Extracto
El cisplatino se utiliza comúnmente en la quimioterapia del cáncer de ovario, sin embargo, la quimio-resistencia al cisplatino sigue siendo un gran reto clínico. Oncogénico FOXM1 factor de transcripción se ha informado que se sobreexpresa en el cáncer de ovario. En este estudio, que tuvo como objetivo investigar el papel potencial de FOXM1 en los cánceres de ovario con la quimio-resistencia al cisplatino. Nuestros resultados indican que FOXM1 está regulada positivamente en chemoresistant muestras de cáncer de ovario, y defiende las células de cáncer de ovario contra la citotoxicidad del cisplatino. FOXM1 facilita la reparación del ADN a través de la regulación transcripcional directa EXO1 objetivo de proteger a las células de cáncer de ovario frente a la apoptosis mediada por cisplatino. Atenuando FOXM1 y EXO1 expresión mediante ARN interferente pequeño, aumenta la eficacia de la quimioterapia contra el cáncer de ovario. Nuestros hallazgos indican que la orientación FOXM1 y su EXO1 gen diana podría mejorar efecto de cisplatino en cáncer de ovario, lo que confirma su papel en la modulación de la sensibilidad cisplatino
Visto:. Zhou J, Wang Y, Wang Y, Yin X, Y Él, Chen L, et al. (2014) FOXM1 Modula cisplatino sensibilidad mediante el control de EXO1 del cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10.1371 /journal.pone.0096989
Editor: Alexander James Roy Bishop, Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, Estados Unidos de América
Recibido: Octubre 31, 2013; Aceptado: 14 de abril de 2014; Publicado: 13 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. En lograr de este manuscrito, los autores han recibido el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81272882,81302275, 81072137) y Shanghai Comité de Ciencia y Tecnología (Grant No. 12411950200). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en el mundo, con 225.500 nuevos casos y 140.200 muertes estimadas para el año 2008 [1]. La mayoría de las mujeres con cáncer de ovario epitelial (EOC) se presentan con enfermedad avanzada (estadio III o IV) en el momento del diagnóstico. El tratamiento estándar actual del cáncer de ovario, en las etapas tempranas y avanzadas, consiste en una cirugía de citorreducción completa seguida de quimioterapia, generalmente se basa en un doblete de platino y taxano [2]. Pero el desarrollo de la quimio-resistencia todavía presenta un impedimento importante para el éxito del tratamiento. La mayoría de los pacientes sucumben a la quimio-resistencia y la recaída, y la tasa de supervivencia global a los 5 años es de aproximadamente el 31% [3]. Una mejor comprensión de las bases moleculares de la resistencia a cisplatino puede conducir a nuevas estrategias antitumorales que sensibilizar a los cánceres de ovario que no responden a la quimioterapia basada en cisplatino.
factor de transcripción forkhead caja de mamíferos M1 (FOXM1) pertenece a una gran familia de forkhead factores de transcripción. miembros de la familia forkhead están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos incluyendo la embriogénesis, proliferación, diferenciación, apoptosis, transformación, la tumorigénesis, la longevidad y la homeostasis metabólica [4]. A diferencia de los otros factores de transcripción FOX-, FOXM1 se asocia con la proliferación celular y se sobreexpresa en el cáncer. Por ejemplo, los perfiles de expresión génica en carcinomas, incluyendo próstata, mama, pulmón, ovario, colon, páncreas, estómago, vejiga, ovario, hígado y riñón, revelaron que FOXM1 se sobreexpresa en todos los carcinomas [5] - [9]. La sobreexpresión de FOXM1 en diversos tumores indica una fuerte dependencia de las células tumorales en FOXM1 [10]. Por otra parte, en el cáncer de ovario, la vía de análisis integrado mostró que la red factor de transcripción FOXM1 se altera significativamente en 87% de cáncer de ovario seroso de alto grado [11]. FOXM1 promueve la proliferación celular, la migración y la invasión en el cáncer de ovario [12]. FOXM1 también se ha demostrado que desempeñan un papel crucial en la capacidad de respuesta de drogas y resistencia. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión desregulada FOXM1 puede conferir resistencia a los fármacos quimioterapéuticos, tales como cisplatino y epirubicina [13], y proteger las células de cáncer contra el daño de ADN muerte celular inducida en el cáncer de mama [14]. Sin embargo, sigue siendo difícil de alcanzar si la FOXM1 jugar un papel similar responsable de conferir resistencia a cisplatino en el cáncer de ovario.
