Extracto
proteína cuadro Tenedor de cabeza A1 (FOXA1) es un "factor pionero" que se sabe que unirse al receptor de andrógenos (AR) y regular la transcripción de genes AR-específicos. Sin embargo, se desconoce el papel exacto de FOXA1 en cáncer de próstata (PC). En este estudio, mostramos que FOXA1 juega un papel crítico en la proliferación celular PC. La expresión de FOXA1 fue mayor en PC que en los tejidos normales de la próstata (P = 0,0002), y, utilizando el análisis inmunohistoquímico, se encontró que FOXA1 se localizó en el núcleo. los niveles de expresión FOXA1 se correlacionaron significativamente con PSA y puntuaciones de Gleason (p = 0,016 yp = 0,031, respectivamente). Por otra parte, FOXA1 regulación fue un factor significativo en la insuficiencia PSA (P = 0,011). El agotamiento de FOXA1 en una línea celular de cáncer de próstata (LNCaP) utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA) la actividad de AR, inhibió, condujo a la supresión del crecimiento celular, y la detención G0 /G1 inducida. El efecto anti-proliferativo de FOXA1 siRNA fue mediada a través de la proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina 3 (IGFBP-3). Un aumento de la IGFBP-3, mediada por el agotamiento de FOXA1, la fosforilación inhibe de MAPK y Akt, y aumento de la expresión de la p21 reguladores del ciclo celular y p27. También se encontró que el efecto anti-proliferativo de agotamiento FOXA1 se invirtió significativamente por el agotamiento de siRNA simultánea de IGFBP-3. Estos resultados proporcionan evidencia fisiológica y molecular directa para un papel en el control de FOXA1 la proliferación celular a través de la regulación de la IGFBP-3 expresión en PC
Visto:. Imamura Y, Sakamoto S, Endo T, T Utsumi, Fusible M , Suyama T, et al. (2012) FOXA1 promueve la progresión tumoral en el cáncer de próstata a través de la proteína insulina factor de crecimiento similar Encuadernación 3 Camino. PLoS ONE 7 (8): e42456. doi: 10.1371 /journal.pone.0042456
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Marzo, 2012; Aceptado: 9 Julio 2012; Publicado: 3 Agosto 2012
Copyright: © Imamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una beca de ayuda-en-desde el Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón (no. 20390420,. no 22791469). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC), el cáncer más común en los hombres, es una segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en la mayoría de los países occidentales y es cada vez más común en los países asiáticos, así [1]. El andrógeno de la hormona y el receptor de andrógenos (AR) son esenciales para el crecimiento normal, la diferenciación y el mantenimiento de la glándula de la próstata, y también juegan un papel crítico en el desarrollo de PC [2]. Por lo tanto, el tratamiento de PC avanzada implica el bloqueo de la producción de andrógenos o antagonizar AR y sus genes diana [1]. Sin embargo, PC reincide después de la adquisición de resistencia a la castración. Un estudio reciente demostró que un bajo nivel de andrógenos intra-tumoral durante la terapia de ablación de andrógenos continúa para activar la AR, lo que conduce a una mayor progresión de la PC en la metástasis [3]. Por lo tanto, incluso en un estado avanzado de PC, la regulación de la actividad de AR es importante para el tratamiento de la PC.
A partir de un análisis de microarrays anterior en el que se comparó la expresión del gen de la hiperplasia prostática benigna (HPB) y PC, que identifica el cuadro de la proteína Tenedor de cabeza A1 (FOXA1) como un gen cuya expresión es significativamente hasta reguladas en PC [4]. FOXA1 es un factor de transcripción que pertenece a la familia de genes de caja forkhead humano, y FOXA1 está implicado en la organogénesis endodérmico, el metabolismo y la homeostasis [5]. FOXA1 se une directamente a la AR y regula la transcripción de genes específicos de la próstata [6]. FOXA1 también sirve como un "factor pionero" para la AR en los sitios de regulación transcripcional [7], [8]. Por lo tanto, la unión de FOXA1 a histona modificada asociada con la cromatina activa facilita la posterior contratación de los receptores nucleares y la activación transcripcional [7], [8]. Varias líneas de evidencia han relacionado FOXA1 con el desarrollo de la próstata. expresión epitelial FOXA1 se ha observado en todas las etapas de desarrollo y diferenciación de la próstata del ratón [6], [9]. El ratón FOXA1-defecient demostró pérdida de la morfogénesis y la diferenciación de próstata [9], [10]. FOXA1 también contribuye a la señalización de estrógenos en el cáncer de mama, y se ha asociado con el subtipo luminal y buen pronóstico [11], [12]. El aumento de expresión FOXA1 también se ha observado en el colon, pulmón, tiroides, cáncer de esófago y cáncer de próstata [13] - [15].
