Extracto
Antecedentes
El objetivo de este estudio era examinar la expresión BRF2 en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y explorar la relación de la proteína BRF2 con factores clínico-patológicas, la angiogénesis tumoral y pronóstico.
Métodos
Tanto la proteína y BRF2 microvasos intratumorales se examinaron por tinción inmunohistoquímica en 107 no pequeñas pacientes con cáncer de pulmón de células. Intratumoral densidad m icrovessel (MVD) se midió contando CD-34 células endoteliales immunostained positivos. Western blot y RT-PCR análisis se utilizaron para investigar el estado de expresión en los tejidos BRF2
Resultados
A notablemente más alto nivel de expresión BRF2 se encuentra en los tejidos de NSCLC en los niveles de proteína. Además, el análisis univariante y multivariante demostró que la proteína BRF2 sobre-expresión y alta MVD se asociaron significativamente con la recidiva tumoral. Aunque BRF2 sobreexpresión y alta MVD indicaron pobre supervivencia global a los 5 años (p = 0,004 yp = 0,019, respectivamente), el análisis multivariado demostró que sólo BRF2 sobreexpresión es un factor pronóstico independiente de la supervivencia global desfavorable (p = 0,021).
Conclusiones
BRF2 es un prometedor biomarcador para identificar individuos con un mal pronóstico potencial y una posible diana para la terapia antiangiogénica en pacientes con NSCLC en estadio temprano
Visto:. Lu H, Tian H, Yue W, Li L, Li S, Qi L, et al. (2014) TFIIB relacionados con el factor 2 Más de expresión es un marcador pronóstico para la Etapa Inicial de células no pequeñas de cáncer de pulmón correlacionada con la angiogénesis tumoral. PLoS ONE 9 (2): e88032. doi: 10.1371 /journal.pone.0088032
Editor: Kapil Mehta, Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Agosto, 2013; Aceptado: 2 Enero 2014; Publicado: 11 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Lu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Proyecto apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.571.844), y la Fundación de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la provincia de Shandong (núm 2009GG10002007), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (núm ZR2009CM090), y el Wu Jie Ping Foundation (No. 320.6750.12393). Los patrocinadores no ha participado en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis e interpretación de datos; en la redacción del manuscrito; y en la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de pulmón es el más causa común de muerte por cáncer en hombres y mujeres en todo el mundo. Cada año, hay 1,35 millones de nuevos casos de cáncer de pulmón en el mundo [1]. Cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa aproximadamente el 75-80% de los casos de cáncer de pulmón [2] - [3]. A pesar de los avances en la detección temprana, la operación cura radical, y las modalidades terapéuticas multimodales en las últimas décadas, la tasa de supervivencia global a 5 años de cáncer de pulmón es sólo el 15% [4]. 30-40% de los pacientes en estadio I recaída después de la resección quirúrgica [5]. Por otra parte, los datos prospectivos aleatorizados demostraron que la quimioterapia adyuvante en el estadio IB No ha conseguido un beneficio significativo de supervivencia y se observa incluso un efecto perjudicial en el estadio IA [6]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevos biomarcadores que ayuden a seleccionar los pacientes con alta probabilidad de recurrencia del cáncer de pulmón y ofrecer un mejor pronóstico y tratamiento individualización.
ARN polimerasa (pol) III es responsable de la transcripción de pequeña, menos de 300 nucleótidos, ARNs no traducidos incluidos los microRNAs (miRNAs) [7] - [8]. Desde su descubrimiento, miRNAs han sido implicados en la patogénesis de diversos cánceres humanos, y la expresión de los genes miARN perfiles de tumores humanos tiene firmas específicas asociadas con el diagnóstico, la estadificación, la progresión, el pronóstico y la respuesta al tratamiento [9]. la transcripción precisa por la ARN pol III requiere TFIIIB, mientras BRF2 (factor 2 TFIIB relacionado con) es un componente de TFIIIB. La regulación de la pol III es parte integral de las funciones de control del crecimiento de la actividad TFIIIB RB, p53 y c-Myc, y está estrictamente regulada por Maf1, agentes quimiopreventivos, oncogenes y supresores de tumor [10] - [15]. BRF2 ha demostrado ser altamente sobreexpresado en una variedad de cánceres incluyendo gástrica, riñón y melanoma cáncer [16] - [17]. Recientemente, Lockwood et al. informó de que la sobreexpresión de BRF2 podría conducir la expresión de ARN pol III transcripciones, contribuyendo a la tumorigénesis escamosas carcinoma de células, y BRF2 ha sido identificado como un nuevo oncogén de linaje específico en pulmón carcinoma de células escamosas [18]. Sin embargo, a nuestro entender, la expresión de BRF2 y su correlación con factores clínico-patológicos y el pronóstico en NSCLC resecado quirúrgicamente no se han investigado.