EXO1 es una proteína con 5 'a 3' exonucleasa, así como una actividad RNasa H, que interactúa con MSH2 y que está implicado en la reparación de genes y la recombinación [15], [16]. Un estudio reciente muestra que EXO1 contribuye a la inducción de los puntos de control de daños de ADN y participa en la reparación del daño en el ADN [17], [18].
En el presente estudio, proporcionar las evidencias que FOXM1 y su reparación del ADN aguas abajo directa EXO1 gen podría desempeñar en el aumento de la supervivencia de las células de cáncer de ovario después del tratamiento con cisplatino, y la orientación del eje /Exo 1 FoxM1 puede sensibilizar las células de cáncer de ovario al tratamiento con cisplatino.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
los protocolos para el manejo de muestras de cáncer de ovario incluidos en parafina y el análisis de datos de los pacientes fueron aprobados por los comités de ética del hospital Renji, Shanghai Jiao Tong University, china. consentimientos informados escritos fueron firmados por cada paciente inscrito si todavía estaba viva o su pariente en primer grado si ella ha muerto. Todas las muestras de tejido fueron registrados por un número de caso en la base de datos sin nombres de los pacientes o la información personal que se indican.
La inmunohistoquímica
Las muestras de tejidos incluidos en parafina fueron recolectados de 20 mujeres con cáncer de ovario epitelial primaria , stagesIIto IV, que se habían sometido a cirugía inicial en el Departamento de Obstetricia y ginecología, hospital Renji, Escuela de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong entre 2005-2008. Los portaobjetos se desparafinaron, se rehidrataron y se colocaron en tampón de ácido cítrico (pH 6,0, 0,1 M) para la calefacción durante 10 min. A continuación, la actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación con 3% de H
2O
2 para 10 min. Posteriormente, las secciones se incubaron con tampón de bloqueo (Beyotime, China) durante 1 h y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo FOXM1 (01:50, Santa Cruz). Después de una 10-min de incubación de segundo anticuerpo biotinilado, los portaobjetos se incubaron de nuevo con estreptavidina-peroxidasa bajo la misma condición. A continuación, la inmunorreacción se visualizó por incubación con diaminobencidina cromógeno (DAB, Maixin-Bio, China) durante 5 min. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron, se aclararon y montaron. Los controles negativos se incubaron en tampón de bloqueo solo. Estos resultados sólo se consideraron si estas muestras de control mostraron una tinción negativa.
Líneas celulares y Cultura y
Las líneas celulares de cáncer de ovario humano A2780 y SKOV3 se adquirieron en el Banco de Células de la Academia China de ciencia (Shanghai, china). Ambas líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (Hyclone, EE.UU.) suplementado con 10% de suero (v /v) fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina y las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 /95% de aire.
siRNA y transfección de plásmidos y co-transfección
dúplex de siRNA se prepararon RiboBio (Guangzhou, china). La secuencia de ARNsi de siRNAs fueron los siguientes: FOXM1 siRNA-1: 5'-GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 ', siRNA-2: 5'-GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3' [19]. EXO1 siRNA-1: 5'-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 ', siRNA-2: 5'-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3' [18]. La secuencia de control negativo (NC) era: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '. La transfección o co-transfección de siRNA y el plásmido se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante de lipofectamina (Invitrogen).
-PCR en tiempo real
El ARN total fue extraído por medio de Trizol (Invitrogen), y cDNA se sintetizó usando PrimerScript RT kit de reactivos (Takara). Por PCR en tiempo real cuantitativa, se añadieron igual cantidad de cDNA de SYBR premezcla EX II Taq (Takara) y se ejecutan en el sistema de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems). El programa de ciclos era 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 30 s. Cada muestra se ensayó por triplicado, y β-actina se utilizó como control endógeno. Los cebadores directo e inverso utilizados fueron los siguientes: FOXM1: 5'-GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 'y 5'-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3', EXO1: 5'-CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 'y 5'-AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3'. PLK4: 5'-AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 'y 5'-GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3'. XRCC1: 5'-CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 'y 5'-CCTCCTTCACACGGAACTGG-3'. BRCA2: 5'-TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 'y 5'-AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3'. Rad51: 5'-CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 'y 5'-TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3'. β-actina:. CATGTACGTTGCTATCCAGGC 5'-3 'y 5'-3 CTCCTTAATGTCACGCACGAT'
Clonigénicas ensayo
Después de la transfección de Carolina del Norte o de genes específicos de siRNA, las células fueron sometidas a la indicada concentración de cisplatino para 1 h. Luego, las células se resuspendieron en medio completo fresco y se sembraron en placa de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 500 células /pocillo. Después de la incubación a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 y aire /95% durante 8-10 días, se cambió el medio cada 3 días. Al final del cultivo, las células se tiñeron con 1% de azul de metileno en 50% de metanol durante 20 min, se lavaron con agua, y se contaron las colonias (≥ 50 células).
