Extracto
Objetivo
Para determinar si la densidad de FOXP3
+ linfocitos en tumores primarios y en los ganglios linfáticos cáncer de páncreas se correlaciona con la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos.
Métodos
FOXP3
+ densidad de linfocitos en el tejido del cáncer pancreático primario y ganglios linfáticos de drenaje se midió mediante inmunohistoquímica. Se analizaron los aspectos clínicos y patológicos asociados con la acumulación de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas. También se analizó la correlación de la densidad de FOXP3
+ linfocitos en los ganglios linfáticos con el estado ganglionar y la distancia desde el tumor primario.
Resultados
FOXP3
+ densidad de linfocitos en el páncreas cáncer fue significativamente mayor que en el tejido pancreático paratumoral. La densidad de FOXP3
+ linfocitos en el tejido tumoral local se correlacionó significativamente con el grado histológico y el estado general de los ganglios linfáticos. Por otra parte, FOXP3
+ densidad de linfocitos fue significativamente mayor en los ganglios linfáticos positivos que en los negativos, si bien no tiene correlación con la distancia de los ganglios linfáticos del tumor primario.
Conclusión
densidad de FOXP3
+ linfocitos en el tejido del tumor primario en pacientes con cáncer de páncreas se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos que contienen metástasis que tienen mayores FOXP3
+ linfocitos densidades que hacen los ganglios linfáticos negativos
Visto:. Jiang Y, Z Du, Yang M, Y Di, Li J, Zhou Z, et al. (2014) FOXP3
+ Densidad de linfocitos en el cáncer de páncreas se correlaciona con metástasis de ganglios linfáticos. PLoS ONE 9 (9): e106741. doi: 10.1371 /journal.pone.0106741
Editor: Valli De Re, Centro di Riferimento Oncológico, Instituto Nacional del Cáncer IRCCS, Italia |
Recibido: 25 Noviembre 2013; Aceptado: 9 Agosto de 2014; Publicado: 5 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Municipal de Shanghai de Ciencias Naturales (11ZR1405500) y becas de Shanghai Municipal de Ciencia y Tecnología de la Comisión (13140902401). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
adenocarcinoma ductal pancreático, conocido comúnmente como el cáncer de páncreas, es uno de los más agresivos de tumores malignos humanos. La resección quirúrgica radical de la enfermedad localizada proporciona una pequeña probabilidad de curación; sin embargo, rara vez está indicada porque los principales metástasis invasión vascular y /o distantes se descubren con frecuencia al momento del diagnóstico. Incluso cuando la resección quirúrgica es posible, la metástasis y la recurrencia son especialmente prominentes en el cáncer de páncreas [1].
Gran parte del enfoque tradicional de la investigación del cáncer ha implicado el estudio de los cambios genotípicas y fenotípicas que subyacen en el desarrollo del cáncer, la progresión y metástasis. En contraste con estos aspectos células autónomas de tumores sólidos, los estudios actuales están arrojando luz sobre otros elementos críticos del microambiente del tumor [2]. Sobre la base de estos estudios, se está poniendo de manifiesto que las células inmunes y sus citoquinas asociadas son componentes importantes del microambiente tumoral de cáncer de páncreas [3]. Las células T reguladoras (Treg), que se definieron inicialmente en el contexto de las enfermedades autoinmunes y son conocidos para suprimir T respuestas inmunes mediadas por células, ahora se cree que desempeñan un papel crucial en impedir la vigilancia inmune contra el cáncer y obstaculizando el desarrollo de antitumoral efectiva inmunidad. Se informó de que Treg incrementó en la sangre, microambiente tumoral periférica y ascitis en variedad de tumores malignos y parece interferir con múltiples aspectos de la inmunidad anti-tumor [4] - [7].