En este estudio, hemos empleado el método inmunohistoquímico para examinar la expresión de proteínas BRF2 en muestras clínicas de NSCLC y se analizaron las relaciones de expresión BRF2 con características clínico variable y el pronóstico del paciente. Por otra parte, se evaluaron los factores pronósticos independientes que afectan a la supervivencia a largo plazo de los pacientes con CPNM.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El protocolo de estudio fue aprobado por los Comités de Ética de hospital de Qilu, y la adquisición de muestra de tejido se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los sujetos firmaron el consentimiento informado por escrito, y este procedimiento de consentimiento fueron aprobados por los Comités de Ética del Hospital Qilu.
Pacientes
Las muestras se obtuvieron de 107 pacientes que fueron diagnosticados con NSCLC entre de enero de 2004 y Octubre . 2006 en el Departamento de Cirugía Torácica, hospital Qilu, y tratados con lobectomía pulmonar más disección de ganglios linfáticos regionales.
Todos los pacientes no tenían la radioterapia o la quimioterapia preoperatoria, y no tenían metástasis a distancia. Los datos sobre sus características clínico y seguimiento estaban completas. Se tomaron 46 casos de muestras de tejido adyacentes de aproximadamente 0,5 cm de distancia desde el borde exterior de los tejidos de tumor de pulmón, y los otros 32 casos se tomaron más de 5 cm desde el margen del tumor de los tejidos pulmonares normales como controles negativos. Por RT-PCR y análisis de Western Blot, 12 emparejados pares de tumores de tejidos y muestras de tejidos cancerosos adyacentes se obtuvieron a partir de muestras de lobectomía pulmonar de los pacientes diagnosticados con NSCLC inmediatamente después de la cirugía entre SEP 2013 y Octubre de 2013 en nuestro departamento, y se almacenaron a -80 ° C.
Para todos los pacientes, el tipo histológico y el grado de diferenciación de las células cancerosas fueron reevaluados y determinado por el sistema de clasificación de la Organización Mundial de la Salud modificado en 2004, y se determinó postquirúrgica estadificación patológica basado en el sistema de clasificación internacional.
la inmunohistoquímica
se recogieron todas las muestras durante la cirugía, fija en un 10% de formalina y embebidos en parafina. Los tejidos se cortaron como 4 micras secciones en serie y, a continuación desparafinaron utilizando xileno y rehidratada a través de una serie de etanol al agua. la recuperación de antígenos de alta temperatura se llevó a cabo en tampón de citrato durante 25 min en un horno microondas. A continuación, la actividad de la enzima peroxidasa endógena fue bloqueada con 3% de H
2O
2 en metanol durante 20 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron a continuación con el conejo primario anti-BRF2 anticuerpo policlonal (Abcam) y de conejo anti-CD34 anticuerpo monoclonal (Santa Cruz Biotechnology) durante la noche a 4 ° C en una cámara de alta humedad, seguido de incubación durante 30 min a 37 ° C con anticuerpos secundarios biotinilados y complejo de estreptavidina-peroxidasa. Finalmente, se añadió una solución de 3,30-diaminobencidina, y los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina y montado con bálsamo neutral. Para los controles negativos, las secciones se incubaron con PBS en lugar de los anticuerpos primarios.
Evaluación de la expresión de la proteína y la densidad de microvasos BRF2
Para la tinción BRF2, el área dentro del área de diagnóstico fue anotado por tres independientes observadores y un método semi-cuantitativo reproducible que considera tanto la intensidad de tinción (0, negativo; 1, débil; 2, moderado y 3, fuerte) y el porcentaje de células teñidas positivamente (0, 0 a 5%; 1, 6-25 %; 2, 26-50%; 3, 51-75%; 4, & gt; 76%) se adoptó [19]. Para la evaluación de la tinción positiva de BRF2, al menos 3 secciones o áreas de cada muestra se deben anotó. puntajes en conflicto se resolvieron mediante la elección del valor coherente entre dos observadores o la media de las puntuaciones.