Aunque FOXA1 asocia con el desarrollo de la próstata y la regulación de andrógenos, el mecanismo exacto de cómo FOXA1 contribuyen para la progresión de la PC, especialmente la regulación de FoxA1 dependiente de genes diana en PC se mantienen relativamente sin identificar.
el presente estudio investigó el papel de FOXA1 en la progresión del PC. Hemos identificado el factor de crecimiento similar a la insulina proteína 3 (IGFBP-3) de unión como una nueva diana de FOXA1 para la regulación de la proliferación celular en las células PC.
Resultados
La expresión de FOXA1 de próstata cáncer de los tejidos y su correlación con factores clínicos
Hemos investigado la expresión de la proteína de FOXA1 en PC mediante análisis inmunohistoquímico (IHC) de las muestras de PC. resultados de IHC representativos de expresión de la proteína en FOXA1 normal adyacente a tumor (NAT) y en los tejidos de PC se muestran en la Figura 1A y la inmunorreactividad positiva B. FOXA1 fue detectado en el núcleo y en una parte del citoplasma. Un fuerte inmunoreacción FOXA1 se detectó en los núcleos de las células en la lesión de cáncer, mientras que las células en la NAT mostraron inmunotinción débil principalmente en el citoplasma. Los resultados de IHC tinción FOXA1 de NAT y de las lesiones de PC oscilaron desde 30,2 hasta 123,0 (mediana, 73,3) y 20,4 a 260,1 (mediana, 125,1), respectivamente. Los resultados de IHC tinción FOXA1 de las lesiones de PC fueron significativamente más altos que los de NAT (Figura 1C, P = 0,0002). Según puntuación de IHC, 62% de las muestras fueron positivas para PC FOXA1, sin dejar de ser el 38% de las muestras fueron negativas. Las correlaciones entre las características clinicopatológicas de los pacientes con PC y el estado de expresión de la proteína FOXA1 utilizando el sistema de puntuación de IHC se muestran en la Tabla 1. Estos datos mostraron que PCs FOXA1-positivas se correlacionaron con el valor de PSA (P = 0,016), el Gleason puntuación de PCs (P = 0,031) y la expresión de AR (P = 0,002) (Tabla 1). PCs que fueron positivos para ambos FOXA1 y AR fueron significativamente mayores en las puntuaciones de Gleason que los PC que eran tanto FOXA1- y AR-negativos (p = 0,027) (Tabla 2).
La expresión de la proteína de FOXA1 en condiciones normales adyacentes representante a tejido tumoral (NAT) (a) y el tejido PC (B), como se analiza usando IHC, se muestra. NAT muestra una baja expresión de proteínas FOXA1. Se observó tinción FOXA1-positivas en los casos de PC. inmunotinción FOXA1 positivo se detectó en el núcleo. Aumento original, × 400. (C) La cuantificación de la tinción FOXA1 de NAT y tejidos de PC. Las puntuaciones FOXA1 IHC se calcularon de la siguiente manera: la puntuación de IHC = 1 × (número de células débilmente teñidas en el campo) + 2 x (número de células moderadamente teñidas en el campo) + 3 x (número de células intensamente teñidas en el campo) . Las puntuaciones FOXA1 IHC para los tejidos normales de la próstata y de los PC a distancia desde 30,2 hasta 123,0 (mediana, 73,3) y de 20,4 a 260,1 (mediana, 125,1), respectivamente. Hasta reguladas expresión FOXA1 (D) se asoció significativamente con la recidiva del PSA (p = 0,011), pero hasta reguladas expresión del RA (E) no fue (P = 0,4457). Estadísticas de log-rank se utilizaron para probar la diferencia en los tiempos de supervivencia entre los grupos. FOXA1 (+), FOXA1 hasta reguladas; FOXA1 (-), FOXA1 el regulado. AR (+), AR hasta reguladas; AR (-), AR-regulada hacia abajo. ** Indica una diferencia estadística de p. & Lt; 0,01
Análisis de supervivencia mediante el método de Kaplan-Meier mostró que FOXA1 regulación fue un factor importante en el fracaso de PSA (Figura 1D ; log-rank test, p = 0,011) en comparación con AR regulación (Figura 1E; log-rank test, p = 0,4457). Las tasas de supervivencia de fracaso del APE de casos con hasta reguladas y FOXA1 las reguladas eran 50,7 y 87,7%, respectivamente. Las tasas de supervivencia de fracaso del APE en los casos con hasta reglamentado y regulado por AR fueron 58,5 y 73,8%, respectivamente.