En los pacientes de cáncer de páncreas, ha sido bien documentado que la prevalencia de Treg tanto en microambientes sanguíneos tumorales y periféricos es elevado, y que la infiltración de Treg se correlaciona directamente con el estadio patológico del tumor y el pronóstico [8] - [12]. Recientemente se confirmó que el cáncer de páncreas está infiltrada por FOXP3
+ Treg putativo, y esto sirvió como una posible explicación de la baja supervivencia de los pacientes a pesar de la alta prevalencia de CD8
+ células T [13]. En ese estudio, que también se utiliza citometría de flujo para confirmar que el FOXP3
+ células fueron también CD3
+ CD4
+ CD25
+ CD127
-, fortaleciendo así la sugerencia de que FOXP3 puede servir como un marcador útil para Treg en el cáncer pancreático
la presencia o ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos es el más fuerte predictor de resultados tras la resección quirúrgica del cáncer de páncreas.; Sin embargo, poco se sabe sobre la relación entre TREG infiltración de cáncer de páncreas y metástasis en los ganglios linfáticos. Por lo tanto, hemos probado la hipótesis de que niveles elevados de inmunotinción FOXP3 en tumores primarios y los ganglios linfáticos regionales podría predecir la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer de páncreas.
Pacientes y métodos
Los pacientes
en este estudio, se recogieron los datos clínicos y patológicos de 50 pacientes que fueron sometidos a resección radical para el adenocarcinoma ductal de la cabeza del páncreas entre abril de 2005 y diciembre de 2008 en el hospital Huashan, Universidad de Fudan. Se excluyeron los pacientes con antecedentes de enfermedad autoinmune e infección crónica /aguda, y los que habían recibido radioterapia o quimioterapia antes de su operación. La nomenclatura de los ganglios linfáticos recuperados y la puesta en escena patológica se basa en la
Segunda Inglés edición de la Clasificación de carcinoma pancreático
ha propuesto por la Sociedad Japonesa de páncreas (JPS) [14]. Los ganglios linfáticos que drenan desde el primer, segundo y tercer grupos se denominan N1, N2 y N3, respectivamente. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Huashan, Universidad de Fudan, Shanghai, China (n. ° 2.012.215). Los registros de pacientes fueron anónimos y no identificable antes del análisis.
La inmunohistoquímica
Se revisaron las secciones de hematoxilina-eosina de tejidos de tumores de páncreas y paratumoral (parénquima pancreático no neoplásico adyacente), y ganglios linfáticos en la muestra, de los pacientes con diagnóstico histológico de adenocarcinoma ductal pancreático. Se recogieron los tejidos en parafina, fijados con formol correspondientes, y se prepararon secciones gruesas 5 micras. La tinción inmunohistoquímica de FOXP3 se realizó utilizando el método de peroxidasa de rábano picante complejo avidina-biotina. Brevemente, las secciones de parafina fueron desparafinados primera y hidratado, y después se sometieron a una etapa de recuperación de antígeno inducida por calor (EDTA a pH 7,8). La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada, y los portaobjetos se incubaron en 0,3% H
2O
2. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con Protein Block (RE7102; Novocastra). Los portaobjetos se incubaron entonces con anticuerpos primarios monoclonales contra la proteína FOXP3 (ab10563 clon, 1:50; Abcam). Los anticuerpos secundarios unidos se visualizaron con diaminobencidina (Dako) y de contraste con hematoxilina de Harris. tinción control negativo se realizó con el anticuerpo primario omitido.
FOXP3
+ linfocitos enumeración
Cada sección fue evaluada de forma independiente por dos patólogos (Du ZG, Zhou ZW) que fueron cegados a la perfiles clínicos y patológicos de los pacientes. Las células positivas para FOXP3 fueron contados en cinco áreas seleccionadas al azar con gran aumento (x400) (Olympus, Japón) y se expresaron como el número medio de células positivas por campo de gran aumento (/HP). Las discrepancias entre los dos patólogos fueron revisados conjuntamente para llegar a un consenso.
Análisis de los datos
Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar (DE) y las variables categóricas se expresan como frecuencias (% ). Pearson χ
2 y regresión logística múltiple se utilizaron para el análisis univariante y multivariante. La supervivencia global se estimó mediante el método de Kaplan-Meier. La prueba de log-rank y de riesgos proporcionales de Cox modelos se aplicaron para el análisis univariante y multivariante de factores de riesgo para la supervivencia, respectivamente. Todos los valores de p y 95% intervalo de confianza [IC] se estimaron en forma de dos colas. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P & lt; 0,05. Los datos fueron analizados utilizando SAS versión 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).
