Extracto
El oncogén FOXM1 se ha implicado en todos los principales tipos de cáncer humano. Recientemente, hemos mostrado que la expresión aberrante FOXM1 provoca la expansión del compartimento de células madre dando lugar a la iniciación de la hiperplasia. Hemos demostrado previamente que regula FOXM1
INFIERNOS
, un SNF2 /helicasa implicados en la metilación del ADN, que implican a
FOXM1 Hoteles en la regulación epigenética. Aquí, hemos demostrado utilizando queratinocitos primarios humanos normales orales (NOK) que la regulación positiva de
FOXM1
suprimió el gen supresor de tumores
p16
INK4A gratis (
CDKN2A
) a través la hipermetilación del promotor. Desmontables de
INFIERNOS
utilizando siRNA reactivado la expresión de ARNm de
p16
INK4A Opiniones y regulación a la baja concomitante de dos metiltransferasas de ADN
DNMT1
y
DNMT3B
. La regulación por incremento dependiente de la dosis de endógena de
FOXM1 gratis (isoforma B) expresión durante la progresión tumoral a través de un panel de cepas normales NOK primaria (n = 8), displasias (n = 5) y de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas ( CECC) las líneas celulares (n = 11) se correlacionó positivamente con la expresión endógena de
INFIERNOS
,
IMC1
,
DNMT1
y
DNMT3B
y negativamente con
p16
INK4A Opiniones y involucrina. modificación con bisulfito y el análisis de promotor metilación específica mediante PCR cuantitativa absoluta (MS-qPCR) mostraron que la regulación positiva de
FOXM1
inducida significativamente
p16
INK4A
la hipermetilación del promotor (10 veces, P & lt; 0,05) en las células primarias NOK. Utilizando un método de microarrays de perfiles de metilación del promotor de todo el genoma no sesgo, que reveló que la aberrante
FOXM1
expresión en NOK primaria induce un patrón mundial hypomethylation similar a la encontrada en un CECC (SCC15) línea celular. Después de experimentos de validación utilizando qPCR absoluta, hemos identificado un conjunto de genes diferencialmente metilado, encontramos que se correlaciona inversamente con
in vivo
los niveles de expresión de ARNm de muestras de biopsia del tumor HNSCC clínica. Este estudio proporciona la primera evidencia, el uso primario de células humanas tumorales y tejidos normales, que la regulación positiva aberrante de
FOXM1
orquestado una firma de metilación del ADN que imita el paisaje metiloma cáncer, de la que hemos identificado una única
FOXM1
inducida por la firma epigenética que puede tener el potencial de traslación clínicos como biomarcadores para la detección temprana del cáncer, diagnóstico y /o intervenciones terapéuticas
Visto: MT. Teh, Gemenetzidis e, D Patel, Tariq R, Nadir A, Bahta AW, et al. (2012) FOXM1 induce una firma global de metilación que imita el epigenoma del cáncer de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 7 (3): e34329. doi: 10.1371 /journal.pone.0034329
Editor: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Noviembre 2011; Aceptado: February 26, 2012; Publicado: 26 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Teh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue co-financiado por el Wellcome Trust (MTT, EG), la cirugía facial Fundación de Investigación - Saving Faces (MTT, AW) y el Instituto de Odontología (DP, RT, AN), Barts y la London School de Medicina y Odontología, Universidad Queen Mary de Londres. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la comprensión del mecanismo epigenético que regula la determinación del destino de las células madre ofrece ideas fundamentales en la fisiología de la regeneración de tejidos y la patogénesis del cáncer. El mecanismo epigenético mejor estudiado perturbado durante la iniciación y progresión del cáncer es la metilación del ADN que añade grupos metilo químicamente a las citosinas en sus posiciones 5 ', predominantemente en los dinucleótidos CpG en el ADN genómico de mamíferos [1]. La metilación del ADN implica tres metiltransferasas de ADN clave: DNMT1, DNMT3A y DNMT3B. DNMT1 clásicamente se ha implicado en el mantenimiento de ADN metilado existente, mientras que, DNMT3A y DNTM3B en
de novo metilación del ADN [1]. La naturaleza heredable de la metilación del ADN permite a las células para determinar la potencia de células /destino sin cambiar la secuencia primaria de ADN genómico. La reversibilidad de la programación de la metilación del ADN hace que la especificación del destino celular muy plástico y reversible. reprogramación epigenética que implica cambios en la metilación del ADN se ha implicado en todas las etapas de la evolución del cáncer [2], [3]. También se ha demostrado que la reprogramación epigenética precede a la iniciación de las células madre /progenitoras cáncer como [4]. Ahora es bien aceptado que las células cancerosas explotan las propiedades reversibles y hereditarias de la metilación del ADN para perturbar el equilibrio entre la renovación de células madre /progenitoras y la diferenciación promoviendo así la iniciación y progresión del cáncer [2], [3], [4].