Evaluación de FOXA1 expresión de proteínas en líneas celulares derivadas de PC-
A continuación se investigó FOXA1 ARNm y la expresión de la proteína en el PC mediante el análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (QRT-PCR) y Western Blot, respectivamente, de cuatro líneas celulares PC-derivados, incluyendo andrógenos línea celular independiente, célula sensible a los andrógenos (PC-3 y DU145) línea (LNCaP), línea de células insensibles andrógenos (C4-2), establecido desde el host castrado de LNCaP y la línea celular de próstata no tumorigénicos (RWPE-1) [16] - [19] (Figura 2A). El peso molecular de FOXA1 por transferencia Western fue de 49 kDa. Tanto FOXA1 mRNA y expresión de la proteína fueron significativamente mayores en las células LNCaP sensibles a andrógenos y células C4-2 que en las otras líneas celulares.
(A) La expresión del ARNm y la expresión de la proteína de FOXA1 en cuatro PC- líneas celulares derivadas (PC-3, DU-145, LNCaP, C4-2) y en la línea celular de próstata no tumorigénicos (RWPE-1) se analizaron mediante qRT-PCR y Western Blot, respectivamente. (B) células LNCaP fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes (siFOXA1#1-3). Después de 48 h de la transfección, se extrajo el ARN y FOXA1 mRNA se analizó mediante análisis de QRT-PCR. expresión FOXA1 mRNA se expresa en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. Los resultados mostrados son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. Las proteínas se extrajeron 72 h después de la transfección y expresión FOXA1 y proteína GAPDH fue examinado por análisis de transferencia Western. las células LNCaP (C, D) se transfectaron con el pGL3-PSAP 5,8 luciferasa del plásmido reportero y con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes. (# 1-3) y luego se cultivaron en fenol medio RPMI-1640 libre de rojo que contiene 5% CS-FBS. (C) Después de 72 h de transfección, las actividades de luciferasa se midió usando el sistema de ensayo de indicador Dual-luciferasa. Las actividades de luciferasa se expresan en relación con el control, al que se asignó un valor de 1. Las proteínas se extrajeron 72 h después de la transfección y la expresión de AR y GAPDH se examinó por análisis de transferencia Western. (D) Las células transfectadas se incubaron con las concentraciones indicadas de dihidrotestosterona durante 72 h, y las actividades de luciferasa se midieron como en (C). (E, F) células no transfectadas LNCaP se trataron con las concentraciones indicadas de dihidrotestosterona (E) o bicalutamida (F) para 48 h y la expresión de mRNA FOXA1 luego se analizó utilizando QRT-PCR. expresión FOXA1 mRNA se expresa en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. Los valores mostrados son las medias ± SD de al menos 3 experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. * Y ** indican diferencia estadística de p & lt; 0,05 y P & lt;. 0,01, respectivamente
Para obtener células en las que la expresión FOXA1 fue derribado de forma transitoria, transfectadas las células LNCaP con una de las tres diferentes siRNAs FoxA1 (siFOXA1#1-3) plásmidos o con un siRNA plásmido de control negativo (nega). A continuación, analizó ARNm FOXA1 y expresión de proteínas en estas células transfectadas siFOXA1 usando QRT-PCR y análisis de Western blot, respectivamente. Las células transfectadas con SiFOXA1 muestra la reducción del nivel de ARNm FOXA1 en casi un 90% en comparación con la de las células transfectadas (nega-nega). los niveles de proteína en las células transfectadas FOXA1-siFOXA1 fueron también fuertemente disminuido en comparación con las células transfectadas nega (Figura 2B).
