Extracto
Antecedentes
Los estudios anteriores han demostrado que las células T-menos diferenciadas son ideales para terapia adoptiva de células T de transferencia (ACT) y que CH296 de fibronectina (FN-CH296) junto con anti-CD3 resultaron en células cultivadas que contienen cantidades más altas de células T menos diferenciadas. En esta fase I de ensayos clínicos, nos basamos en los resultados anteriores, mediante la evaluación de la seguridad y eficacia de FN-CH296 estimuló la terapia de células T en pacientes con cáncer avanzado.
Métodos
Los pacientes se sometieron fibronectina CH296 se evaluó la terapia de células T estimulada hasta seis veces cada dos semanas y la actividad antitumoral de la seguridad y el ACT. Con el fin de determinar la función inmune, los niveles de citoquinas en sangre total y el número de células T reguladoras periféricas fueron analizados antes de actuar y en el seguimiento.
Resultados
Células Transferidas contenían numerosas menos diferenciado las células T en gran medida representados por CD27 + CD45RA + CD28 + o células CD45RA +, lo que representó aproximadamente el 65% y el 70% del total, respectivamente. No se observaron acto relacionado toxicidades graves o inesperadas. La tasa de respuesta entre los pacientes fue de 22,2% y la tasa de control de la enfermedad fue de 66,7%.
Conclusiones
Los resultados obtenidos en este ensayo de fase I, indican que el FN-CH296 estimuló la terapia de células T era muy bien tolerada con un nivel de eficacia que es bastante prometedor. También suponemos que la expansión de células T usando CH296 es un método que se puede aplicar a otras terapias basadas en células T-
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UMIN UMIN000001835
Visto:. Ishikawa T, Kokura S, Enoki T, Sakamoto N, Okayama T, Ideno M, et al. (2014) Fase I de ensayos clínicos de la terapia celular de fibronectina estimulada CH296-T en pacientes con cáncer avanzado. PLoS ONE 9 (1): e83786. doi: 10.1371 /journal.pone.0083786
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 14 Julio, 2013; Aceptado: 5 Noviembre 2013; Publicado: 31 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Ishikawa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por la JSPS KAKENHI la subvención Número 23590891. los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. No se recibió financiación externa adicional para este estudio
Conflicto de intereses:. Takeshi Ishikawa, Satoshi Kokura, Tetsuya Okayama, y Toshikazu Yoshikawa tienen una afiliación con un departamento de donación con fondos de Takara Bio Inc. Esto no altera los autores 'adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
adoptiva de transferencia de células T (ACT) es actualmente una de las pocas inmunoterapias que pueden inducir respuestas clínicas objetivas en una significativa número de pacientes con tumores sólidos metastásicos [1]. Las propiedades intrínsecas de la población de ACT, en particular su estado de diferenciación, se dice que son cruciales para el éxito de los enfoques basados-ACT [2] - [5]. células T menos diferenciadas tienen un mayor potencial proliferativo y son menos propensas a la apoptosis que las células más diferenciadas. Menos células T diferenciadas expresan receptores tales como el receptor de IL-7 α-cadena (IL-7Rα), por lo tanto, estas células tienen el potencial de proliferar y ser completamente activado en respuesta a citoquinas homeostáticas, tales como IL-7 [6]. Los resultados de estudios clínicos previos demostraron una correlación significativa entre la regresión del tumor y el porcentaje de ACT persistente transferido células en la sangre periférica [3], [7]. Estos hallazgos sugieren que la persistencia y potencial proliferativo de las células T transferidas juegan un papel en la respuesta clínica y que las células T-menos diferenciadas son ideales para la terapia de transferencia de ACT. El uso de un protocolo de rápida expansión estándar, las células T de ACT son generalmente expandido con una alta dosis de anticuerpo IL-2 y CD3-específico durante aproximadamente 2 semanas. Las células T que utilizan este protocolo inducen la diferenciación de células T progresiva hacia un estado efector tarde. Sin embargo, aunque la IL-2 es esencial para la persistencia y el crecimiento de células T sino que también tiene cualidades deseables, tales como su capacidad para promover la diferenciación terminal de las células T [8]. Como resultado, el procedimiento de los resultados que se utilizan actualmente en fenotípicas y funcionales cambios en las células T que los hacen menos óptimo para la mediación de respuestas antitumorales in vivo. A la luz de esto, el desarrollo de nuevos métodos para obtener células T menos diferenciadas es crucial para la mejora de las terapias actuales T-basados en células para que los pacientes pueden desarrollar una respuesta inmune positiva de larga duración.