Resultados
Datos generales
Se identificaron 50 pacientes (29 varones y 21 mujeres, edad media: 61 años; rango:. 20-79 años) con adenocarcinoma de cabeza de páncreas que se sometió a pancreaticoduodenectomía (n = 48) o pancreatectomía total (n = 2). Además de los tumores primarios, se analizaron un total de 157 ganglios linfáticos, con 70 ganglios linfáticos del N1 (incluyendo 24 positivos y 46 ganglios linfáticos negativos de los aspectos posterior y anterior de la cabeza del páncreas), 46 ganglios linfáticos de N2 ( incluyendo 11 positivos y 35 ganglios linfáticos negativos de los alrededores de la arteria mesentérica superior o el ligamento hepatoduodenal), y 41 ganglios linfáticos de N3 (incluidos 3 positivos y 38 ganglios linfáticos negativos de la zona que rodea la aorta abdominal).
Densidad de FOXP3
+ linfocitos en el tumor y el tejido pancreático paratumoral
de acuerdo con informes anteriores, FOXP3
+ linfocitos infiltran los tumores primarios y se encuentran dispersos en las regiones intersticiales del tumor ( Figura 1 A & amp; B). Se observaron pocas FOXP3
+ linfocitos infiltrantes del tejido pancreático paratumoral (Figura 1 C & amp; D). La densidad de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas fue significativamente mayor que en el tejido pancreático paratumoral (4,8 ± 5,2 /HP vs. 0,47 ± 0,94 /HP, p & lt; 0,001, Figura 1E).
inmunohistoquímica tinción de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas (A: bajo aumento, × 100; B: alta magnificación, × 400) y el tejido pancreático paratumoral (C: bajo aumento, × 100; D: alta magnificación, × 400): el FOXP3
+ linfocitos se definieron como las células con núcleos de color marrón-tinción de linfocitos mononucleares. (E) Las diferencias en FOXP3
+ densidad de linfocitos entre el tejido de cáncer de páncreas y tejido pancreático paratumoral. (P & lt; 0,01).
FOXP3
+ densidad de linfocitos no se correlacionó con la edad, el sexo o el estadio T (incluyendo el tamaño tumoral y la infiltración local) de cáncer de páncreas (Tabla 1). La densidad de FOXP3
+ linfocitos fue mayor en los tumores con un mayor grado histológico (bien diferenciadas: 1,3 ± 1,0 /HP; vs. moderadamente diferenciado: 4,3 ± 4,5 /HP vs. mal /indiferenciado: 7,9 ± 7,8 /HP, p = 0,014). La densidad de FOXP3
+ linfocitos fue significativamente mayor en los cánceres de páncreas con metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con aquellos sin metástasis en los ganglios linfáticos (6,7 ± 5,9 /HP frente a 2,3 ± 2,6 /HP, p = 0,002). Del mismo modo, hubo una tendencia hacia una mayor densidad de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas en estadio avanzado de la enfermedad en estadio temprano. (I, II: 2,7 ± 3,1 vs. III, IV: 5,5 ± 5,6, p = 0,094).
Densidad de FOXP3
+ linfocitos en los ganglios linfáticos de drenaje
FOXP3
+ linfocitos acumulan en los ganglios linfáticos positivos, principalmente en torno a los focos metastásicos, a una densidad significativamente mayor que el observado en los ganglios linfáticos negativos (66,2 ± 36,9 /HP vs. 48,1 ± 29,9 /HP, p = 0,003, figura 2A-E). No hubo diferencias significativas en la densidad de FOXP3
+ linfocitos se observó en los diferentes grupos de ganglios linfáticos positivos (N1 N2 vs vs N3: 63,0 ± 2,7 /HP vs. 69,9 ± 37,0 /HP vs. 78,3 ± 75,2 /HP , p = 0,747, Figura 2F) o los ganglios linfáticos negativos (N1 N2 vs vs N3:. 50.4 ± 32.5 /HP vs. 50,0 ± 30,3 /HP vs. 43,4 ± 26,4 /HP, p = 0,516, Figura 2G)
la tinción inmunohistoquímica de FOXP3
+ linfocitos en un ganglio linfático positivo (a: bajo aumento, × 40; B, de gran aumento, × 400) y un ganglio linfático negativo (C: bajo aumento, × 40; D: alta magnificación, × 400), y una comparación de la FOXP3
+ densidades de linfocitos en los ganglios linfáticos positivos y negativos (e) (p = 0,03), entre los diferentes grupos de ganglios linfáticos positivos (F) (p = 0,75 ), y entre los diferentes grupos de ganglios linfáticos negativos (G) (p = 0,52).
