadas. En las cuatro líneas celulares, desmontables FKBP5 hizo las células más resistentes al tratamiento etopósido solo, lo cual es consistente con los resultados anteriores. Se encontró que el TCN podría sensibilizar significativamente etopósido en células BxPC3, AsPC1, Hs578T y MCF7 cuando se compara los valores de IC50 para el tratamiento etopósido solo frente a diferentes tratamientos de combinación (Tabla S1). El efecto de sensibilización fue más prominente en las células, con la eliminación FKBP5. LY294002 también podría sensibilizar a etopósido en células BxPC3 y MCF7 con el control y la transfección siFKBP5, mientras que la rapamicina tuvo un efecto mucho menos significativa en el control o FKBP5 derribar las células (Tabla S1). La adición de TCN también podría sensibilizar paclitaxel en las cuatro líneas celulares (Tabla S2). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en el grado del efecto de sensibilización entre el control y líneas de células desmontables FKBP5. LY294002 y rapamicina tenido un efecto limitado en la sensibilización paclitaxel.
Los efectos de LY294002, TCN y rapamicina en combinación con gemcitabina en la vía de señalización Akt fueron también evaluados en SU86 células. FKBP5 fue derribado mediante siRNA que se dirige a FKBP5 (Figura 3A). Akt 473 fosforilación se incrementó en FKBP5 derribar las células en comparación con el control (Figura 3B, columna 1, tanto para los paneles izquierdo y derecho, P & lt; 0,005), así como moléculas de señalización corriente abajo, tales como fosforilados GSK3 y FoxO1 (Figura 3C y D, columna 1 para ambos paneles izquierdo y derecho), en consonancia con nuestros resultados anteriores [10]. TCN sola era suficiente para inhibir la ruta de Akt tal como se muestra por una disminución de los niveles de fosforilación de Akt en comparación con el control (Figura 3B, columna 3 para los dos paneles de la izquierda y derecha, p & lt; 0,005), GSK3 y FoxO1 (Figura 3C y D, columna 3 para tanto los paneles izquierdo y derecho). LY294002 también tuvo un efecto sobre la vía PI3K-Akt (Figura 3C y D, columna 5, para ambos paneles izquierdo y derecho). Sin embargo, la rapamicina sola tenía menos de un efecto inhibidor sobre la vía PI3K-Akt en comparación con TCN y LY294002 (Figura 3B, C y D, columna 7 ambos paneles izquierdo y derecho). TCN en combinación con gemcitabina (Figura 3B, C y D, columna 4 para ambos paneles de la izquierda y derecha,) se redujo aún más los niveles de fosforilación de Akt 473, GSK3 y FoxO1 en comparación con gemcitabina (Figura 3B, C y D, columna 2 tanto para los paneles izquierdo y derecho) o TCN (Figura 3B, C y D, columna 3 para los dos paneles izquierdo y derecho) solo (p & lt; 0,005) y este efecto fue mucho más significativo para TCN y gemcitabina, que para LY294002 o rapamicina y gemcitabina (Figura 3B, C y D, columna 6 y 8 para los dos paneles de la izquierda y derecha). Desde desmontables de FKBP5 aumentó significativamente Akt 473 niveles de fosforilación, la reducción observada con TCN y gemcitabina fue mucho más significativa en las células FKBP5 desmontables (Figura 3B, C y D, columna 4 para los dos paneles de la izquierda y derecha), lo que confirma nuestra hipótesis de que las células con bajo FKBP5 podría depender más de la activación de Akt y, por tanto, beneficiarse más de la adición del inhibidor de Akt.