El efecto de FOXA1 el receptor de andrógenos actividad y el efecto de la activación de AR expresión FOXA1
Para determinar el efecto de la caída en la actividad FOXA1 AR, transfectadas las células LNCaP siFOXA1 transfectadas con un plásmido de expresión de luciferasa dirigido por el promotor del antígeno prostático específico (PSA), pGL3PSAp-5.8. Aunque no hubo diferencia en la expresión de la proteína de AR en las células transfectadas con siFOXA1 o en células nega-transfectadas, las células transfectadas con siFOXA1 mostraron una reducción casi 80% de la actividad del promotor de PSA en comparación con la de las células nega-transfectadas (Figura 2C). Cuando las células de control LNCaP que sólo se transfectaron con pGL3PSAp-5.8 se trataron con el ligando dihidrotestosterona AR (DHT), la actividad del promotor de PSA se aumentó de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, la co-transfección de estas células con siFOXA1 redujo significativamente la actividad del promotor de PSA después del tratamiento con diversas concentraciones de DHT (Figura 2D). Para ver la influencia de FOXA1depletion en la expresión de PSA endógeno, como actos FoxA1 para remodelar la cromatina, analizamos la expresión de ARNm de PSA en las células transfectadas con siFOXA1 utilizando QRT-PCR. Figura S1 A muestra que el agotamiento FOXA1 mediada reducción significativa del nivel de ARNm de PSA en comparación con la de las células transfectadas nega.
Para determinar si la expresión de ARNm FOXA1 está mediada por la actividad de AR, hemos probado el efecto del tratamiento de las células LNCaP con DHT y bicalutamida o con el antagonista de AR en la expresión de ARNm FOXA1. QRT-PCR análisis mostró que no había diferencia en la expresión de ARNm de FOXA1 en las células LNCaP sensibles a andrógenos tras el crecimiento en medio que contiene DHT o en medio que contiene bicalutamida (Figura 2E y F). Estos resultados indicaron que FOXA1 media la activación de la AR, sin embargo, la expresión de FOXA1 sí no es regulada por andrógenos.
FOXA1 regula la proliferación celular en las células PC
Para investigar el efecto de la caída en la célula FOXA1 proliferación, el crecimiento celular de células LNCaP transfectadas con siFOXA1 se controló durante 4 días. Las células transfectadas con siFOXA1 mostraron una disminución significativa en el crecimiento celular en comparación con las células transfectadas (nega-Figura 3A). Por otro lado, las células que sobreexpresan FoxA1 aumentaron significativamente el crecimiento celular en comparación con células nega-transfectadas (Figura S1C). Para investigar el efecto de FOXA1 en la progresión del ciclo celular, se analizaron las fases del ciclo celular de las células transfectadas con siFOXA1 utilizando análisis de citometría de flujo. El porcentaje de células transfectadas con siFOXA1 en la fase G0 /G1 fue mayor que la de las células nega-transfectadas (Figura 3B), lo que sugiere que la baja regulación de FOXA1 inhibió la proliferación celular mediante la inducción de la detención G0 /G1.
(a) se transfectaron con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres diferentes siRNAs FoxA1 (# 1-#3), y luego fueron resembrado en una placa de cultivo de 24 pocillos. a continuación, la proliferación celular se ensayó más de 4 días contando el número de células para cada condición de la transfección, tal como se indica. (B) La etapa del ciclo celular de las células se analizó mediante tinción con yoduro de propidio y análisis FACS 24 h después de la transfección de ARNsi y el porcentaje de células en cada población transfectada que estaba en se calculó cada fase del ciclo. las células LNCaP (C) se transfectaron con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes (siFOXA1#1-3). Después de 48 h de transfección expresión del ARNm de IGFBP-3 fueron analizados por QRT-PCR. IGFBP-3 la expresión de ARNm se expresa en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. (D) células LNCaP fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes (siFOXA1#1-3). Después de 72 h de transfección, la concentración de IGFBP-3 de los medios de comunicación se analizó por ELISA. (E) Las proteínas se extrajeron 72 h después de la transfección y la expresión de IGFBP3, de la señalización de proteínas relacionadas (cantidad total de MAPK, fosfo-MAPK, la cantidad total de Akt y fosfo-Akt), de G0 insulina-receptor /arrestados G1 proteínas del ciclo celular relacionada reguladoras (p21Cip1, p27kip1) y de GAPDH fue examinado por Western blot. pesos moleculares de proteínas se indican en los lados derecho del panel. Estos resultados son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. ** Indica una diferencia estadística de p. & Lt; 0,01