Se ha informado de que la fibronectina (FN), una importante proteína de la matriz extracelular, las funciones no sólo como una molécula de adhesión, sino también como un inductor de señal a través de la unión a integrinas expresa en las células T [9], [10]. FN actúa junto con anti-CD3 para inducir la proliferación de células T, que se cree que depende de la integrina de activación muy tardía antígeno-4 (VLA-4) /interacciones CS1 [11], [12]. fragmento de fibronectina humana recombinante (FN-CH296, RetroNectin) ha sido ampliamente utilizado para la terapia génica retroviral para mejorar la eficiencia de transferencia génica. FN-CH296 También se informó de que ser capaz de estimular el crecimiento de células T periféricas de la sangre in vitro cuando se utiliza junto con anti-CD3 y IL-2. Anti-CD3 /IL-2 /FN-CH296-estimularon células T contenían una mayor cantidad de células T menos diferenciadas y persistencia in vivo de estas células fue significativamente mayor que las células estimuladas por otros métodos [13]. Estas observaciones nos llevaron a aplicar la estimulación mediada por NF-CH296 a las células T fenotipo menos diferenciadas para generar células T 'aptos' [2], [14] que son ideales para el ACT. De esta manera, se procedió a evaluar la seguridad y eficacia de la terapia de células T estimuladas-FN-CH296 en pacientes con cáncer avanzado.
Métodos
El protocolo para este ensayo y el apoyo lista de verificación de tendencia se disponible como información de apoyo; consulte Lista de comprobación S1 y el Protocolo de S1.
Diseño del estudio
El protocolo clínico fue aprobado por el comité de ética de la Prefectura de Kyoto Universidad de Medicina y se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y las directrices éticas para Investigación clínica (Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón). El objetivo principal de esta fase I de ensayos clínicos fue evaluar los perfiles de seguridad y eventos adversos derivados de la terapia de células T estimuladas-FN-CH296 en pacientes con cáncer avanzado. Nuestro objetivo secundario fue evaluar la actividad antitumoral de la terapia ACT. Este estudio se realizó como un diseño estándar 3 + 3 la fase I, que investigó la toxicidad limitante de la dosis (TLD) que tiene lugar durante un período de 28 días después de la segunda infusión de linfocitos cultivados. DLT se definió como grado ≥3 para cualquier acontecimiento adverso relacionado con la infusión de células cultivadas. Se utilizó un diseño de titulación acelerada para evaluar la seguridad del número de linfocitos adoptivos a 1 × 10
9 (cohorte 1), 3 × 10
9 (cohorte 2), y 9 × 10
9 ( cohorte 3) por persona. Si no se observaron TLD en la primera cohorte de pacientes, una segunda cohorte de 3 pacientes fueron tratados en la siguiente dosis más alta. Si DLT se observó en al menos un paciente, la cohorte se amplió a 6 pacientes. Si se observaron ≥ 2 TLD en la cohorte inicial o ampliado, no hay la escalada de dosis adicionales se realizaron y se consideró la dosis máxima tolerada (DMT) que se ha rebasado. No hubo aumento de la dosis intra-paciente en este estudio.
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Este estudio se ha registrado en el Registro de Ensayos Clínicos umin con el identificador UMIN000001835
Los pacientes
Los pacientes incluidos en este ensayo cumplido los siguientes criterios de elegibilidad:. Histológicamente o citológicamente confirmado cáncer de esófago, cáncer gástrico, colorrectal cáncer, cáncer de páncreas, cáncer de las vías biliares o cáncer de pulmón no microcítico; enfermedad residual después del tratamiento estándar con otras opciones de tratamiento curativo disponible; No hay planes para recibir quimioterapia que no sea profármacos fluorouracilo orales, terapia de radiación o modificadores de la respuesta biológica; entre 20 y 80 años de edad; el estado del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) el rendimiento de 2 o menos; una esperanza de vida de al menos tres meses; al menos cuatro semanas desde su última quimioterapia o radioterapia; . Hematológica y hepática función renal y cardíaco adecuado,, España
La exclusión fueron los siguientes criterios: presencia de infección no controlada; antecedentes de enfermedad autoinmune o de hipersensibilidad grave, la presencia de complicaciones graves, como angina inestable o infarto de miocardio dentro de los seis meses de la aparición del cáncer, neumonía intersticial o fibrosis pulmonar con los hallazgos radiológicos, la presencia de ascitis marcadas o derrame pleural, íleo, otra enfermedad maligna activa , deterioro mental grave, embarazo o lactancia, y un historial médico de hipersensibilidad grave.