(a) FKBP5 tumbar la eficiencia se determinó por RT-PCR y Western blot. (B) las células SU86 se trataron con DMSO (vehículo), 10 nM de gemcitabina sola, o 10 mM de TCN, 1,4 M LY294002, y 1 nM de rapamicina sola o en combinación. efectos dependientes de la dosis de los diferentes tratamientos sobre la viabilidad celular se ensayaron mediante el ensayo de MTS a las 48 horas. Sólo el tratamiento combinado con gemcitabina y TCN inhibieron Akt
in vitro
. *** P & lt; 0,005. (C y D) La combinación de TCN y gemcitabina mostraron la mayor inhibición de la pGSK3β y pFOXO1 en comparación con otros tratamientos. La significación estadística se evaluó por
t
prueba y una p & lt; 0,005 fue considerado significativo como lo demuestran los asteriscos (***) guía empresas
Enhanced tumor de inhibición del crecimiento con TCN y gemcitabina
in vivo
a continuación, hemos utilizado nuestros ratones con células de xenotrasplante ya sea en peso o shFKBP5 SU86 para probar si los ratones FKBP5 desmontables podrían beneficiarse más de la adición del inhibidor de Akt, TCN. de tipo salvaje y tumores de xenoinjertos knockdown SU86 FKBP5 se cultivaron en ratones desnudos. Una vez formados los tumores de xenoinjertos, TCN y gemcitabina se inyectaron i.p. Una tasa de crecimiento del tumor fue más rápida, una vez más, observada en ratones de xenoinjerto shFKBP5 (Figura 4A y B). Para evaluar la eficacia antitumoral, los ratones portadores de tumores se trataron con TCN (0,5 mg /kg /día) i.p. para 4 semanas o gemcitabina (/kg 50 mg) i.p. tres veces a la semana durante 4 semanas en presencia o ausencia de TCN en 0,5 mg /kg, i.p. una vez al día durante 5 días. La monoterapia con TCN solo no fue efectivo en xenoinjertos desmontables WT o FKBP5, y no hubo una diferencia significativa de la supresión máxima del crecimiento tumoral en xenoinjertos de WT y shFKBP5 cuando fueron tratados con 50 mg /kg de gemcitabina sola (Figura 4C). Sin embargo, el cotratamiento con TCN mejora de forma significativa el efecto antitumoral de gemcitabina en comparación con gemcitabina o TCN solo en tanto en ratones de xenoinjerto WT y shFKBP5 (p & lt; 0,005 tanto para el peso y shFKBP5) (Figura 4D y E). Gran efecto de inhibición de TCN y gemcitabina se observó en ratones de xenoinjerto shFBKP5 comparación con wtFKBP5 (p & lt; 0,005) (Figura 4F). Todos los tratamientos fueron bien tolerados, y no hay animales murieron durante el curso del tratamiento. Por lo tanto, la combinación de gemcitabina y TCN mostró un buen perfil de seguridad en ratones sin pérdida de la mortalidad o el peso corporal (Figura 4G y H). Por lo tanto, la combinación de TCN y gemcitabina ejercida significativamente mayor
in vivo
efectos antitumorales que cualquier agente solo, especialmente cuando se disminuyó el nivel de FKBP5.
Combinación de TCN con gemcitabina efectivamente inhibe el crecimiento tumoral
in vivo
. Los ratones con tumores por vía subcutánea establecido de wtFKBP5 SU86 o células shFKBP5 SU86 entró en el estudio cuando los tumores alcanzaron ~ 100 mm
3 (día 0), y se trataron con TCN en 0,5 mg /kg al día y /o gemcitabina de 50 mg /kg cada 3 días durante 30 días. ratones wtFKBP5 (A) y shFKBP5 ratones tasa de crecimiento del tumor (B). *** P & lt; 0,005. (C) Comparación de la supresión tumoral máxima entre xenoinjertos WT y shFKBP5. No se observó ninguna diferencia significativa en la supresión máxima del crecimiento del tumor para los xenoinjertos de WT y shFKBP5 cuando fueron tratados con 50 mg /kg de gemcitabina sola. (D y E) El cotratamiento con TCN mejora de forma significativa el efecto antitumoral de gemcitabina tanto en ratones de xenoinjerto WT y shFKBP5. ** P & lt; 0,001; * P & lt; 0,05 (5 ratones /grupo) como una comparación de la relación de inhibición del crecimiento tumoral entre TCN y gemcitabina y gemcitabina sola en grupos wtFKBP5 y shFKBP5, respectivamente. (F) La pérdida de la expresión de resultados en FKBP5 aumento del efecto de sensibilización