Para intratumoral densidad microvascular (MVD), microvasos se registraron mediante el recuento de CD34 células endoteliales teñidas positivamente como descripto anteriormente [20]. El recuento de microvasos (MVC) se determinó de forma independiente por dos patólogos en cada caso. Tres áreas representativas de la neovascularización densa fueron seleccionados bajo microscopio de baja potencia (10 × lente objetivo y la lente ocular × 10) y luego se contaron los vasos a mayor aumento (× 20 × lente objetivo y la lente ocular 20). Se registró el promedio de los recuentos en tres campos. Se excluyeron los grandes vasos con paredes gruesas y musculosas.
Se determinó el valor de corte para alta y baja expresión basado en un valor medido a través de la heterogeneidad análisis estadístico de log-rank con respecto a la supervivencia global [21]. El resultado del índice de tinción 4 fue elegida como punto de corte para la discriminación entre BRF2 baja y alta expresión. Y el índice de tinción score≥4 tumores con expresión de alto BRF2 definido, y el resultado del índice de tinción & lt; 4 indica una baja expresión BRF2. Los tumores con microvasos ≥42 fueron clasificados como de alto MVD, mientras que los tumores con microvasos & lt; 42 fueron clasificados como de bajo MVD
-PCR en tiempo real (RT-PCR)
Las muestras quirúrgicas se procesaron inmediatamente. después de la operación. ARN totales se extrajeron a partir de tejidos mediante el uso de Trizol reactivo (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se trataron con DNasa RQ1 RNasa libre (Promega) se sintetizó ADNc. Las expresiones de BRF2 y HIF-1α se cuantificaron por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) usando un sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad iQ5 con EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.) de acuerdo con el manual de instrucciones. El cebador para GAPDH y BRF2 son los siguientes: GAPDH, forward,5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,reverse,5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′;BRF2,forward,5′-GTGAAGCTCCTGGGACTGGAT-3′,reverse, 5'-GTATTTGGCTGGCACAGAAGG-3 '; Los resultados son la media ± error estándar promedio (SEM) de 3 experimentos repetidos y GAPDH se utilizó como una transcripción de referencia.
Western Blot análisis
Los tejidos frescos se lavaron tres veces con fosfato enfriada con hielo solución salina -buffered (PBS) y se lisaron en hielo en RIPA (ensayo de inmunoprecipitación radio) tampón (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) que contenía cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). La proteína de los tejidos o células se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF (GE Healthcare, EE.UU.). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en solución salina tamponada con Tris que contenía 0,1% de Tween-20 (TBST) durante 1,5 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron a continuación durante la noche a 4 ° C con anti-BRF2 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), o anti-GAPDH (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) anticuerpos. Seguido de anti-peroxidasa de rábano picante de conejo conjugado IgG, un kit ECL (GE Healthcare, EE.UU.) se utilizó para la detección.
El análisis estadístico
Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para evaluar la correlación entre BRF2 expresión y MVD, y las asociaciones entre la expresión BRF2 o MVD y los factores clínico-patológicos. método de Kaplan-Meier se utilizó para calcular las curvas de supervivencia, y el log-rank test fue utilizado para comparar la diferencia entre las supervivencias de los subgrupos de pacientes. Se utilizó un análisis de regresión multivariante de Cox para identificar los factores pronósticos independientes. Las diferencias entre grupos se consideraron significativas para el valor de P & lt; 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 13,0 software estadístico (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
BRF2 expresión en el CPNM
Se detectó la expresión de proteína BRF2 en los tejidos normales de pulmón, los tejidos no tumorales adyacentes y los tejidos tumorales por inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 1 A, se observó tinción nuclear difusa de proteína BRF2 en diferentes intensidades en las células cancerosas, pero BRF2 apenas se detectó en los tejidos pulmonares normales. Además, se observó algo de tinción en el citoplasma de las células cancerosas. Sin embargo, se observó ninguna correlación estadísticamente significativa entre la expresión de la proteína BRF2 y cualquier rasgo clínico-patológicas de los tejidos de NSCLC (P & gt; 0,05, Tabla 1). El valor medio de expresión BRF2 en 107 tejidos de NSCLC era 55,14%, significativamente mayor que en los tejidos adyacentes y los tejidos pulmonares normales (36,96% y 34,38%, respectivamente, P = 0,034 Tabla 2).