FOXM1 (isoforma B) se encontró por primera vez a ser un blanco de abajo de una vía de señalización sonic Hedgehog oncogénica a través de una familia de los gliomas factor de transcripción 1 dedo de zinc (Gli1) en los carcinomas de células basales [5]. Estudios posteriores revelaron que FOXM1 se upregulated de forma ubicua en la mayoría de los cánceres humanos [6], [7], que incluyen cerebro, hígado, mama, pulmón, estómago, páncreas, colon, riñón, vejiga, próstata, testículo, ovario, útero, cuello uterino , la sangre (leucemia mieloide aguda), melanoma cutáneo, de cabeza y cuello carcinomas de células escamosas [8], [9].
En la búsqueda para entender el mecanismo oncogénico de FOXM1, recientemente hemos demostrado que induce el cáncer FOXM1 iniciación mediante la promoción de la renovación celular epitelial humano adulto madre /progenitoras y antagonizando la diferenciación [10]. Otros han demostrado que FOXM1 juega un papel clave en el mantenimiento de la renovación de células madre /progenitoras a través de pluripotencia genes incluidos
Oct4
,
Nanog
,
Sox2
y
Bmi1
[11], [12]. Nuestro trabajo previo identificó un objetivo abajo FOXM1
INFIERNOS
[8], un factor de células madre embrionarias /linfoide específico SNF2 /helicasa humano involucrado en la remodelación de la cromatina y la metilación del ADN [13], [14], lo que implica en FOXM1 regulación epigenética durante la renovación /células progenitoras de la barra [8], [10]. Sin embargo, no estaba claro si FOXM1 tiene un papel en la regulación epigenética. En este estudio, el uso de queratinocitos primarios humanos normales orales y (CECC) líneas celulares de tumores de cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello y tejidos de biopsia del tumor, se investigó el papel de FOXM1 en la regulación del gen promotor de la metilación en tanto solo gen y los niveles en todo el genoma . Esto llevó a la primera evidencia en las células orales humanas primarias epiteliales normales que FOXM1 induce un paisaje metilación se asemeja a un epigenoma cáncer que se encuentra en los tejidos tumorales HNSCC.
Métodos
Los tejidos clínicos
el uso de tejido humano en este estudio ha sido aprobado por las instituciones de acogida (Barts & amp; el London NHS Trust y la Escuela de Medicina & amp; Odontología, Universidad Queen Mary de Londres) y el Comité de Ética de Investigación Nacional del Reino Unido. Todas las muestras clínicas, que eran excedente para el diagnóstico, se recogieron de acuerdo con los protocolos aprobados por los comités éticos locales y el consentimiento informado por escrito del paciente se obtuvo de todos los participantes. Pares de biopsias de tejidos normales y tumorales HNSCC margen centrales eran histopatológico pre-validada por nuestros patólogos colaboradoras antes de su uso para este estudio. muestras de tejido de biopsia fresca se conservaron en ARN
Más tarde gratis (Cat#AM7022, Ambion, Applied Biosystems, Warrington, UK) y se almacena a corto plazo, ya sea en 4 ° C (1-2 días) o -20 ° C (hasta 1 semana) antes de su transporte y posterior almacenamiento a largo plazo a -80 ° C hasta su uso.