El agotamiento de FOXA1 Regula la IGFBP-3 e IGF señalización
Para hacerse una idea de los genes que son regulados en marcha por el agotamiento FOXA1 de células PC, se realizó el análisis de expresión de genes de microarrays de células agotadas de FOXA1 (Tabla 3 y 4). Se identificaron 421 genes que fueron más fuertemente expresan en células FoxA1 empobrecido que en los transfectantes de control negativo. La agrupación de los genes regulados en categorías funcionales indicó que la mayor proporción de genes regulados estaban relacionados con la proliferación celular, seguido de respuesta a heridas, los procesos del sistema muscular, las respuestas de defensa, las respuestas inflamatorias, la regulación negativa de la proliferación celular, la respuesta al la hipoxia y la maduración de las células (Tabla 3). Los genes regulados que están relacionadas con la regulación negativa de la proliferación celular se enumeran en la Tabla 4. De estos genes regulados, se estudió adicionalmente el factor de crecimiento similar a la insulina proteína de unión 3 (IGFBP-3), ya que este gen es un pozo gen supresor de tumor -Establecido en PC [20] - [23]
Para confirmar la sobre regulación de IGFBP-3 en las células LNCaP por el agotamiento FOXA1 que fue indicado por el microarray. los datos, se analizaron IGFBP-3 ARNm y la expresión de proteínas en células LNCaP transfectadas con plásmidos siFOXA1 o con el plásmido control de siRNA negativo, usando QRT-PCR y análisis de Western blot, respectivamente. La Figura 3C muestra que la expresión de ARNm de IGFBP-3 en las células transfectadas con siFOXA1 fue significativamente mayor que la de las células transfectadas Nega. los niveles de proteína IGFBP-3 en las células transfectadas con siFOXA1 también se incrementaron fuertemente en comparación con el nivel en células nega-transfectadas (Figura 3E). Por otra parte, para evaluar los cambios en los niveles de IGFBP-3 secretada, se realizó un ELISA. La Figura 3D muestra que la concentración de IGFBP-3 en los medios de las células transfectadas con siFOXA1 también se incrementó fuertemente (más de 30 veces) en comparación con la de las células transfectadas Nega. Desde IGFBP-3 modula IGF-1 de señalización, el próximo investigó si la regulación FOXA1 de IGFBP-3 de expresión se asocia con la modulación del estado de nivel de expresión o activación de IGF-1 señales descendentes en estas células (Figura 3E). El análisis de transferencia Western indicó marcado sobre regulación de IGFBP-3, la baja regulación de la fosforilación de la MAPK y Akt, y sobre regulación de la expresión de la proteína de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina (p21Cip1, p27kip1) en las células transfectadas con siFOXA1 en comparación con las células nega-transfectadas (Figura 3E). Además, el agotamiento de FOXA1 bloqueado significativamente la activación de AKT en respuesta a tratamiento con IGF-1 en LNCaP (Figura S1E). Estos resultados mostraron que la regulación FOXA1 de IGFBP-3 se acompaña de regulación de IGF-1 señales descendentes.
Con el fin de determinar la importancia de la IGFBP-3 para la regulación de la proliferación FOXA1 PC, se comparó el crecimiento de siFOXA1 células LNCaP transfectadas y que las células de siIGFBP-3-transfectadas. IGFBP-3 fue transitoriamente derribado por transfección de células LNCaP con el siRNA (-3 siIGFBP) plásmido y IGFBP-3 ARNm y la expresión de proteínas en las células transfectadas con siIGFBP-3 se evaluó mediante qRT-PCR y análisis de transferencia Western IGFBP-3 , respectivamente. La Figura 4A muestra que la IGFBP-3 ARNm y la expresión de proteínas en las células transfectadas con siIGFBP-3 fue significativamente menor que en las células transfectadas Nega. Aunque las células transfectadas con siFOXA1 mostraron una disminución significativa en el crecimiento celular en comparación con células nega-transfectadas (Figura 3A y 4B), el efecto anti-proliferativo de siFOXA1 fue revertida por la doble transfección de siFOXA1 y siIGFBP-3 (Figura 4B). Este resultado indicó que FOXA1 regula la proliferación celular de una manera IGFBP-3-dependiente.