FOXP3
+ linfocitos de infiltración tumoral de cáncer de páncreas es un factor de riesgo independiente para la metástasis de los ganglios linfáticos
metástasis en los ganglios linfáticos es los indicadores pronósticos más importantes de cáncer de páncreas resecable. La densidad media de FOXP3
+ linfocitos (4 /HP) en cada tumor se considera que es el nivel de corte y se analizó en comparación con los pacientes de edad, sexo, el grado histológico y la etapa T del tumor para identificar el riesgo factores de metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer de páncreas. Análisis univariados y multivariados confirmaron que alta densidad intratumoral de FOXP3
+ linfocitos es un factor de riesgo independiente de metástasis ganglionares (Tabla 2).
La densidad intratumoral de FOXP3
+ linfocitos tendían a correlacionan con el pronóstico después de la resección radical
de los 50 pacientes de nuestro estudio que se sometieron a resección radical, obtuvimos el momento el estado de la supervivencia y la supervivencia de los 47 pacientes a través de consulta externa o en el seguimiento telefónico. El tiempo medio de seguimiento fue de 21 meses (4-87 meses). En el análisis univariante, tanto en el estado de los ganglios linfáticos y la densidad de FOXP3
+ linfocitos en los tumores correlacionan con el pronóstico de los pacientes con cáncer pancreático después de la resección radical (como se muestra en la Figura 3 y la Tabla 3). Un análisis multivariante la incorporación de los dos factores sugiere que el FOXP3
+ densidad de linfocitos en el tumor es prometedora como un factor pronóstico independiente, sin embargo, esto no alcanzó significación estadística (p = 0,06).
estado de los ganglios linfáticos ( p = 0,03) (A) y la densidad de FOXP3
+ linfocitos en el tejido de cáncer de páncreas (p = 0,01) (B) se correlacionaron significativamente con el pronóstico del cáncer de la cabeza del páncreas después de la resección radical.
Discusión
en este estudio, se evaluó la distribución de FOXP3
+ Treg putativa en los tumores primarios de páncreas y cáncer de ganglios linfáticos de drenaje, y se determinó su correlación con las características clínico-críticos. Como FOXP3 es el marcador inmunohistoquímico individual más ampliamente aceptada para Treg y se ha demostrado tener algún valor pronóstico, confirmamos que FOXP3 acumula en los núcleos de los linfocitos mononucleares pequeñas y redondas que eran claramente distintas de las células tumorales [10] - [13] . Es importante destacar que nuestro estudio demostró una nueva asociación entre la densidad de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas y metástasis en los ganglios linfáticos. Por otra parte, hemos tomado la nueva observación de que la expresión de FOXP3 es mayor en los ganglios linfáticos que contienen metástasis de cáncer de páncreas que en aquellos que son negativos para el carcinoma
De acuerdo con estudios anteriores [10] -. [13], encontramos que la densidad de FOXP3
+ linfocitos en el cáncer de páncreas se correlacionó significativamente con el grado histológico del tumor, independientemente de la edad del paciente, el sexo, el tamaño del tumor o invasión local. Las diferencias en el fenotipo celular, la expresión de quimioquinas, el metabolismo, estado oxidativo, y el pH del microentorno del tumor entre los diferentes grados histológicos de cáncer de páncreas pueden afectar FOXP3
+ densidad de linfocitos en los tejidos tumorales; Sin embargo, aún no se ha elucidado los mecanismos precisos de conducción Treg infiltración de cáncer pancreático humano
nodo metástasis
La linfa es claramente un acontecimiento importante en la patogénesis de los tumores sólidos, especialmente el cáncer de páncreas [15] -. [18]. Como ganglios linfáticos son los sitios de la presentación de antígenos y el inicio de respuesta inmune, pueden servir como principios de barreras que impiden la entrada de células tumorales en la circulación sistémica [19]. El microambiente local de los ganglios linfáticos es de vital importancia en la determinación del curso de las respuestas inmunes posteriores. Sin embargo, los estudios anteriores no han demostrado una relación entre la infiltración FOXP3 y el estado ganglionar. Hiraoka et al. [10] habían estudiado previamente tanto primarios de páncreas tumores de cáncer y los ganglios linfáticos, sin embargo, la discrepancia entre nuestro hallazgo y la de ellos puede ser debido a nuestra enumeración del total FOXP3
+ células en vez del porcentaje de FOXP3
+ para CD4
+ células. La hipótesis de que el número absoluto de FOXP3
+ Treg putativo puede, de hecho, ser más relevante en la determinación de los efectos sobre la respuesta inmune antitumoral en evolución.