Western blot
Las células se lisaron en tampón RIPA con suplemento de inhibidor de la proteasa PMSF, seguido de centrifugación a 14.000 g durante 10 min. Al final de la centrifugación, se recogieron los lisados celulares y se midió la concentración de proteína de lisados celulares. Una cantidad igual de proteínas (10 a 20 g) se resolvieron por SDS-PAGE, y se transfirió a una membrana de PVDF (Millipore). Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios en 5% albúmina de suero bovino /solución salina tamponada con Tris Tween-20 a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h. Las señales de la proteína fueron detectados por el escáner Odessey. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron: FOXM1 humana (1:100, Santa Cruz Biotechnology), H2A.X fosfo-histona (γH2AX, 1:1000, Señalización Celular Tecnología), caspasa-3 (1:1000, Señalización Celular Tecnología) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-actina (1:2000, Abcam).
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se midió por Cell Counting Kit-8 de ensayo ( Dojindo Molecular Technologies). Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se sometieron a un tratamiento diferente. Después de 48 h de incubación a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2/95% de aire, las muestras se incubaron durante otras 2 h con el reactivo de CCK8. La absorbancia se determinó a 450 nm usando FLx800 fluorescencia lector de microplacas (Biotek).
γH2AX inmunofluorescencia tinción
A2780 y células SKOV3 se transfectaron con NC o de genes específicos de siRNA. Después de 48 h, las células se trataron a continuación con la concentración indicada de cisplatino para 1 h, y los medios se cambiaron frescas. 24 horas después, las células se sometieron a (Ser139) tinción-γH2AX contra. Brevemente, las células se fijaron con formalina al 10% durante 15 min, luego se permeabilizaron con 0,1% Triton-100 en 10% de FCS durante 10 min. Las muestras se bloquearon con suero de cabra al 5% en 10% de FCS durante 1 h y después se incubaron durante la noche con el primario de conejo anti-γH2AX (Ser139; 1:400; Cell Signaling). Después de lavados con PBS, secundario de cabra anti-IgG de conejo-TRITC (1:400; Sigma-Aldrich) se añadió a las muestras durante 1 h. Las células se contratiñeron con DAPI antes del montaje. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio láser confocal de barrido TCS SP5 (Leica). Para la cuantificación focos, las células con más de 10 focos se contaron como positivos de acuerdo con el procedimiento estándar [20]. Los experimentos se repitieron por triplicado.
Citometría de flujo
La apoptosis se exmamined por análisis de citometría de flujo de Anexina V y tinción PI (BD) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En pocas palabras, después de que el tratamiento indicado, las células se resuspendieron a una concentración de 1 × 10
6 células /ml, se añadieron luego 5 l de FITC anexina V y 5 l de PI a 1 x 10
5 células (100 l) y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, las células se analizaron por citometría de flujo FC500 /FC500-MPL (Beckman Coulter). Para el análisis del ciclo celular, las células se tripsinizaron, sedimentaron, y luego se resuspendieron en solución de yoduro de propidio (/yoduro de propidio 50 mg ml, 0,1 mg /ml ARNasa A, y 0,05% de Triton-X). Todos los reactivos fueron adquiridos de Sigma. Después de 40 minutos de incubación, las células fueron analizadas por FC500 /FC500-MPL.