cultivo de células
Todos los queratinocitos orales humanos normales primarios (OK355, HOKG, OK113, NOK, NOK1, NOK3, NOK16 y NOK376) fueron extraídos de los tejidos de la mucosa oral normal donados por individuos sanos libres de enfermedades sometidos a la extracción de muelas del juicio y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [8], [15]. líneas de células displásicas lesiones precancerosas orales (OKF6 /T [16], POE9n [17], DOK [18], D19 [19], D20 [19]) y SCC líneas celulares orales (SCC4 [20], SCC9 [20], SCC15 [20], SCC25 [20], SQCC /Y1 [21], UK1 [22], VB6 [22], CaLH2 [22], CaDec12 [22], 5PT [22], H357 [22]), SVpgC2a [23 ] y SVFN1-8 [8] todas las líneas celulares fueron bien establecido cultivaron como se describe anteriormente [8], [10], [15].
inmunotransferencia
La extracción de proteínas y la separación en SDS geles -PAGE y la inmunotransferencia se realizó tal como (5) descrito anteriormente. Un anticuerpo monoclonal de ratón para p16
INK4A (1:2000 dilución; Cat#551154, BD Biosciences) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-GAPDH (1:20,000 dilución; Cat#9485, Abcam) se utilizaron para la inmunotransferencia
.
ARN de interferencia
siHELLS genes específicos de pre-validado (ON-TARGETplus SmartPool iNFIERNOS, Cat L-017444-09,10,11,12 #), controlan siCTRL (ON-TARGETplus no director piscina , D-001810-10-05 Cat #) y reactivo de transfección siRNA (DharmaFECT 1, Cat#T-2001 a 02) fueron adquiridos de Dharmacon, Thermo Fisher Scientific. Un experimento inicial de dosis-respuesta se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para determinar la eficiencia óptima de la transfección. Se encontró siRNA a 10 nM (48-horas de incubación) para ser la concentración final óptima que, por tanto, se utilizó en todos los experimentos posteriores. El efecto de silenciamiento de genes se validó mediante la cuantificación de la expresión del ARNm del gen diana (
INFIERNOS
) mediante transcripción inversa absoluta qPCR.
transducción retroviral
sobrenadante y procedimientos de transducción retroviral eran realizado utilizando nuestros protocolos establecidos [8], [10], [15]. La igualdad de los niveles de
EGFP
y
FOXM1 gratis (isoforma B) expresión se logra mediante experimento de valoración sobrenadante retroviral serie y posteriormente
EGFP
plásmido número de copias confirmada por qPCR utilizando ADN genómico extraído a partir de células transducidas según nuestro método previamente establecido [15]. Los niveles de ectópico
FOXM1
expresión en los queratinocitos primarios se titularon para replicar niveles encontrados en células de cáncer como se informó anteriormente [8], [10], [15] (véase la Figura 1C). Las células transducidas se cultivaron durante 3-5 días para permitir la expresión del transgen antes del experimento.
(A) FOXM1 suprime significativamente
p16
INK4A
ARNm y la expresión de la proteína (figura recuadro) en primaria queratinocitos humanos normales. GAPDH se utilizó como control para la carga de proteínas. Las células de control (mock-transducidas con partículas retrovirales vacíos o EGFP-transducidas) no mostraron una supresión significativa de p16
INK4A expresión. (B) Derribo de un gen diana FOXM1
INFIERNOS
, que regula el genoma de toda la metilación [14], inducida por
p16
INK4A
y suprimió de forma simultánea
DNMT1
y
DNMT3B
, pero no
DNMT3A
la expresión del ARNm en una línea celular maligna FOXM1 transformadas (SVFN5) que expresan niveles constitutivos de endógena de
INFIERNOS
[8]. Cada barra representa la media ± SEM de la transfección por triplicado (48 h), ya sea con o siCTRL siHELLS. * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01 y *** P & lt; 0,001 indican el nivel de significación estadística en comparación con los controles. (C) Endógeno
FOXM1 gratis (isoforma B) los niveles de expresión de ARNm en 8 cepas de queratinocitos orales normales humanas primarias, 5 displásicas y 11 líneas de células CECC. Total
FoxM1
los niveles de expresión de mRNA se midieron en la EGFP y NOK FOXM1 transducidas (NOKG y NOKF), respectivamente. Se llevaron a cabo (D-J) de tercer orden análisis de regresión polinomial para obtener el R
2 coeficiente de determinación de los valores que indican la importancia de la co-expresión entre cada gen con
FOXM1
a través de las cepas de células 24 /líneas indicadas en el panel C.