células LNCaP (A) se transfectaron con un control negativo siRNA (nega) o con un IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3) y, 48 h después, IGFBP-3 ARNm y los niveles de proteína se analizaron mediante qRT-PCR y análisis de transferencia Western. IGFBP-3 la expresión de ARNm se expresa en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. (B) células LNCaP fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 (siFOXA1#1-#3) y /o un IGFBP-3 siRNA (siIGFBP-3), y se volvieron a sembrar en un 24 -bien placa de cultivo. La proliferación celular se midió durante 4 días y el número de células de cada población transfectadas se indica. las células LNCaP (C, D) se transfectaron con un control negativo siRNA (nega) o con un ARNsi AR (SI AR) y /o un siRNA FOXA1 (si FOXA1#1) y, 48 h después de la transfección, AR ARNm y proteínas ( C) o los niveles de IGFBP-3 de ARNm (D) se analizaron mediante qRT-PCR y /o análisis de transferencia Western. Los niveles de ARNm se expresan en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. Los resultados mostrados son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. ** Indican diferencia estadística de p. & Lt; 0,01
Desde la activación de la AR se ha informado a regular a la baja la expresión de IGFBP-3 [24], hemos realizado un estudio aún más el efecto de la AR, el FOXA1 mediada por la regulación de utilizando células transfectadas con SIAR IGFBP-3 (Figura 4C y 4D). El agotamiento de AR hizo aumentar la expresión del ARNm de IGFBP-3 (2,8 veces). Sin embargo, el aumento de IGFBP-3 de expresión observado en las células transfectadas con siFOXA1 fue mucho más alta (16,4 veces) que la de las células transfectadas con SIAR. Además, el agotamiento simultáneo de AR y FOXA1 resultó en un aumento adicional de IGFBP-3 expresión (24.0 veces) en comparación con el agotamiento de FOXA1 solo, lo que sugiere que FOXA1 y AR cooperativamente regular IGFBP-3 de expresión (Figura 4D).
papel de FOXA1 sobre Modelos de castración cáncer de próstata resistentes (CRPC) guía
Se evaluó el papel de FOXA1 sobre el cáncer de próstata independiente de andrógenos usando células C4-2, establecidos desde el host castrado de las células LNCaP. El agotamiento de FOXA1 crecimiento celular significativamente inhibido de células C4-2 incluso en el marco de baja de andrógenos (5% de carbón se filtra FCS) al comparar con las células nega-transfectadas (Figura 5A). Overexpresssion de FOXA1 en las células C4-2 promovió significativamente el crecimiento celular (Figura S1D). Cuando las células de control C4-2 fueron tratados con dosis bajas de DHT (1-100 pM), la actividad del promotor de PSA fue hasta reguladas a una concentración de 100 pM DHT. Sin embargo, la transfección de siRNA FOXA1 bloqueó la regulación de la actividad del promotor de PSA que se produjo en respuesta al tratamiento DHT a 100 horas, en las células C4-2 (Figura 5B). Del mismo modo, el agotamiento de FOXA1 inhibió significativamente la expresión de ARNm de PSA en QRT-PCR (Figura S1B). También se analizó la expresión del ARNm de IGFBP-3 en las células transfectadas con plásmidos C4-2 siFOXA1 o con el control negativo, usando QRT-PCR. La Figura 5C muestra que la expresión de ARNm de IGFBP-3 en las células transfectadas con siFOXA1 fue significativamente mayor que la de las células transfectadas Nega. La figura 5D muestra que la concentración de IGFBP-3 en los medios de las células transfectadas con siFOXA1 también se incrementaron considerablemente (más de 40 veces) en comparación con el nivel en las células transfectadas nega. siFOXA1 fosforilación significativamente inhibida de Akt después de la estimulación con IGF-1 en las células C4-2 similares a la de las células LNCaP, lo que indica la regulación negativa de IGF-1 de señalización en el agotamiento del FOXA1 (Figura S1F).