(A ): El patrón de expresión de BRF2 en tejidos de cáncer de pulmón. (A) La expresión de alto BRF2 en el adenocarcinoma de pulmón. (B): La expresión de alto BRF2 en los tejidos pulmonares de carcinoma de células escamosas. (C): la expresión BRF2 negativo en el adenocarcinoma de pulmón. (D): la expresión BRF2 negativo en los tejidos pulmonares de carcinoma de células escamosas. (E): microvasos intratumorales se tiñeron como marrón por el anti-CD34 anticuerpo monoclonal en tejidos de cáncer de pulmón (aumento x 400). (B): Análisis cuantitativa en tiempo real PCR de mRNA BRF2 en doce pares de tejidos de NSCLC y no cancerosos emparejados con GAPDH como control de carga en ambos paneles. (C): Los niveles de proteína de expresión BRF2 se evaluaron por Western Blot de tejido no canceroso emparejado y NSCLC
Para investigar el estado de la expresión génica BRF2 en el CPNM, se utilizó real. -Tiempo PCR para medir la expresión de ARNm en 12 pares de los tumores de cáncer primarios y muestras no cancerosas adyacentes. En comparación con sus muestras no cancerosas adyacentes, la expresión 8 de 12 CPNM había regulada de manera ascendente (fig. 1B y Fig. 1 C). Consistentemente, análisis de transferencia Western mostró que los 8 casos también tenían expresión de la proteína BRF2 mayor que los tejidos adyacentes.
Correlación entre MVD y los factores clinicopatológicos de NSCLC
intratumoral MVD se cuantificó contando endotelial CD34-positivo las células en tejidos de cáncer (Fig. 1A), y la intensidad de la tinción de MVD variaron ampliamente de 12 a 118 microvasos 200 de campo /× magnificación. Se encontró que el MVD se correlacionó significativamente con la profundidad de invasión (P = 0,013), pero no con otros factores clínico-patológicas de NSCLC (P & gt; 0,05; Tabla 1)
univariado y análisis de supervivencia multivariante
. de los 107 pacientes, 53 (49,5%) casos murieron dentro de los 5 años después de la operación, y la recaída del tumor desarrollaron durante el seguimiento en 57 (53,3%) pacientes. Los análisis de Kaplan-Meier comparó mediante la prueba de log-rank se utilizaron para calcular el efecto de los factores clínico-patológicos en la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad. El análisis univariante demostró que la alta MVD (40,0% vs. 63,8%, p = 0,019) y BRF2 sobreexpresión de la proteína (39,0% vs.64.6%; p = 0,004) predijeron de manera significativa disminución de la supervivencia global a los 5 años. Además, la alta MVD (65,0 vs. 38,3%, p = 0,008) y BRF2 sobreexpresión de la proteína (62,7% vs. 41,7%, p = 0,006) indicaron un mayor riesgo de recurrencia (Fig. 2); Además, el análisis multivariado identificó BRF2 sobreexpresión (P = 0,036) y MVD (P = 0,034) como factores pronósticos independientes para la supervivencia libre de progresión. Sin embargo, sólo BRF2 sobreexpresión conservó su importancia como factor pronóstico independiente para la general, así como la supervivencia libre de progresión (p = 0,021, Tabla 3 y Tabla 4).
Para explorar la correlación de la sobreexpresión BRF2 con MVD, hemos examinado aún más la supervivencia de las diferencias de los pacientes estratificados de baja y alta MVD MVD según el estado de la expresión de proteínas BRF2. Para los pacientes sin BRF2 sobreexpresión, se detectó una supervivencia muy significativa inferiores global (SG) y la supervivencia libre de enfermedad (PFS), respectivamente, en pacientes con alto MVD en comparación con los pacientes con baja MVD (P = 0,003 para el sistema operativo y P = 0,001 para SSP, la Tabla 5). Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la supervivencia entre bajo MVD grupo y el grupo de alto MVD para los pacientes con BRF2 sobreexpresión (P & gt; 0,05, Tabla 5). Y el análisis estadístico demostró que no era significativamente más MVD en los tumores con expresión de proteínas BRF2 alta que la de aquellos con baja expresión de proteínas BRF2 (P & lt; 0,001, prueba de Mann-Whitney; Fig. 3).