Se realizaron análisis de inmunoprecipitación de la cromatina
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) experimentos como se describe anteriormente [21]. 24 horas después del tratamiento con cisplatino, las células se fijaron en 1% de formaldehído durante 10 minutos para permitir la reticulación y después se inactivó con glicina. Las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis SDS. El lisado se sometió a ultrasonidos, pre-aclarado, se incubaron con anticuerpos, y se recoge con Proteína-A + G de ADN de esperma de agarosa /salmón. DNA-proteína enlaces cruzados se invirtieron y se purificó el ADN de la cromatina y se sometieron a análisis de PCR. Los cebadores 5'-AAA TCT GGC AAC AAC ACC TCA-3 'y 5'-AGT TTA GTG CCT GTC AGT TCC-3' se utilizaron para amplificar la región EXO1 FHRE1 que contiene (-1934 /-1575), y los cebadores 5'-CAA TTT TTT CGA GTA GAG ACG AC-3 'y 5'-CGG CTT CCA ACT CAT AGG GT-3' fueron utilizados para amplificar la región que contiene FHRE2 (-459 /-74). Después de la amplificación, los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa visualizado por GelRed (Biotium).
reporteros promotor y ensayos de luciferasa
La región promotora EXO1 se amplificó por PCR a partir de ADN genómico-extraído de células A2780 usando cebadores directos e inversos que contienen sitios de restricción NheI y HindIII (5'-CTA GCT AGC AGG CAC AAA GAG CCA TCA CA-3 'y 5'-AAG CTT CCC GGG CAC TAA CTT GCC TAC ACA 3'). Después de la digestión de restricción, el fragmento se clonó en el vector básico gen informador pGL-3 a la generada EXO1 construcción de promotor, promotor pGL3-FHER2 constructo -490 /-148 se clonó por PCR (cebadores: 5'-CTA GCT AGC AAA GAA CCC AGC GTG AAC TGA-3 ', 5'-AAG CTT CCC GGG CAC TAA CTT GCC TAC ACA 3'). Putativo mutagénesis Forkhead se realizó con un kit de mutagénesis dirigida al sitio (ExCell Biología). PGL3-Basic, pGL3-EXO1, de tipo salvaje pGL3-FHRE2, de tipo salvaje pGL3-FHRE2 más FOXM1 siRNA y mutante pGL3-FHRE2 se transfectaron a las células, respectivamente. Las células transfectadas se trataron con cisplatino durante 24 h y sus actividades de luciferasa se midieron por el sistema de ensayo de luciferasa (Promega).
El análisis estadístico
Se utilizó el software SPSS19.0 para calcular las desviaciones estándar y estadísticamente significativa las diferencias entre las muestras. Los asteriscos en cada gráfico indican cambios estadísticamente significativos, con valores
P
calculados por el Estudiante
t
prueba de la siguiente manera: *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P
≤0.01; ***,
P
≤0.001.
Los valores P Red de & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
1.. FOXM1 expresión es regulada hasta en cisplatino resistentes cáncer de ovario tejidos y células
Anteriormente, se ha demostrado que FOXM1 se sobreexpresa en el cáncer de ovario, y que la sobreexpresión FOXM1 se correlacionó significativamente con los cánceres de ovario de alto grado, lo que indica que FOXM1 puede jugar un papel oncogénico en el cáncer de ovario [12]. Hasta ahora, el papel de FOXM1 en la resistencia a cisplatino de cáncer de ovario no ha sido dilucidado. Para investigar la expresión de FOXM1 en cáncer de ovario sensible o resistente cisplatino, las muestras de tejido de cáncer de ovario se obtuvieron de 10 mujeres con cáncer de ovario epitelial recurrente en 6 meses después de la terapia estándar, y otros 10 mujeres que estaban sensible a la quimioterapia. Todos los pacientes recibieron cirugía citorreductora óptima seguido por 6 ciclos de quimioterapia sistémica con la combinación de cisplatino y paclitaxel. Entre los 10 pacientes sensibles a la quimioterapia, 7 de ellos era recurrente después de 12 meses y 3 de ellos no se repiten hasta el momento. Todos los toboganes eran de los tejidos de cáncer de ovario resecado en la operación inicial. Las diapositivas incluidas en parafina se tiñeron inmunohistoquímicamente con anticuerpo FOXM1 y portaobjetos teñidos representativos se muestran en la figura 1A y la figura 1B. Moderado a la expresión de alto FOXM1 se detectaron en la medida en 8 de 10 casos resistentes, pero sólo en 4 de 10 casos sensibles (figura 1C). A continuación, se comparó la resistencia a cisplatino y expresión FOXM1 en tres líneas celulares. SKOV3, que mostró más alta expresión de FOXM1, fue también el más resistente al cisplatino, mientras que ES2, que fue el más sensible a cisplatino, expresada FOXM1 en el nivel más bajo (Fig.1D). Estos resultados indican que exposiciones resistentes a cisplatino de ovario cáncer más alto nivel de expresión de FOXM1 en comparación con cisplatino cáncer de ovario sensible.