(A) C4 -2 células fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 (# 1-#3) y luego fueron resembrado en una placa de cultivo de 24 pocillos con fenol medio RPMI-1640 libre de rojo que contiene 5% CS-FBS. a continuación, la proliferación celular se midió durante 4 días y se muestra como el número de células de cada población transfectada. las células (B) C4-2 fueron transfectadas con el reportero pGL3-PSAP 5,8 luciferasa y con un FOXA1 siRNA (# 1) y se cultivaron en medio de color rojo fenol libre RPMI-1640 que contiene 5% CS-FBS con las concentraciones indicadas de dihidrotestosterona (1-100 pM). Después de 72 h de la transfección, se midió la actividad luciferasa utilizando el sistema de ensayo de indicador Dual-luciferasa. (C) células C4-2 fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes (siFOXA1#1-3). Después de 48 h de transfección expresión del ARNm de IGFBP-3 fueron analizados por QRT-PCR. IGFBP-3 la expresión de ARNm se expresa en relación a la expresión de ARNm de GAPDH en la misma célula. (D) células C4-2 fueron transfectadas con un control negativo siRNA (nega) o con uno de los tres siRNAs FoxA1 diferentes (siFOXA1#1-3). Después de 72 h de transfección, la concentración de IGFBP-3 de los medios de comunicación se analizó por ELISA. Los resultados mostrados son las medias ± S.E.M. de tres experimentos independientes. * Y ** indican diferencia estadística de p & lt; 0,05 y P & lt;. 0,01, respectivamente
Discusión
El presente estudio investigó el papel de FOXA1 en la progresión del PC. Se identificaron el supresor de tumor IGFBP-3 como una nueva diana de FOXA1, y demostramos que FOXA1 focalización de IGFBP-3 juega un papel esencial en la regulación de la proliferación de células PC.
IGFBP-3 se ha sabido para funcionar como una supresor de tumor o un inhibidor del ciclo celular en células PC [21], [24]. El aumento de expresión de IGFBP-3 en el agotamiento del FOXA1 inhibe la fosforilación de la MAPK y Akt y de la detención del ciclo celular mediada a través de una mayor expresión de la p21 reguladores del ciclo celular y p27 en las células PC. FOXA1 Recientemente se ha informado para regular el ciclo celular y la proliferación celular en las células LNCaP [15]. Nuestros datos indican que la IGFBP-3 puede ser un regulador principal de la proliferación celular FOXA1 dependiente en las células LNCaP. En base a los resultados, no sólo la AR, sino también la IGFBP-3 puede ser un factor clave en la señalización mediada por FOXA1 en PC.
FOXA1 es un factor de transcripción que modula la función de los receptores de hormonas esteroides. En la próstata, FOXA1 interactúa con el AR y controla andrógenos inducida por la activación de genes específicos de la próstata [6]. Recientemente, AR y sitios de unión FoxA1 adyacentes han sido se encuentran en múltiples promotores en células prostáticas [7], [25]. Similar a la función de AR, la expresión FOXA1 es necesaria para el desarrollo normal, así como para la regulación de andrógenos de PC [26]. El aumento de expresión de FOXA1 se ha observado en todas las etapas del desarrollo de la próstata en un modelo de ratón [27]. Se encontró que FOXA1 se sobreexpresa en los núcleos de las células PC, y que esta sobreexpresión se asoció con un aumento de PSA, Gleason y la expresión de AR. Además, la sobreexpresión de FOXA1 fue un factor significativo en la insuficiencia PSA. Aquellos resultados son consistentes con el informe anterior, lo que indica que la intensidad de tinción FOXA1 fue significativamente más débil en el lado no canceroso del tejido canceroso [28] y que una fuerte tinción FOXA1 asociado con un mal pronóstico, etapas superiores pT y aumentó Gleason [15], [28 ]. Un alto nivel de FOXA1 se había encontrado en el 89% de los PC metastásico y la expresión de FOXA1 se correlacionó positivamente con el tamaño tumoral, la invasión extra-prostática, AR y la invasión de los ganglios linfáticos [29]. FOXA1 contribuye al crecimiento dependiente de andrógenos de PC [30]. FOXA1 también juega un papel esencial en la expresión de E2C enzima ubiquitina-conjugación (UBE2C), un gen que inactiva el puesto de control de la fase M., y UBE2C se sobre-expresa en líneas celulares PC independientes de andrógenos y casos clínicos [31]. Los estudios de asociación del genoma indican la presencia de un polimorfismo de un solo nucleótido (rs119986220) en el sitio de unión FOXA1 dentro 8q24 alelos que se asocian con el riesgo de PC [25]. La evidencia combinada soporta la conexión entre FOXA1 y la progresión tumoral en el PC.