Preparación de las células T estimuladas-FN-CH296
la sangre periférica (50-70 ml) se tomó de pacientes con cáncer. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fueron separados utilizando Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare, Tokio, Japón). Posteriormente, 3-8 × 10
7 células se resuspendieron en medio de cultivo en una bolsa CultiLife215 (Takara Bio, Otsu, Japón) que fue pre-recubierto con tanto anti-CD3 y FN-CH296 (RetroNectin®, Takara Bio), que es un fragmento recombinante de la fibronectina humana. Las células se cultivaron en un medio libre de suero, GT-T551 (Takara Bio), que se complementó con 0,6 a 1,2% de plasma autólogo inactivado por calor y 200 U /ml de IL-2 recombinante (Proleukin; NovartisPharma, Nürnberg, Alemania) . En el día 4, las células se transfirieron a una bolsa de CultiLife Eva (Takara Bio), y medio GT-T551 que fue suplementado con 0,6 a 1,2% de plasma autólogo inactivado por calor y se añadió 200 U /ml de IL-2. En el día 7, se añadió medio GT-T551 que contiene 200 U /ml de IL-2. El día 10, se recogieron las células y se resuspendieron en 50-90 ml de solución criopreservados que consiste en CP-1 (Kyokutou Seiyaku, Tokio, Japón), RPMI 1640 (Kohjin BIO, Sakado, Japón) y albúmina de suero humano (Albuminar; CSL Behring, PA, EE.UU.) para crear el producto final de células. Con el fin de obtener el número determinado de linfocitos adoptivos, los pacientes en las cohortes 1 y 2 necesitan un cultivo de linfocitos de una sola vez, y los pacientes en la cohorte 3 necesitan tres cultivos de linfocitos. . Linfocitos cultivados se congelaron y se almacenaron a -80 ° C hasta el momento de la transfusión
Antes de la infusión de los pacientes, los productos de células se evaluaron para & lt; $ & gt; \\ raster (80%) = "rg1" & lt; $ & gt; viabilidad por azul de tripano ensayo de exclusión & lt; $ & gt; \\ raster (80%) = "rg2" & lt; $ & gt; la esterilidad por el BacT /ALERT (bioMérieux, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.) sistema de detección microbiológica, y & lt; $ & gt; \\ trama (80%) = "RG3" & lt; $ & gt; endotoxina mediante un ensayo LAL cinético turbidimétrico. Ambas pruebas de esterilidad y de endotoxinas fueron contratados para FALCO Biosystems (Kyoto, Japón). Además, los marcadores fenotípicos de una pequeña alícuota de los productos finales se examinaron después de la congelación-descongelación. Por lo tanto, estos marcadores se consideran casi similares a los de las células infundidas.
Whole citoquinas ensayos en sangre
Función inmunológica fue probada usando sangre venosa obtenida de los pacientes antes de la administración con células cultivadas (línea de base) y durante el seguimiento que se produjo 4 semanas después de la 2
ª y 6 de la infusión de células cultivadas (Fig. 1). Los métodos para la cuantificación de la producción de IFN-α en sangre humana total se han descrito anteriormente [15]. Brevemente, la sangre periférica heparinizada se cultivó con virus Sendai (500 HA /ml) dentro de las 8 h después de tomar la muestra de sangre. La mezcla de virus en la sangre se incubó a 37 ° C durante 20 h, y la actividad de IFN-α en los sobrenadantes se cuantificó mediante un bioensayo. Otras citocinas se cuantificaron según los procedimientos descritos anteriormente [16], [17]. sangre entera heparinizada se diluyó 4 veces con medio esencial mínimo de Eagle (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Tokio, Japón) y se estimularon con fitohemaglutinina-P (PHA-P, 25 mg /ml, Wako Pure Chemical Ind., Osaka, Japón ). Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 48 h, después de lo cual los sobrenadantes se recogieron por centrifugación a 800 ×
g
durante 10 min, y después se almacenaron a -80 ° C hasta que fueron necesarios para el análisis. Los niveles de citocinas en las muestras se midieron con un sistema de matriz de citocina multiplex Bio-Plex (; Bio-Rad Laboratories, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. El /kit de talón Multiplex Th1 Th2 (Bio-Rad Laboratories) mide las siguientes citocinas: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, factor de necrosis tumoral (TNF ) -α, IFN-γ, y de granulocitos y monocitos factor estimulante de colonias (GM-CSF). adquisición y análisis de datos se realizaron con el software Administrador de Bio-Plex, versión 5.0. Dado que los niveles de citoquinas sin PHA-P-estimulación eran extremadamente baja (datos no mostrados), sólo se evaluaron las personas con PHA-P-estimulación en este estudio.