Preparativos Ácidos nucleicos de células y tejidos
Todas las biopsias de tejidos fueron digeridos por la proteinasa K (Cat#03115887001, Roche Diagnostics Ltd., Inglaterra, Reino Unido) antes de la extracción simultánea de ARNm (kit Dynabeads ARNm directa, Cat#610.12, Invitrogen) y el ADN genómico (ADNg) extracción (por el método estándar en phenol:chloroform lisados agotados-ARNm). El ARNm se transcribe en forma inmediata inversa (kit de síntesis de ADNc Transcriptor, Cat#04897030001, Roche Diagnostics) ADNc. gDNA se fragmentó por
MseI
la digestión (37 ° C, 16 h) antes de enriquecimiento para el ADN metilado CpG utilizando un sistema basado en perlas magnéticas MBD2b /MBD3L1 conjugado de acuerdo con el protocolo del fabricante (kit ultra MethylCollector, Gato#55005, Active Motif Europa, Bélgica).
de todo el genoma de perfiles de metilación del promotor
de acuerdo con el protocolo y los requisitos del fabricante, de entrada
MseI
-digested ADNg y metilación-enriquecido El ADN de cada muestra de células (NOKG, NOKF y SCC15) fueron amplificados para generar 6 ADN mg usando WGA2 GenomePlex (Sigma) antes de los experimentos de microarrays realizadas por el servicio de microarrays Roche NimbleGen utilizando microchips de ADN humano metilación 3x720K CpG Island Plus RefSeq Promotor (Cat#05 924 600 001; Sistema NimbleGen, Reykjavik, Islandia) sobre la base de genoma construyeron HG18, con el promotor aguas arriba /aguas abajo de laboreo -2.44 /+ 0,61 kb, que abarca un total de 27,728 islas CpG a través de todo el genoma (GEO Plataforma: GPL14361). microarrays de datos generados en este estudio es compatible con MIAME y ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME a Gene Expression Omnibus repositorio (GEO serie número de acceso: GSE31767)
Real-time PCR cuantitativa absoluta
. estándar basado en curva en tiempo real absoluta PCR cuantitativa se realizó mediante SYBR Green I Master (Cat#04887352001, Roche Diagnostics Ltd, Inglaterra, Reino Unido) en el pozo 384 LightCycler 480 sistema de qPCR (Roche) de acuerdo con nuestros protocolos establecidos [8] , [9], [15] que son MIQE compatible [24]. Se llevaron a cabo las condiciones de PCR específica de metilación como se describe anteriormente [25], [26]. Todos los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Figura S1. Anteriormente cebadores FoxM1 isoforma validado-B específicos se utilizaron para cuantificar específicamente FOXM1 (isoforma B) la expresión de ARNm en este estudio [8]. Todos los genes diana se normalizaron a dos genes de referencia estables (YAP1 y POLR2A) previamente validados para estar entre los genes más estable de referencia a través de una amplia variedad de células, las células displásicas y CECC líneas orales humanas primarias [8].
resultados y Discusión
Dada nuestra anterior conclusión de que FOXM1 (isoforma B) promovió la renovación /células progenitoras vástago a través perturbando la vía de la diferenciación [10], que inicialmente se cuestionó la participación de un gen supresor de tumores
p16
INK4A
(
CDKN2A
) dado que se ha demostrado que regulan la diferenciación de células madre /progenitoras epiteliales [27] y es el gen más comúnmente inactivada en el cáncer [28]. Aquí, mostramos que ectópico
FOXM1
expresión suprimida tanto ARNm y la expresión de la proteína de p16
INK4A en los queratinocitos orales humanos primarios (Figura 1A). Desafortunadamente, como se informó anteriormente silenciar endógeno
FOXM1
expresión provoca la detención del ciclo celular [29], que excluye otros experimentos utilizando RNAi en los queratinocitos orales humanos primarios notoriamente sensibles [8], [10]. Sin embargo, nuestro
FoxM1
experimentos de sobreexpresión presentó que el
FOXM1
regulación al alza suprimida
p16
INK4A
la expresión de genes en los queratinocitos humanos primarios orales. Esto está de acuerdo con los resultados anteriores que
FOXM1
suprime la vía de la senescencia mediada por
p16
INK4A Hoteles en las células del cáncer [30].