(A) sección inmunotinción Representante FOXM1 se muestra desde el grupo de pacientes sensible a la quimioterapia, (B) Representante FOXM1 corte inmunote~nido es mostrado desde el grupo de pacientes quimiorresistente. (C) El número de casos con el nivel indicado de expresión FOXM1 en grupo sensible a la quimioterapia y quimiorresistente se muestran. (D) La IC
50 valores de las diferentes líneas celulares se muestran en el panel superior, y la expresión de FOXM1 en la celda líneas se muestran en el panel inferior.
2. FOXM1 está regulado en las células de cáncer de ovario después del tratamiento con cisplatino
A fin de determinar el patrón de expresión de FOXM1 en las células de cáncer de ovario, se trataron A2780 y SKOV3 con diferentes concentraciones de cisplatino, y descubrimos el nivel de mRNA de FOXM1 aumentó sólo ligeramente después del tratamiento con cisplatino (figura 2A). Hemos encontrado, sin embargo, que la proteína FOXM1 aumentó notablemente en una concentración y manera dependiente del tiempo en ambas líneas celulares, y se mantuvo correspondencia con el nivel de γH2AX (Figura 2B y Fig.S1), que es el estándar de oro de la cuantificación daño en el DNA [22 ]. También se realizó sobre el tratamiento /OFF del cisplatino, se observó el nivel elevado de proteína FOXM1 en ambas líneas celulares a las 24 horas después del tratamiento, y el efecto sostenido hasta 96 horas (Fig.2C). Dado que el aumento del nivel de proteína FOXM1 no se corresponde con el aumento del nivel de ARNm FOXM1, era posible que la proteína elevada FOXM1 fue mediada en gran parte por la estabilización de proteínas [23].
Se trataron células A2780 y SKOV3 (A) con la concentración indicada de cisplatino para 24 h. Después del tratamiento, los niveles de transcripción de ARNm FOXM1 se determinaron mediante PCR en tiempo real y ß-actina se utilizó como control endógeno. Cada columna y la barra representa la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. (B) Se prepararon lisados celulares después el mismo tratamiento que en (A), resuelto por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de inmunotransferencia utilizando anti-FOXM1, anti-γH2AX, o anti-β-actina, respectivamente. células A2780 y SKOV3 (C) se trataron con 2 mg /ml y 4 mg /ml de cisplatino durante 12 h, respectivamente, a continuación, se cultivaron en medio completo fresco para los puntos de tiempo indicados (el tiempo cuando se añadió medio completo fue establecido como 0 h) . Western blot se realizó para determinar la expresión de FOXM1 y β-actina.
3. Orientación FOXM1 aumenta la sensibilidad a cisplatino en cáncer de ovario
Dado que FOXM1 se sobreexpresa en el cáncer de ovario, y fue aún más hasta reguladas en respuesta al tratamiento con cisplatino, la hipótesis de que la orientación FOXM1 podría sensibilizar a las células de cáncer de ovario con el cisplatino. Estamos transfectadas transitoriamente dos siRNAs dirigidos FOXM1 en A2780 y SKOV3, tanto siRNAs notablemente reducidos expresión FOXM1 y siRNA-2 tiene un mayor efecto silenciador en las dos líneas celulares (figura 3A y 3B). 48 h después de siRNA-2 transfección, las células se trataron con la concentración indicada de cisplatino. ensayo clonogénico se realizó a 1 h de tratamiento post-cisplatino, y la viabilidad celular se midió utilizando un ensayo de CCK8 a las 48 h post-tratamiento con cisplatino. Como era de esperar, FOXM1 siRNA transfección en células A2780 y SKOV3 rindió las dos líneas celulares más sensibles a la toxicidad del cisplatino, como se evidencia por una comparación de IC
50 valores entre scramble siRNA y las células tratadas con ARNsi FOXM1 (~1.7 g /ml vs ~ 4.1 g /ml en A2780, ~ 2,5 g /ml vs ~6.1 g /ml en SKOV3) (Figura 3C). El tratamiento con cisplatino FOXM1 siRNA y también dio lugar a una reducción significativa en el número de células A2780 y SKOV3 como se mide mediante el ensayo clonogénico (~ 17% ~ 45% vs en el A2780, ~ 16% frente a ~37% en SKOV3) (Fig.3D). Además, hemos examinado si la caída de FOXM1 condujo a un aumento de la apoptosis después del tratamiento con cisplatino. Como se muestra en Fig.3E, cisplatino combinado con FOXM1 siRNA resultó en aumento de las tasas de apoptosis en ambas líneas celulares (~ 18% vs ~38% en A2780, ~ 20% vs ~ 40% en SKOV3). En correspondencia con el ensayo de apoptosis, Western blot también mostraron una mayor exfoliados caspasa-3 después de co-tratamiento con cisplatino y FOXM1 siRNA (Figura 4A). En conjunto, estos resultados indican que la orientación FOXM1 proporciona una estrategia para la sensibilización de cáncer de ovario a cisplatino.