Los sujetos recibieron la terapia de células T estimulada por CH296 en los días 1 y 15. Se llevaron a cabo evaluaciones de seguridad durante las primeras 6 semanas de tratamiento. Los pacientes que deseaban continuar con el tratamiento recibido hasta otros 4 tratamientos cada 2 semanas. Para probar la función inmune, se obtuvo sangre venosa de los sujetos antes del inicio de la terapia (línea de base) y durante un seguimiento de lo que ocurrió a las 4 semanas (2 tratamientos) y después de 6 administraciones de células cultivadas.
Análisis de citometría de flujo
Las células se tiñeron con FITC, ficoeritrina (PE) -, ficoeritrina-TexasRed (ECD) -, o ficoeritrina-cianina (PC5) conjugado con mAb específico para CD3, CD4, CD8, CD27 , CD45RA, CD56, HLA-DR (Beckman Coulter, Marsella, Francia), CD28, NKG2D (eBioscience, CA, EE.UU.) y CCR7 (R & amp; D systems, MN, EE.UU.). Para determinar la células T reguladoras (Treg), se utilizaron los siguientes anticuerpos: PE-Cy ™ 5 de ratón anti-humano CD4, CD25 PE de ratón anti-humano, y Alexa Fluor ™ 488 de ratón anti-humano Foxp3 (BD Biosciences Pharmingen, CA , ESTADOS UNIDOS). Las células se incubaron a 5 ° C durante 30 min, después se lavó con solución salina tamponada con fosfato y se analizaron por Cytomics FC500 (Beckman Coulter). Para la detección de Foxp3, las células se permeabilizaron durante la noche en Fix /Perm tampón (eBioscience) y luego teñidas con anti-Foxp3. adquisición y análisis de datos se realizaron con el software CXP, versión 2.2 (Beckman Coulter). El flujo de datos se analizó mediante el método siguiente: puertas de linfocitos se determinaron visualmente en gráfico de puntos de FSC /SSC después de lo cual puertas con una región positiva de CD3, HLA-DR se determinaron mediante la tinción de células con anticuerpos de control de isotipo. Los otros (CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD56, CD28, NKG2D y CCR7) se determinaron visualmente en un punto de histograma o gráfico de puntos de valle. Tregs fenotipo se definió como células CD4 + CD25 + Foxp3 +.
Tratamiento Estudio
Las células congeladas se descongelaron rápidamente a 37 ° C en un baño de agua con agitación suave. Los pacientes fueron infundidas por vía intravenosa durante 30 minutos de forma ambulatoria en el Hospital de la Universidad de Kyoto Prefectural. Los pacientes fueron controlados por los efectos tóxicos agudos durante al menos una hora después de la infusión antes de que fueron dados de alta. linfocitos cultivados se administraron en los días 1 y 15, y que llevan a cabo la vigilancia inmune para evaluar la seguridad del tratamiento de 4 semanas después de la segunda transferencia celular adoptiva estaba hecho. Dos transferencias suelen ser suficientes para evaluar la seguridad de los nuevos ACT sin embargo ya otros tratamientos pueden ser beneficiosos, los pacientes podrían recibir hasta cuatro más transferencias cada dos semanas a menos que tuvieran efectos tóxicos inaceptables, progresión de la enfermedad, o se retiraron el consentimiento (Fig. 1).