La inactivación de
p16
INK4A
la expresión génica podría ser el resultado de una serie de mecanismos que incluyen la supresión de genes y la hipermetilación del promotor. Dado que los objetivos FoxM1
INFIERNOS
que regule la metilación del ADN [13], [14], la hipótesis de que FOXM1 puede suprimiendo
p16 INK4a
de expresión a través de la hipermetilación del promotor a través de
INFIERNOS
. Para probar esto, se knockeddown
INFIERNOS fotos: por siRNA en una línea celular HNSCC SVFN5, una línea de queratinocitos orales bucales SVpgC2a FOXM1 inducida transformado [8], que expresa altos niveles de endógena de
Opiniones y INFIERNOS los bajos niveles de
p16
INK4A
. Esto hace que la re-activación de la expresión del ARNm de
p16
INK4A gratis (Figura 1B) y la regulación a la baja concomitante de dos metiltransferasas de ADN
DNMT1
y
DNMT3B
pero ningún efecto en
DNMT3A
expresión. El hecho de que
p16
INK4A
inhibición podría reactivarse argumenta en contra de la supresión de genes como mecanismo de
p16
INK4A
inactivación. Nuestros resultados son consistentes con los hallazgos previos que
INFIERNOS
interactúa con
DNMT1
y
DNMT3B
[31] para suprimir
p16
INK4A
la expresión génica [32] a través de modificaciones epigenéticas
.
a fin de validar que la expresión de
FOXM1
,
INFIERNOS
y
p16
INK4A
genes se correlacionan con la progresión del cáncer y si hay alguna asociación con los genes implicados en la metilación del ADN, que mide los niveles de mRNA expresión endógena de
FOXM1
,
p16
INK4A
,
INFIERNOS
,
IMC1
, involucrina (
IVL
, un marcador de diferenciación ha demostrado ser regulada negativamente por
FOXM1
[10]) y 3 metiltransferasas de ADN clave (
DNMT1
,
DNMT3A
,
DNMT3B
) en un panel de 24 células cepas /líneas formadas por 8 cepas de queratinocitos orales humanos normales primarios (de los tejidos normales de la mucosa bucal), 5 displasia y 11 líneas de células HNSCC.
de acuerdo con los resultados anteriores [8], [10],
FOXM1
mostraron upregulation dependientes de la dosis durante la progresión tumoral de displasia a CECC (Figura 1C). A través del panel de 24 células cepas /líneas, hemos encontrado que la expresión de ARNm endógeno de
FOXM1
correlaciona inversamente con
p16
INK4A
pero la eficiencia de correlación fue débil (R
2 = 0,23, Figura 1 D). La regulación a la baja de
p16
INK4A
expresión se encontró que era más pronunciado en displásicos en comparación con líneas celulares HNSCC. Tal
p16 patrón
INK4A
expresión está en completo acuerdo con el
In vivo p16
INK4A
patrón de expresión proteína que se encuentra en la displasia oral y tejidos SCC [33]. Consistentemente,
IMC1
, un grupo Polycomb oncogén que es un regulador aguas arriba de
p16
INK4A
de genes [34] y también un blanco de abajo FOXM1 [12], [30], mostró co-expresión positiva con
FOXM1 gratis (R
2 = 0,64, Figura 1E), pero débil correlación inversa con
p16
INK4A gratis (R
2 = 0,42; datos no presentados) apoya la evidencia de que
p16
INK4A
expresión está regulada de forma independiente por
IMC1
durante la carcinogénesis oral, [35]. Los niveles de expresión discordante entre
FOXM1
y
p16
INK4A
en el cáncer de células pueden ser debido al hecho de que
p16
INK4A
puede ser desregulado a través de una número de diferentes mecanismos, tales como la inactivación de la mutación (puede resultar en la regulación positiva debido a mecanismo de retroalimentación), deleción del gen, amplificación del gen (de gen funcional, pero aguas abajo de señalización defectuosa), la hipermetilación del promotor, etc. Esto puede resultar en la variación
p16
INK4A
expresión independiente de
FoxM1
niveles en las líneas celulares "cáncer". Por lo tanto, mientras que
FOXM1
puede inducir la hipermetilación del promotor de
p16
INK4A
en las células "normales", tal efecto puede ser perturbado en las células "cáncer".