A2780 y células SKOV3 se transfectaron transitoriamente con siRNA (100 nM) dirigidos contra FOXM1. Las células de control se dejaron sin transfectar, o un control negativo siRNA (100 nM) transfectadas. 48 h después de la transfección, el nivel de mRNA FOXM1 (A) y el nivel de proteína (B) se determinó por PCR en tiempo real y transferencia Western, respectivamente. Cada columna y la barra representa la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. (C) 48 h después de la transfección, A2780 y células SKOV3 se trataron con concentraciones crecientes de cisplatino para otro 48 h y sus tasas de viabilidad se midieron por CCK8 y comparación con las células sin tratamiento con cisplatino. (D) 48 h después de la transfección siRNA, A2780 y células SKVO3 se trataron durante 1 h con 1 mg /ml y 2 mg /ml de cisplatino, respectivamente. A continuación, las células se sembraron en placas de 6 pocillos, las colonias se tiñeron y se contaron después de la incubación de 8-10 d. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes. Los gráficos proporcionan la cuantificación como porcentaje de los pocillos no tratados. Cada columna y la barra representa la media ± S.D.. de triplicados determinaciones. (E) 48 h después de la transfección, A2780 y células SKOV3 se trataron durante otras 48 h con 1 mg /ml y 2 mg /ml de cisplatino, respectivamente. Después del tratamiento, la apoptosis se determinó mediante análisis de citometría de flujo de Anexina V y tinción PI. El panel derecho muestra las medias ± S.D.. de tres experimentos independientes.
(A) 48 h después de la transfección, A2780 y células SKOV3 se trataron durante 24 h con 2 g /ml y 4 mg /ml de cisplatino, respectivamente. Después del tratamiento, se prepararon lisados de células, se resolvieron por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de inmunotransferencia de FOXM1, γH2AX, exfoliados caspasa-3 y β-actina. (B) A2780 y células SKOV3 con o sin silenciamiento de la expresión FOXM1, fueron tratados con 1 mg /ml y 2 mg /ml de cisplatino durante 1 h, respectivamente. γH2AX focos de células A2780 y SKOV3 se cuantificaron en diferentes puntos de tiempo: 24, 48 y 72 h después del tratamiento con cisplatino. Se representó el porcentaje de células positivas γH2AX. Se utilizaron células no tratadas como control.
4. FoxM1 resultados golpeando hacia abajo en la reparación del ADN deficiencia
Se ha informado de que FoxM1 regulados varios genes en la vía de reparación del ADN [14], [24], el próximo examinado si las células FOXM1 knock-down eran susceptibles de ADN roturas en el cáncer de ovario. Con este fin, las células tratadas con ARNsi FOXM1 y células scramble tratados se trataron con cisplatino, y el análisis Western Blot se realizó 24 h después del tratamiento. Cabe destacar que aumentó γH2AX se detectó en las células tratadas con siRNA FOXM1 tras mismo tratamiento con cisplatino (figura 4A). Por otra parte, teñidas de γH2AX 24, 48 y 72 h post-tratamiento con cisplatino. γH2AX focos por núcleo se contó en más de 100 células en cada punto de tiempo. Los resultados se expresaron como porcentaje de células positivas γH2AX en cada punto de tiempo. células mostradas alto porcentaje de daños de ADN no procesados (células positivas γH2AX) a las 48 y 72 horas después del tratamiento con cisplatino FOXM1 siRNA tratada en comparación células tratadas con luchar para (figura 4b). Por lo tanto, estos datos apoyan la conclusión de la deficiencia de reparación del ADN en las células tratadas con siRNA FOXM1.