Mann WhitneyUtest demostró que los tumores con elevada expresión de proteínas BRF2 mostraron significativamente mayor MVD intratumoral de tumores con baja expresión de proteínas BRF2 (P & lt; 0,001).
además, se analizó el significado pronóstico de la proteína en BRF2 selectiva los subgrupos de pacientes estratificados según el tipo histológico de NSCLC. El análisis univariante demostró que la tasa de supervivencia global a 5 años de los pacientes con proteína BRF2 alta expresión fue significativamente menor que la de los restantes pacientes entre carcinoma de células escamosas, y también encontró una tendencia en el adenocarcinoma, a pesar del análisis estadístico no tiene sentido ; (P = 0,007 y P = 0,130, respectly; Fig. 4)
(a): el carcinoma de células escamosas.. (B):. Adenocarcinoma
Discusión
La capacidad de proliferar sin control es la característica dominante de muchos tipos de células cancerosas. Evaluación de los factores pronósticos moleculares es un área importante de la investigación del cáncer. proteína BRF2 está codificada por un gen localizado en el cromosoma 8p12 [22]. Varios estudios han demostrado que BRF2 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer [23] y sugieren el papel oncogénico de BRF2. Sin embargo, pocos estudios han investigado la expresión y la importancia de BRF2 en el CPNM, especialmente para el pronóstico de NSCLC.
En este estudio, los resultados mostraron que no hubo correlación significativa entre la expresión BRF2 y las características clinicopatológicas de NSCLC (p & gt; 0,05). Sin embargo, la alta MVD se asoció significativamente con el estado T en el CPNM, pero no asociada con la edad, el sexo, el tabaquismo, la histología y la diferenciación. En cierta medida, T etapa es un proceso crítico del desarrollo del tumor, y la diferencia en la correlación entre MVD y características clinicopatológicas puede reflejar que la densidad de los microvasos es un aspecto importante del desarrollo del tumor. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la expresión entre BRF2 adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas de pulmón por tinción inmunohistoquímica.
En particular, nuestros resultados mostraron que la sobreexpresión de la proteína BRF2 era común en los tejidos CPCNP en estadio temprano y se asocia significativamente con el aumento de la actividad angiogénica mide como MVD intratumoral, lo que sugiere que BRF2 juega un papel crucial en la tumorigénesis NSCLC por la inducción y /o promoción de la angiogénesis tumoral. Aunque varios factores de crecimiento han sido demostrado que regulan la angiogénesis y el desarrollo vascular, se sabe poco sobre el mecanismo de regulación complejo de la expresión génica y la traducción [24]. Nuestros resultados ponen de manifiesto el papel potencial de BRF2 en la angiogénesis tumoral.
Nuestro análisis de supervivencia demostró que la alta MVD y BRF2 sobreexpresión de la proteína predicha significativamente menor supervivencia global a 5 años y la mayor tasa de recurrencia. Un análisis más detallado utilizando el modelo de regresión de Cox confirmó que la expresión BRF2 y MVD fueron factores independientes en la predicción de la supervivencia libre de progresión para los pacientes con CPNM, lo que sugiere que la proteína BRF2 y MVD pueden ser potenciales factores pronósticos de la recaída de los pacientes con CPNM en estadio temprano. Sin embargo, en el análisis multivariante, la única expresión BRF2 podía predecir de forma independiente y significativamente la supervivencia global a los 5 años, pese a que una alta MVD se asoció significativamente con la recidiva tumoral. Nuestros datos indican que la sobreexpresión BRF2 tuvo una enorme influencia en el sistema operativo y la SSP, mientras MVD mostró un efecto significativo en el sistema operativo y la SSP sólo en los pacientes sin BRF2 sobreexpresión.
En conjunto, nuestros datos apoyan la hipótesis de que BRF2 proteína sobre-expresión es común en las primeras etapas del NSCLC y se correlacionó significativamente con la angiogénesis tumoral y la recaída. Por otra parte, la sobreexpresión BRF2 es un factor pronóstico independiente para los pacientes con CPNM.