Expresión de
DNMT1 gratis (R
2 = 0,84; Figura 1H) y
DNMT3B gratis (R
2 = 0,89; Figura 1J), pero no
DNMT3A
(R
2 = 0,13; Figura 1I), mostró significativa co-expresión positiva con
FOXM1
que están de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores (Figura 1B) que el silenciamiento del
FOXM1 CD - objetivo abajo
INFIERNOS
condujo a la regulación por disminución concomitante de
DNMT1
y
DNMT3B
pero ningún efecto sobre
DNMT3A
expresión. No está claro por qué
DNMT3A
no se vio afectada. La literatura publicada indica que aunque ambos
DNMT3A
y
DNMT3B
están involucrados en
de novo
actividad metiltransferasa, que cumplen funciones que no se superponen [1]. Sin embargo, la participación de ambos
DNMT1
y
DNMT3B
implica un papel para
FOXM1
y
INFIERNOS
tanto en el desencadenamiento de mantenimiento y
de novo
actividades de metilación del ADN [1]. Como era de esperar,
INFIERNOS
estaban positivamente (R
2 = 0,76, Figura 1F) y
IVL
fueron negativamente (R
2 = 0,52, Figura 1G) correlacionado con
FOXM1
como se muestra anteriormente [8], [9], [10]. En conjunto, estos resultados proporcionan la primera evidencia en las células humanas que
FOXM1
estar actuando a través de
INFIERNOS
,
DNMT1
y
DNMT3B
para suprimir
p16
INK4A
la expresión génica. Teniendo en cuenta que
INFIERNOS
,
DNMT1
y
DNMT3B
se ha demostrado previamente para modular
p16
INK4A
promotor metilación [31], [32 ], la hipótesis de que
FOXM1
pueden desencadenar
p16
INK4A
silenciamiento de genes a través de la hipermetilación del promotor.
Para investigar promotor CpG metilación del ADN, que cuantifica el nivel de
p16
INK4A
la metilación del promotor usando modificación con bisulfito y la metilación específica de PCR cuantitativa (qPCR MS-; Figura 2A y Figura S1). La sobreexpresión de
FOXM1
, pero no
EGFP
, se encontró para inducir
p16
INK4A
la hipermetilación del promotor (P & lt; 0,05) que se invirtió significativamente (P & lt; 0,001 ) por un agente de desmetilación de ADN 5-aza-2 'desoxicitidina (5Aza) en los queratinocitos orales humanos primarios (Figura 2B). Estos resultados confirman un papel de
FOXM1
en la supresión de
p16
INK4A
expresión a través de la hipermetilación del promotor. En apoyo a
FOXM1
en la iniciación de la oncogénesis a través de la inhibición de
p16
INK4A
, se ha demostrado que el silenciamiento epigenético de
p16
INK4A
induce celular inmortalización en fibroblastos de embriones de ratón [36]. Además, nuestra anterior hallazgo de que
FOXM1
expresión co-expresada con un epiteliales ΔNp63α marcador de células madre en la proliferación de células madre /progenitoras subpoblación de queratinocitos orales [10], y que ΔNp63α se ha demostrado que el objetivo
HELLS
para inducir la formación de carcinoma de células escamosas en ratones [37], en conjunto sugieren un posible papel de
FOXM1 gratis (a través de
INFIERNOS
) en el desencadenamiento de la oncogénesis través de silenciar
p16
INK4A
. El mecanismo oncogénico exacta está más allá del alcance de este estudio. Sin embargo, nuestros datos actuales proporcionan la primera evidencia de que
FOXM1
es capaz de inducir la hipermetilación del promotor en un mismo nivel de genes ofrece una visión de la posibilidad de que la regulación positiva aberrante de
FOXM1
puede perturbar la regulación epigenética de la la metilación del ADN a nivel de todo el genoma.