5. La detección de FOXM1 gen diana implicada en la reparación de DSB inducida por cisplatino en cáncer de ovario
Varios genes diana de FOXM1, como
BRCA2
,
XRCC1
,
Rad51
,
EXO1
,
PLK4
, se ha informado a participar en la reparación del ADN después de los ADN doble filamento se rompe (DSBs) [14], [24]. Estos resultados nos llevó a determinar si estos genes diana FOXM1 median la reparación del ADN dependiente de FOXM1 en el cáncer de ovario. QPCR se empleó para determinar el perfil de expresión de los genes anteriores después del tratamiento con cisplatino.
EXO1
ARNm mostraron el cambio más robusto y correspondieron con el cambio de la proteína FOXM1 después del tratamiento con cisplatino en A2780 y SKOV3 (figura 5A). Los otros genes, sin embargo, estaban ligeramente o moderadamente inducidos después el mismo tratamiento (datos no mostrados). Curiosamente, también se encontró que la proteína EXO1 no sólo fue altamente expresado en A2780 y SKOV3 en comparación con las células ES2 (Fig.S2A), pero fue hasta reguladas de una manera dependiente de la dosis y el tiempo en el A2780 y SKOV3 cuando son tratados con cisplatino, al igual proteína FOXM1 (figura 5B y Fig.S2B). tratamiento ON /OFF de cisplatino también dio lugar a una mayor expresión de EXO1 hasta 96 h (Fig.5C). No es de extrañar que desmontables de FOXM1 fue acompañado de una reducción del 60-70% en la expresión del ARNm EXO1 (Fig.5D). Sin embargo, FOXM1 golpeando hacia abajo no dio lugar a la detención del ciclo celular profunda (Fig.S2D), lo que sugiere que la reducción de EXO1 no era un efecto indirecto de cambio del ciclo celular. Además, FOXM1 silenciamiento no sólo la expresión de proteínas EXO1 atenuada en respuesta al tratamiento con cisplatino (Fig.S2C), pero también después de ON /OFF para tratamiento de cisplatino (Fig.5E). Estos resultados indican que EXO1 es un gen diana candidato de FOXM1 en vía de reparación del ADN en el cáncer de ovario.
células A2780 y SKOV3 se trataron con la concentración indicada de cisplatino para 24-PCR en tiempo de análisis (A) y transferencia Western (SEGUNDO). Los resultados se muestran a partir de tres experimentos independientes por triplicado. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. células A2780 y SKOV3 (C) se trataron con 2 mg /ml y 4 mg /ml de cisplatino durante 12 h, respectivamente, a continuación, se cultivaron en medio completo fresco para los puntos de tiempo indicados (el tiempo cuando se añadió medio completo fue establecido como 0 h) . Western blot se realizó para determinar la expresión de EXO1 y β-actina. (D) A2780 y células SKO3 fueron transfectadas con siRNA FOXM1, 48 h después, la expresión EXO1 se determinó por análisis de PCR en tiempo real. Los resultados se muestran a partir de tres experimentos independientes por triplicado. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. (E) 24 h después de la transfección las células, A2780 y SKOV3 FOXM1 siRNA fueron tratados con 2 g /ml y 4 mg /ml de cisplatino durante 12 h, respectivamente, a continuación, se cultivaron en medio completo fresco para los puntos de tiempo indicados (el tiempo en medio completo fue añadido se establece como 0 h). La flecha (↓) indica la transfección y tratamiento con cisplatino posterior. Western blot se realizó para determinar la expresión de FOXM1, EXO1 y β-actina.