toxicidad y la eficacia de Evaluación
Seguridad y toxicidad se determinó sobre la base de entrevistas a pacientes regulares, pruebas de laboratorio y exámenes físicos. Los efectos tóxicos fueron controlados de acuerdo con los criterios del National Cancer Institute (NCI Common Toxicity-CTC versión 3.0). La relación entre la transferencia de células adoptivas y la toxicidad se evaluó sobre la base de las características de los efectos secundarios ACT en comparación con los de profármacos fluorouracilo orales. Se evaluó la actividad
antitumoral basado en la respuesta real del tumor. Para la evaluación de la eficacia, la tomografía computarizada (CT) se realizó antes del inicio del tratamiento ACT, cuatro semanas después de la 2
nd infusión de linfocitos cultivados y a partir de entonces, cada 4 semanas durante tres meses. Las respuestas se definen de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST versión 1.0) criterios.
Análisis estadístico
Un Wilcoxon test fue utilizado para comparar los resultados antes y después del tratamiento. método de coeficiente de correlación de Spearman se utilizó para evaluar una posible asociación lineal entre dos variables continuas. Valores de p inferior a 0,05 se consideraron significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS (versión 20) para Windows (IBM Corporation, Illinois, EE.UU.).
Resultados
Características de los pacientes
desde mayo 2009 a diciembre de 2009 , diez pacientes con cáncer se inscribieron en este estudio. Un paciente discontinuó debido a un rápido deterioro de su estado general antes de comenzar el tratamiento. Así, nueve pacientes fueron elegibles para el estudio y asignados a tres grupos de tratamiento. características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla 1. La mediana de edad fue de 60 años (rango 43 a 75), y todos los pacientes tuvieron una puntuación funcional ECOG de 0 ó 1. Tres pacientes tenían cáncer colorrectal, dos tenían cáncer de las vías biliares, y un paciente cada uno tenía cáncer de páncreas, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular y cáncer de pulmón. De los nueve pacientes, siete habían recibido S-1 (una fluoropirimidina oral) monoterapia que se combinó con la terapia de ACT. Todos los pacientes fueron sometidos a dos infusiones de células cultivadas, y ocho pacientes que deseaban continuar con el tratamiento completaron otras 4 infusiones de células T. De los nueve pacientes, uno (paciente no. 9) no desee continuar el tratamiento, por lo que recibió dos infusiones de células cultivadas en total.
fenotipo de las células transferidas
Las células expandido una media de 394,0 veces (intervalo, 292.5-554.5 pliegues) durante el periodo de cultivo de 10 días. La viabilidad de células cultivadas media fue de 97,4% (intervalo 95,7 a 98,5%). Los cambios en el fenotipo de la superficie celular después del cultivo se muestran en la Figura 2. Antes de la estimulación, las PBMC contenía 45% de células CD4 + y aproximadamente 25% CD8 + células. La relación de células CD8 aumentó de manera significativa a casi el 60% después del cultivo, mientras que la proporción de células CD4 + mostró una disminución. La proporción de células CD27 + CD45RA + y CD28 + CD45RA + que se expresó en las células T menos diferenciados, aumentó de manera significativa a casi el 60% después del cultivo, mientras que no hubo cambio significativo en la proporción de células CCR7 + CD45RA +. Tanto CD3 + HLA-DR + y CD8 + NKG2D + población de células que son marcadores de activación de linfocitos, un aumento significativo después del cultivo. Por otro lado, CD3-CD56 + (células NK) y CD3 + CD56 + población de células (células NKT) fueron insignificantes después de cultivo (media de 0,73% y 2,16% respectivamente). El fenotipo de las células transferidas de cada caso se muestra en la Tabla 2. La gran mayoría de células transferidas eran CD3 positivo (98,1% como media), y había muy pocas células CD56-CD3 + (0,73% como media). Las proporciones de CD4 +, CD8 + y células CD8 + NKG2D + en células transferidas fueron 36,2%, 60,3% y 53,7%, respectivamente. En cuanto a fenotipo de células T menos diferenciado, las células CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA + y CCR7 + CD45RA + fueron 59,5%, 60,0% y 22,4%, respectivamente. La proporción de estos fenotipo de células T menos diferenciado fue marcadamente diferente entre los pacientes, en particular, la proporción en la paciente 2 era considerablemente bajo (Tabla 2). Ratios de CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA + y CCR7 + CD45RA + transfirieron células (después del cultivo) fuertemente correlacionados con los de PBMCs (antes del cultivo) (Fig. 3).