A través del análisis de la expresión génica, hemos identificado IGFBP-3 como un objetivo corriente abajo de FOXA1. IGFBP-3 es un factor de crecimiento similar a la insulina proteína cuya función principal está asociado con la entrega de IGF y disponibilidad [32] vinculante. IGFBP-3 tiene una mayor afinidad por IGF-1 que el receptor de IGF-1 y bloquea la vía mediada por IGF-1. por lo tanto, IGFBP-3 puede reducir IGF-1 biodisponibilidad e inhibir IGF-1 interacción con el receptor IGF-1, funcionando de ese modo como un supresor de tumor [21], [24]. Un papel IGF-independiente de IGFBP-3 Recientemente se ha identificado. IGFBP-3 se une al factor-β receptor de crecimiento transformante de tipo V y por lo tanto inhibe el crecimiento celular independiente de sus efectos sobre IGF [20], [33]. La inducción de la apoptosis mediante la interacción sinérgica de IGFBP-3 con un receptor nuclear tal como el receptor retinoide X -alfa (RXR), también se ha observado en células PC [24], [34]. Nuestro resultado también indicó que el aumento de expresión de IGFBP-3 en el agotamiento de FOXA1 proliferación PC inhibió significativamente en células LNCaP sensibles a andrógenos, probablemente a través de la vía de señalización de IGF-1. El aumento de IGFBP-3 en el agotamiento del FOXA1 inhibe la fosforilación de señalización mediadores en la ruta de señalización de IGF-1, incluyendo MAPK y Akt, y la detención del ciclo celular mediada por p21 y p27 en células PC. Estos últimos resultados son consistentes con un informe anterior que FOXA1 fue hasta reguladas en una lesión cáncer de tiroides y que el agotamiento de la detención del ciclo celular inducida FOXA1 y una reducción en la proliferación celular a través de un mecanismo dependiente de p27 [14].
Adquisición de resistencia a los andrógenos en PC, que se denomina resistencia a la castración, es un problema importante que limita la calidad de vida del paciente, así como la esperanza de vida. Aunque se han propuesto varios mecanismos para explicar el desarrollo de PC resistente a la castración (CRPC), la principal vía de esta resistencia todavía parece implicar la AR, incluso durante la terapia anti-andrógenos. La amplificación de la AR, la mutación de la AR, la sobreexpresión de coactivadores Ar o desregulación de los factores de crecimiento /citoquinas puede ocurrir en todo CRPC e inducir un cambio en la respuesta a AR antagonistas. Otro mecanismo de CRPC es a través de escape de la apoptosis debido a la pérdida de la PTEN gen supresor de tumor y la supresión de la anti-apoptóticos gen BCL-2 [35]. Otra causa conocida de CRPC es que la AR se puede activar en las células PC humanos en ausencia de andrógenos por IL-6 [36], [37]. Existencia de tantas vías complejas asociadas con la regulación de la activación de AR hace que sea difícil controlar el crecimiento del CRPC. En base a los datos, la focalización de FOXA1 puede proporcionar un enfoque práctico para la baja regulación de la actividad de AR en CRPC. El agotamiento de FOXA1 significativamente las reguladas activación de AR ligando-dependiente (hasta 80%) en las células LNCaP y células C4-2. Además, el agotamiento de FOXA1 hasta reguladas expresión IGFBP-3 e inhibido IGF-1 de señalización, que es una vía importante para la activación independiente de ligando de AR [38]. Sin embargo, otra línea de evidencia indica doble papel de FOXA1. Aunque FOXA1 sirve como un factor pionero promoción de AR y la interacción de la cromatina, también crea complejos correpresores que inhiben la AR y la cromatina vinculante. Por lo tanto los resultados de agotamiento FoxA1 en la apariencia de un gran número de nuevos ARA II que unían a los andrógenos regulación de genes cercanos [28], [39]. Desde FOXA1 mediada por la regulación de la AR no se caracteriza por completo, un análisis más detallado revela la importancia terapéutica de FOXA1 en CRPC.
A medida que el siguiente paso, en la determinación de la función FOXA1, estamos estudiando actualmente los mecanismos precisos por los cuales FOXA1 regula la expresión de IGFBP-3. 2+, moderada; de tres experimentos independientes.