(a) y la modificación con bisulfito metilación específica absoluta qPCR para la cuantificación de
p16
INK4A
estado de metilación. El ADN genómico se trató primero con bisulfito de sodio antes de la PCR de amplificación previa de la región promotora de
p16
INK4A
(PCR
BS, 273 pb). La metilación específica (p16M-R /F) y la metilación independiente de cebadores (p16U-F /R) fueron utilizados para cuantificar los niveles relativos de los productos metilados y no metilados dentro de la PCR
muestra BS utilizando el estándar de la curva método qPCR absoluta basada para cada producto, respectivamente. Se realizó el análisis de fusión para validar la especificidad qPCR en la detección de los dos productos M y U. (B) la conversión de bisulfito y la metilación qPCR específica se realizaron para medir los niveles relativos de no metilada (U, la temperatura de punto de fusión 85,8 ° C) y metilado (M, 91,2 ° C), ya sea en EGFP- o NOK primaria FOXM1 transducidas tratados con vehículo (DMSO) o 5Aza (1 M, la incubación de 3 días con la reposición de medicamentos fresco todos los días). Se realizó un total de n = 11 repeticiones de al menos 4 experimentos independientes. Notaciones estadísticos de significación de la prueba t * P & lt; 0,05 y *** P & lt;. 0.001
Nosotros y otros han establecido previamente un papel central para
FOXM1
en el mantenimiento de la estabilidad del genoma mediante el cual aberrante
FOXM1
expresión provoca inestabilidad genómica mundial [8], [15], [38]. Por otra parte, las conclusiones que
FOXM1
se orienta a un epigenética /vástago modulador celular
INFIERNOS
durante la iniciación del cáncer [8], [14] y
FOXM1
induce directamente
p16
INK4A
la hipermetilación del promotor (Figura 2) nos llevó a la hipótesis de que la regulación positiva aberrante de
FOXM1
perturba la metiloma. Para probar esta hipótesis, se realizó un no-sesgo de todo el genoma de perfiles de metilación del promotor de microarrays en los queratinocitos humanos normales orales primarias (NOK), ya sea que sobreexpresan un gen de control
EGFP gratis (NOKG) o
FOXM1
(NOKF) (véase la Figura 1C para
FoxM1
niveles de expresión génica de células NOKG y NOKF), y también en una línea celular CECC (SCC15). SCC15 fue elegido en este estudio como control positivo porque el promotor de
p16
INK4A
gen (CDKN2A) ha sido previamente demostrado ser hypermethylated y podría ser reactivado por 5Aza [39], por lo tanto, lo que nos permite validar los datos de la matriz de metilación.
FOXM1
se encontró para inducir un patrón mundial hypomethylation similar a la encontrada en la línea celular HNSCC, en comparación con las células control NOK expresando
EGFP gratis (Figura 3A). La comparación de los patrones de metilación por correlación análisis de regresión entre los tres tipos de células (NOKG, NOKF y SCC15), solamente NOKF vs SCC15 dio un patrón de correlación positiva, mientras que NOKF o SCC15 cada produjo una correlación inversa con la NOKG control (Figura 3B). Esto indica que la sobreexpresión de
FOXM1
, pero no
EGFP
, induce un paisaje metilación similar a la encontrada en SCC15. Tanto hipometilación global y la hipermetilación focal (que afecta a los genes individuales) son los patrones de metilación típicos que se encuentran en el cáncer [2], [3]. El hecho de que la regulación positiva de FOXM1 induce estos patrones de metilación en las células "normales" indica que la expresión aberrante de FOXM1 está cambiando el panorama metilación hacia los del cáncer. La consecuencia de hipometilación global ha sido demostrado que causa inestabilidad genómica [2], [3], esto puede proporcionar un mecanismo para nuestros hallazgos previos de que la expresión aberrante FOXM1 causa inestabilidad genómica en los queratinocitos humanos normales primarios [8], [15]. Aunque hipometilación mundial parecía ser el efecto dominante, se ha demostrado que la hipermetilación focal silenciar genes clave supresores de tumores (por ejemplo.
p16
INK4A
) también juega un papel importante en la oncogénesis [2], [3] .