PBMCs se estimularon con anti-CD3 /CH-296. En el día 10, se recogieron las células cultivadas para la transfusión. fenotipos de la superficie celular de PBMC o células cultivadas se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados promedio de nueve sujetos se muestran. En todos los paneles, las líneas representan la media o desviación estándar. * P & lt; 0,05
La comparación se hace en términos de marcadores de la superficie celular (es decir CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45RA +, CCR7 + CD45RA +)
Toxicidad
Los eventos adversos reportados en este estudio se muestran en la Tabla 3. Un paciente, que se administró S-1, con experiencia neutropenia de grado 3 sin embargo, se consideró este episodio estar relacionada con S-1 y no actuar. Grado dos o toxicidades hematológicas de nivel inferior se observaron principalmente en pacientes administrados con S-1, y estas toxicidades hematológicas fueron en su mayoría transitoria. No se observaron eventos no hematológicos incluyendo la fatiga y anorexia, pero éstos eran todos leve. No se observaron toxicidades graves o inesperados relacionados con ACT. Por lo tanto, no se observó DLT en esta fase I del estudio.
Resultados clínicos
Un paciente (N ° 4) alcanza una respuesta completa (RC). El paciente sufría de CR recurrencia de los ganglios linfáticos después de una operación de cáncer rectal y fue tratada con mFOLFOX6 como quimioterapia de primera línea. Posteriormente, se inicia tratamiento con capecitabina como quimioterapia de segunda línea, pero la metástasis de los ganglios linfáticos intrapelvic fue detectado por FDG-PET. Después, el paciente recibió terapia combinada con ACT S-1. Tres meses después de 6 infusiones de células T cultivadas, la lesión desapareció por completo. No.8 paciente experimentó una respuesta parcial (PR). Tenía cáncer de las vías biliares refractaria, y se trató con GEM como quimioterapia de primera línea seguida por GEM como 2
ª línea de quimioterapia /S-1. Sin embargo, 17 meses después de iniciar la quimioterapia, el tamaño del tumor primario se incrementó y se detectaron metástasis en la vértebra cervical. A continuación, se sometió a la terapia combinada con ACT S-1. Dos meses después de 6 infusiones de ACT, el tamaño del tumor primario en el hígado se redujo en un 35% y metastásicos lesiones en las vértebras cervicales desaparecido por completo por la FDG-PET.
De los 9 pacientes, un (11,1% ) exhibió CR, un (11,1%) tenía PR, 4 (44,4%) tenían enfermedad estable (SD), y 3 (33,3%) tenían enfermedad progresiva (PD) (Tabla 4). La tasa de respuesta fue del 22,2% (95% intervalo de confianza (IC) del 2,8% 60,0?) Y la tasa de control de la enfermedad (DCR; CR + PR + SD) fue de 66,7% (IC del 95%: 29,9 - 92,5%)
Vigilancia inmune
Para determinar la respuesta inmune en los pacientes que recibieron ACT novela, ensayos de citoquinas en sangre total y el análisis de Treg periférica, lo que podría ser útil en el control inmunológico [18] - [20], se efectuara a partir de sangre venosa obtenida de pacientes. No hubo ningún cambio notable en los niveles de citoquinas en sangre total (Fig 4A.) En pacientes después de que fueron infundidos con células cultivadas; sin embargo, hubo una disminución de la IL-4, IL-5 e IL-13 después del tratamiento. Los niveles de IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-12 y GM-CSF en la cohorte 3 aumentó después del tratamiento; en particular, los niveles de IFN-γ, IL-12 y GM-CSF aumentó un múltiplo de 10 o más veces. A continuación, se evaluaron los niveles de citoquinas en sangre total de acuerdo a la respuesta objetiva del tumor. Los niveles de IFN-γ, IL-2, IL-12 y GM-CSF en pacientes con PR /CR aumentó más de dos veces después del tratamiento, mientras que los niveles en pacientes con SD o PD disminuyeron o no cambiaron significativamente después del tratamiento ( la Fig. 4B).
la media de los niveles de citoquinas en sujetos en cada cohorte (a) y los niveles de las distintas respuestas tumorales (B) se muestran.
en cuanto a las células t reguladoras, tanto en el número y la proporción de estas células en la sangre periférica no mostraron cambios significativos después del tratamiento cuando fueron evaluados de acuerdo con cohortes o de la respuesta del tumor (Fig. 4A, B).