6. FOXM1 se une directamente al promotor EXO1 y regula su actividad
Hemos postulado que FOXM1 podría mejorar la transcripción EXO1 en respuesta al tratamiento con cisplatino. El análisis de secuencia identifica dos elementos de respuesta de consenso (forkhead FHREs) en la región promotora (Figura 6A) [25], [26]. Para demostrar que FOXM1 se une directamente a la secuencia del promotor endógeno EXO1 después del tratamiento con cisplatino, hemos realizado ensayos de inmunoprecipitación chromotatin en A2780 y células SKOV3. El anticuerpo anti-FOXM1, pero no el anticuerpo de control (IgG), precipitaron la región FHRE2 que contiene (-459 /-74) (figura 6B), sin embargo, la región que contiene FHRE1 (-1934 /-1575) no era precipitado (datos no mostrados). Para evaluar el papel funcional de la FHRE2 en la regulación EXO1, se realizó mutagénesis de sitio específico dentro FHRE2 del promotor pGL3-EXO1 FHRE2 (Fig.6C). Como se muestra en Fig.6D, la mutación de la FHRE2 abrogó la capacidad de FOXM1 para activar la construcción informadora después de tratamiento con cisplatino en A2780 y SKVO3, además, co-transfección de FOXM1 siRNA y de tipo salvaje pGL3-FHRE2 también resultaron en baja luciferasa actividad. Curiosamente, pGL3-FHRE2 tiene actividad transcripcional más fuerte que la secuencia promotora completa. Estos resultados sugieren que FHRE2 media el efecto transcripcional de FOXM1 en el promotor EXO1 y que podría haber algunos otros sitios que pueden ser reconocidos por la inhibición de factores de transcripción en la región aguas arriba de FHRE2.
(A) Secuencia y posición de la secuencia de consenso FHRE sobre el promotor EXO1. (B) los ensayos de chip se realizaron en células A2780 y SKOV3. fragmentos de cromatina de las células se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-IgG FOXM1 y control negativo y se sometieron a PCR. 1% del total de lisados celulares se sometieron a PCR antes de la inmunoprecipitación como entradas. (C) Estructura esquemática de tipo salvaje (WT) y formas mutantes (Mut) de FHRE2 que contienen los reporteros del promotor. (D) La actividad de luciferasa con o sin mutación en el promotor EXO1. Las células A2780 y SKOV3 fueron transfectadas con el tipo salvaje o informador que contiene FRHE2-mutante, o co-transfectadas con FOXM1 siRNA y reportero de tipo salvaje (PGL-3-Básica y pGL3-EXO1 se utilizaron como control negativo y positivo, respectivamente), después se trató con cisplatino durante 24 h. Después, se midió la actividad de luciferasa en las células. Se realizaron tres experimentos independientes.
7. la regulación de la reparación del ADN FOXM1 está mediada en parte por EXO1
EXO1 ha demostrado estar directamente involucrados en el mecanismo de reparación del ADN [18], [27], [28]. Por lo tanto, la próxima exploró si las cuentas EXO1 para la resistencia a cisplatino FOXM1 mediada. Transitoriamente derribado la expresión de EXO1 en las células A2780 y SKOV3 de siRNA transfección. Ambos siRNAs dirigidos a reducir de manera efectiva EXO1 ARNm y la expresión de proteínas en líneas A2780 y SKOV3 celulares (figura 7A y 7B). Desmontables de EXO1 también sensibiliza las células al cisplatino, como se evidencia por una comparación de IC
50 valores (de aproximadamente 2,3 g /ml vs ~4.2 g /ml en A2780, ~4.1 g /ml vs ~6.4 g /ml en SKVO3) y los números de clones (~ 23% frente a ~42% en A2780, ~21% vs ~38% en SKOV3) entre scramble siRNA y las células tratadas con siRNA específicos Exo 1 (figura 7C y 7D). De acuerdo con lo anterior, el mismo tratamiento con cisplatino resultó en más células apoptóticas en las células siRNA transfectadas específicos Exo1 (~ 18% vs ~27% en la A2780, ~21% vs ~ 33% en el SKVO3) en comparación con revolver-células tratadas (Fig.7E). Aunque EXO1 knock-down no afectó la expresión de FOXM1, se hizo recapitular en parte el efecto cisplatino sensibilización de FOXM1 silenciamiento en células de cáncer de ovario. las células tratadas con siRNA EXO1 también mostraron más daños al ADN, el aumento de la señalización de la apoptosis y las vías de reparación del ADN deteriorado la eficacia, como se detectó por inmunotransferencia para γH2AX y troceados caspasa-3 (Fig.7F), y γH2AX cuantificación (Fig.7G).