de los NTP sobre la respuesta de gemcitabina. *** P & lt; 0,005 como una comparación de la relación de inhibición del crecimiento tumoral entre los ratones wtFKBP5 y shFKBP5. La media ± SEM para cinco tumores en cada punto de datos. (G y H) Las mediciones de la pérdida de peso en xenoinjertos de WT y shFKBP5. Los efectos tóxicos de la administración de gemcitabina y gemcitabina más TCN se determinaron mediante el registro de peso corporal para cada ratón cada 3 días durante todo el experimento. Se realizó un análisis ANOVA y p & lt; 0,005 fue considerado significativo como lo demuestran los asteriscos (***) guía empresas
A continuación examinó la fosforilación de Akt 473 relativa dentro de los xenoinjertos de tumores después de diferentes tratamientos.. Se encontró que los xenoinjertos shFKBP5 gemcitabina resistentes tenían niveles elevados de Akt fosforilada 473 en comparación con wtFKBP5 (Figura 5A, columna 1 para los paneles izquierdo y derecho, P & lt; 0,005) como se esperaba. TCN solo moderadamente inhibido fosfo-Akt (53,1 ± 6,2% del control) (Figura 5A). Gemcitabina sola solamente inhibió ligeramente fosfo-Akt en el tumor (Figura 5A). Con la adición de TCN, los niveles de Akt fosforilada 473 se redujeron significativamente en comparación con los controles (figura 5A, P & lt; 0,005). Para abordar adicionalmente el mecanismo subyacente para la inhibición de la progresión tumoral, la proliferación se determinó por inmunotinción en los tumores de xenoinjertos. La inmunotinción del marcador de proliferación Ki67 reveló células tumorales más proliferan en xenoinjertos shFKBP5 en comparación con los controles (Figura 5B y C). La actividad proliferativa fue menor en los especímenes tratados con gemcitabina más TCN que con la gemcitabina sola en ambos xenoinjertos WT y shFKBP5 (Figura 5D, p & lt; 0,01). Estos resultados sugieren fuertemente que la combinación de gemcitabina y TCN inhibición de la vía Akt mejoradas.
(A) pAkt 473 niveles se ensayaron en ambos tejidos tumorales wtFKBP5 y shFKBP5. *** P & lt; 0,005. (B y C) muestras de tumores de wtFKBP5 SU86 y SU86 shFKBP5 xenoinjertos fueron preparadas y teñidas para Ki67. (D) La cuantificación de la tinción de Ki67 se expresó como porcentaje de células positivas (5 campos aleatorios para cada muestra, *** P & lt; 0,05). La evaluación estadística se realizó con
t
prueba.
Discusión
Nos informó recientemente de que FKBP5 es un andamio de proteínas que pueden mejorar la interacción PHLPP-Akt [10]. La consecuencia funcional de esta interacción da como resultado la regulación negativa de la actividad de Akt. La regulación por disminución de los resultados FKBP5 en una disminución de la interacción PHLPP-Akt y el aumento de la fosforilación de Akt en el sitio Ser473 [10], lo que sugiere que FKBP5 puede funcionar como un supresor de tumor, un hecho importante que contribuye a la quimiorresistencia. En base a los resultados anteriores con FKBP5 y su papel en la quimio-resistencia [9], [10], hemos probado esta hipótesis
in vivo
utilizando un modelo de xenoinjerto en ratones.
Hemos encontrado que los tumores en shFKBP5 ratones eran más resistentes al tratamiento gemcitabina y también mostraron una tasa de crecimiento más rápido del tumor (Figura 1A-D). Este fenómeno es involucrar a la regulación de la activación de Akt, según lo determinado por Akt fosforilada y moléculas de señalización corriente abajo (Figura 2). Desde Akt se activa cuando FKBP5 es derribado, la hipótesis de que la adición de inhibidores de la orientación de esta vía podría revertir el fenotipo de resistencia a las drogas. La vía PI3K-Akt tiene varios objetivos drugable [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], por lo que hemos probado una serie de inhibidores de la orientación de PI3K, Akt y mTOR . Hemos observado el efecto del tratamiento diferente en diferentes líneas celulares (Tablas 1, S1 y S2), que podrían ser debido a la especificidad de célula o tejido.