Discusión
los resultados presentados en este estudio indican que la terapia de células T estimuladas-FN-CH296 fue muy bien tolerado en nuestra muestra del paciente. Sin significativo grado ACT relacionada con 3 o 4 eventos adversos en cualquier paciente y el ACT producen regresión del tumor en 2 pacientes: CR en un paciente con cáncer de recto y PR en otro con cáncer de las vías biliares. La tasa de respuesta fue del 22,2% y el 66,7% era DCR. A pesar del tamaño de la muestra, estos resultados son prometedores.
Los resultados de los estudios del ratón y los ensayos clínicos anteriores demostraron que las células T-menos diferenciadas pueden ser la población óptima para inmunoterapias basadas en ACT debido a su persistencia in vivo , alto potencial proliferativo, receptividad a las señales homeostáticos y coestimuladoras, su homing a los tejidos linfoides secundarios y su capacidad para secretar IL-2 [2] - [5]. Sumado a esto, Yu et al. han informado de que FN-CH296 actuando con anti-CD3 inducir la proliferación de células T. Estos datos sugieren que eso es la estimulación FN-CH296 /anti-CD3 puede ser una forma eficaz de generar un gran número de células T-menos diferenciada adecuada para ACT resulta en una mayor y más larga persistencia in vivo [13].
CD45RA , CD27, CD28, y CCR7 son conocidos por ser altamente expresado en las células T menos diferenciadas. Sobre la base de estudios de infecciones virales humanas, un modelo lineal de la diferenciación de las células T se ha propuesto que las células CD27 + CD28 ingenuos + CD45RA + progresan a través de una temprana fenotipo antígeno CD27 + CD28 experimentado + CD45RA y luego procede a una CD27 + CD28-CD45RA /+ fenotipo intermedio y finalmente a CD27-CD28-CD45RA +/- tarde fenotipo antígeno-experimentado. Este movimiento lineal conduce a un aumento en el potencial citotóxico y una reducción en la proliferación celular [21]. CD27 y CD28 son moléculas coestimuladoras que actúan en concierto con receptor de células T (TCR) para soportar la expansión de células T [22]. Se ha sugerido que las células T CD28 que expresan secretan IL-2 e inducen moléculas antiapoptóticas [23]. En los últimos tiempos, el papel de la expresión de CD28 en los ensayos clínicos basados en la ACT ha sido cada vez más atención y se están haciendo investigaciones más detalladas. Análisis de persistir y no persistente TIL clones indican la supervivencia preferencial de los clonotypes expresan altos niveles de CD28, lo que implica una ventaja de supervivencia para las células T transferidas con CD28 + fenotipo menos diferenciado [4], [5]. CD27 también puede aumentar la proliferación de células T inducida por TCR y es necesario para la generación y mantenimiento de las células T de memoria in vivo [24]. Hay evidencia de que la frecuencia de células T que expresan CD27 aumenta gradualmente después de ACT y puede estar asociada con el mantenimiento a largo plazo de un número estable de células T específicas de tumor en los pacientes que respondieron [25]. En esta fase I de ensayos clínicos, las frecuencias de las células CD27 + CD45RA + y CD28 + CD45RA + aumentaron significativamente después del cultivo y su población en las células transferidas se acerca al 60%. Por otro lado, la frecuencia de células CCR7 + CD45RA +, que también se expresan en células T menos diferenciados, no cambió después del cultivo por razones desconocidas. Las proporciones de las células T fenotipo menos diferenciadas (es decir, CD27 + CD45 +, CD28 + CD45RA + y CCR7 + CD45RA + células) en células transferidas diferían en gran medida para cada paciente. Se encontró una fuerte correlación positiva entre las proporciones de CD27 + CD45RA + (ρ = 0,717, p = 0,037), CD28 + CD45RA + (ρ = 0,717, p = 0,037), CCR7 + CD45RA + (= 0,733, p = 0,031 rho) las células en células transferidas y los de PBMCs (antes del cultivo). Es necesario mejorar o encontrar nuevos métodos que pueden generar de manera eficiente un gran número de células T menos diferenciados, incluso en los casos en los que hay pocas células T-menos diferenciadas. De acuerdo con informes anteriores [13], se encontró que la estimulación con FN-CH296 /anti-CD3 preferentemente expandió las células CD8 + en este estudio. En general se cree que el mecanismo tumoricida efector predominante es el efecto citotóxico de matar de las células CD8
+ células T, sin embargo, a pesar de las investigaciones realizadas hasta la fecha, el impacto de la proliferación preferencial de las células T CD8 en la inmunoterapia del cáncer todavía necesita mucho más lejos investigación.