En este estudio, se analizaron 157 ganglios linfáticos de los 50 pacientes, y se encuentra significativamente más alta densidad de FOXP3
+ linfocitos en los ganglios linfáticos positivos en comparación con los negativos. Si bien los niveles de FOXP3
+ linfocitos en los ganglios linfáticos correlacionados con la presencia o ausencia de metástasis, esto no se vio afectada de forma independiente por la distancia de los ganglios linfáticos de la cáncer pancreático principal. Deng et al. [20] encontraron resultados similares en el cáncer colorrectal, sin embargo esto no se ha demostrado previamente en el cáncer de páncreas. Hay esencialmente dos mecanismos para explicar nuestros resultados. En primer lugar, la tolerancia inmune mediada por FOXP3
+ linfocitos puede contribuir a la supervivencia y la proliferación de las células tumorales que drenan a los ganglios linfáticos y en última instancia formar focos que son visibles bajo el microscopio de luz. Alternativamente, la presencia de células tumorales en los ganglios linfáticos puede resultar en FOXP3
+ linfocitos acumulación a través de la migración, la expansión o la conversión periférica. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, FOXP3
+ linfocitos acumula principalmente en la periferia de los focos metastásicos. FOXP3
+ linfocitos acumulación en los ganglios linfáticos puede promover la infiltración de células tumorales en la circulación sistémica y acelerar la progresión del cáncer de páncreas a través de la inhibición de la función de las células T efectoras.
El valor pronóstico de la medición de FOXP3
+ células T en diferentes cánceres gastrointestinales sigue siendo controvertido. En un reciente meta-análisis publicado, se demostró que los tumores infiltrantes de FOXP3
+ T células correlacionados con mal pronóstico en el carcinoma hepatocelular y cáncer gástrico, pero de buen pronóstico en el cáncer colorrectal [21]. En el ajuste de cáncer de páncreas, se demostró que el tumor infiltrante FOXP3
+ de células sirve como factor de pronóstico negativo [10], [12], [22]. En nuestro estudio, el análisis univariado demostró que el estado de los ganglios linfáticos y el tumor local de FOXP3
+ densidad de linfocitos fueron factores de pronóstico de cáncer de páncreas en pacientes después de la resección radical. No hay diferencia en el pronóstico estratificada por el estadio patológico se observó en los 50 pacientes con cáncer de páncreas. Después de tener en el estado de los ganglios linfáticos y la densidad local del tumor de FOXP3
+ linfocitos, el análisis multivariado indicó a este último como tener significación estadística sólo se limítrofe. En esta serie de pacientes, el tumor local de FOXP3
+ linfocitos densidad parecía tener mayor valor pronóstico que incluso el estado ganglionar.
En conclusión, se confirmó que la acumulación de FOXP3
+ linfocitos en la primaria tejido tumoral se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer de páncreas. Es importante destacar que, también hemos demostrado que la presencia de FOXP3
+ linfocitos en los ganglios linfáticos regionales se asocia con metástasis ganglionares y que los ganglios linfáticos metastásicos contiene un número significativamente mayor FOXP3
+ células que hacer ganglios linfáticos negativos.