(A) todo el genoma promotor análisis de microarrays de los queratinocitos humanos normales orales primarias que expresan bien
EGFP gratis (NOKG, puntos negros) o
FOXM1 gratis (NOKF, puntos amarillos ) y una línea celular de carcinoma de células escamosas (establecida SCC15, puntos rojos). Cada punto representa un único gen. (B) A no lineal 2
nd orden análisis de regresión polinomial se realizaron en los patrones de metilación relativos entre NOKG vs NOKF (correlación inversa), NOKG vs SCC15 (correlación inversa) y NOKF vs SCC15 (correlación positiva). (C) los criterios de selección genética de los genes metilados diferencialmente entre el control (NOKG) y grupos de pruebas (NOKF y SCC15). 100 y 100 más hypermethylated-hypomethylated mayoría de los genes fueron inversamente emparejados con los genes diferencialmente metiladas de NOKF y SCC15. Las listas de genes adyacentes muestran la FOXM1 inducida (también encontrado en el SCC15) diferencialmente hypermethylated preseleccionado (rojo) y los genes hypomethylated (verde) en comparación con las células control NOKG. Los CDKN2A (codifica
p16
INK4A
) de genes, su promotor que se sabe que hypermethylated en HNSCC, se incluyó como control positivo para la hipermetilación del promotor. (D) Clinical correlación muestra de tejido tumoral entre los niveles relativos de metilación y la expresión génica de cada gen preseleccionado en una cohorte de 10 pacientes con margen normal de emparejado y muestras de tejido tumoral HNSCC. Cada punto representa la media ± SEM de cada gen. barras de error verticales se derivaron de la expresión génica relativa de pares de tejido 10 margen-tumorales y las barras de error horizontal se derivaron de la metilación del promotor relativa de 3 NOK primario independiente (/NOKF NOKG) experimentos. El coeficiente de correlación (R
2) de un no-lineal de 2
nd orden análisis de regresión polinomial se realizaron en los 30 genes candidatos (panel izquierdo), 16 genes hypermethylated (panel central) o 14 genes hypomethylated (panel derecho) , respectivamente.
Para validar nuestra hipótesis de que
FOXM1
-orchestrated una firma de metilación que imita una metiloma cáncer, los genes diferencialmente metilado (100 y 100 más hypomethylated más hypermethylated) fueron seleccionados inicialmente para las comparaciones inversas entre NOKG y NOKF /SCC15, y un subconjunto de los 30 genes de consenso, compartidos entre las células NOKF y SCC15, con oponerse estado de metilación de NOKG células de control, fueron seleccionados posteriormente para análisis posteriores (Figura 3C). Si estos candidatos
FOXM1
inducida por los genes diferencialmente metilado eran de hecho una firma epigenética del cáncer, la hipótesis de que los tejidos tumorales HNSCC deben conservar una inversa
in vivo
la expresión del ARNm de la firma de estos genes candidatos. Para comprobar esto, se realizó absoluta qPCR para cuantificar cada uno de los genes 30 candidatos: i, los niveles relativos de metilación del promotor de ADN de cada gen en NOKG vs células NOKF, y, ii, los niveles relativos de expresión de ARNm en el margen normal de emparejado vs CECC muestras de tejido tumoral. Correlación análisis de regresión de los 30 genes candidatos mostró una relación inversa (r
2 = 0,62; Figura 3D, panel izquierdo). Entre la expresión génica de los tejidos tumorales HNSCC y la metilación del ADN de las células NOKF
Curiosamente, hypomethylated genes mostraron patrón de correlación inversa significativamente mayor (R
2 = 0,92; Figura 3D, panel derecho) de los genes hypermethylated (R
2 = 0,27; Figura 3D, panel central). Esto sugiere que el promotor hipometilación exhibió un efecto más fuerte en la activación transcripcional en comparación con la hipermetilación del promotor de la represión transcripcional. Una explicación podría ser que puede ser más fácil de detectar la activación transcripcional siguiente promotor hipometilación en oposición a la detección de la represión transcripcional que depende de si los genes se activaron antes de la hipermetilación. Nuestros resultados indican que el hipo /hipermetilación puede no ser una simétrica sencilla interruptor de encendido /apagado para la transcripción de genes. Se requieren estudios adicionales para delinear los mecanismos de transcripción regulados por el promotor de la metilación del ADN /desmetilación.
De la lista de 15 novela
FOXM1
inducida por los genes hypermethylated (Figura 3D, panel central), 4 genes (
C6orf136
,
MGAT1
,
NDUFA10
y
PAFAH1B3
) había downregulated significativamente los niveles de mRNA de expresión en tumores HNSCC, junto con el control positivo
p16
INK4A gratis (
CDKN2A
). la información genética poco publicada estaba disponible para
C6orf136
.