estudios anteriores han demostrado que el IFN-γ juega un papel importante en la inmunoterapia del cáncer y la expresión de IFN-γ de las células T se considera que está altamente correlacionado con el éxito terapéutico. También hemos demostrado que el ensayo de los niveles de IFN-gamma de sangre entera era un método eficiente para la evaluación de la respuesta clínica a inmunoterapias de cáncer [19] [20]. En este estudio, los niveles de sangre entera IFN-gamma en cohorte 3 aumentaron hasta 10 o más veces después de 6 infusiones de células cultivadas. sangre niveles de IFN-gamma enteros en casos CR PR o aumentaron más de dos veces, mientras que los de los casos de EP o SD vio ningún aumento significativo después del tratamiento. El hallazgo en nuestro estudio previo [20] que el aumento de los niveles de IFN-γ en sangre entera después de un ACT se asoció de forma independiente a la supervivencia global en pacientes con cáncer hace hincapié en la relevancia de los resultados obtenidos en este estudio.
Si bien no significativa correlación entre el número de células T menos diferenciadas infundidas y los niveles de IFN-γ de sangre entera no se confirmó probablemente debido a los pequeños tamaños de muestra, suponemos que las células T-menos diferenciadas pueden contribuir a la elevación de los niveles de IFN-gamma. Se necesitan más estudios para explorar el efecto del número de CD27 + CD45RA +, CD28 + CD45 + y CCR7 + CD45RA + células en los niveles de IFN-γ de sangre entera.
Además de IFN-γ otros niveles de citoquinas Th1 tales como IL-2, IL-12 y TNF-α también aumentó en los pacientes en la cohorte 3, y en pacientes con PR /CR, mientras que Th2 los niveles de citoquinas tales como IL-4, IL-5 e IL-13 disminuyeron después del tratamiento. Además, la sangre entera nivel GM-CSF aumenta en los pacientes en la cohorte 3 y en pacientes que experimentaron PR /CR. Se informó previamente que la inmunidad mediada por células es preferentemente activada por citoquinas Th1, mientras citocinas Th2 suprime la inmunidad mediada por células [26]. GM-CSF es una citoquina pleiotrópica que estimula las células dendríticas (DC) y promueve la captación de antígenos tumorales por países en desarrollo que conducen a las células T a través del cebado y la activación del sistema inmune contra antígenos específicos [27], [28]. En consecuencia, sobre la base de los resultados de la monitorización inmune-hecho en el presente estudio, nos inclinamos a creer que la terapia de células T estimuladas-CH296 fibronectina puede ejercer efectos antitumorales mediante la activación de la inmunidad mediada por células. A pesar de que recientemente hemos demostrado que la ACT tiene el potencial de reducir el número de células T reguladoras [29], en el análisis realizado en este estudio, el número de células T reguladoras periféricas no cambió significativamente después del tratamiento.
Capacidad de respuesta a base inmunológica terapias varía entre los tipos de tumores. Mientras que el melanoma y el cáncer de células renales son considerados clásicamente para ser inmunogénica, la mayoría de los tumores malignos epiteliales no son inmunogénicos y no responden bien a la inmunoterapia. En nuestra muestra, los nueve pacientes tenían tumores malignos epiteliales tales como los cánceres gastrointestinales y cáncer de pulmón que son considerados tradicionalmente como refractarios a la inmunoterapia. Cabe señalar que no se observó respuesta objetiva en pacientes con cáncer rectal y cáncer de las vías biliares. No queda claro si esta novela ACT tiene potencial terapéutico para múltiples tipos de tumores.