Extracto
Antecedentes
Los datos recientes han indicado que puede haber una desregulación del metabolismo de los endocannabinoides en el cáncer. Aquí hemos investigado la expresión de la enzima que metaboliza el endocannabinoide amida hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) en un microarray de tejido bien caracterizado de pacientes diagnosticados con cáncer de próstata en la resección transuretral de la micción problemas.
Metodología /Principales conclusiones
inmunorreactividad FAAH (FAAH-IR) se evaluó en núcleos no malignos y tumores incluidas en parafina fijadas con formalina de 412 pacientes con cáncer de próstata. CB
1 inmunorreactividad del receptor (CB
1IR) con puntuaciones para este conjunto de datos. FAAH-IR se observó en las células epiteliales y las paredes de los vasos sanguíneos, pero no en el estroma. El tumor epitelial FAAH-IR se correlacionó positivamente con la gravedad de la enfermedad al momento del diagnóstico (puntuación de Gleason, estadio tumoral,% de la muestra que contenía el tumor) de los casos con intermedio CB
puntajes 1IR, pero no para aquellos con alta CB
puntajes 1IR. Para los 281 casos que sólo recibieron terapia paliativa en las etapas finales de la enfermedad, un tumor epitelial de alto FAAH-IR se asoció con una pobre supervivencia específica de la enfermedad. Un análisis multivariante de Cox de riesgos proporcionales de regresión indicó que la FAAH-IR dio información pronóstica adicional a la proporcionada por CB
1IR cuando una gama media, pero no es un gran CB
se utilizó el valor de corte 1IR. La interleuquina-4 (IL-4) receptor de IR se encuentra en las células epiteliales tumorales y la incubación de las células PC-3 y R3327 AT1 cáncer de próstata con IL-4 aumentado su actividad FAAH.
Conclusiones /Importancia
tumor epitelial FAAH-IR se asocia con la gravedad del cáncer de próstata y el resultado en la gama media, pero no es alto, CB
puntajes 1IR. La correlación con CB
1IR en el tejido tumoral puede estar relacionado con una desregulación local de común por un componente del microambiente del tumor
Visto:. Thors L, Bergh A, Persson E, Hammarsten P, P Stattin , Egevad L, et al. (2010) hidrolasa amida de ácido graso en el cáncer de próstata: asociación con la gravedad enfermedad y los resultados, CB
1 la expresión del receptor y el Reglamento de la IL-4. PLoS ONE 5 (8): e12275. doi: 10.1371 /journal.pone.0012275
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 26, 2010; Aceptado: 27 Julio 2010; Publicado: 19 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Thors et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias al Consejo de Ciencias sueca (concesión no 12158, medicina, CJ Fowler.); la Sociedad Sueca del Cáncer (Grant no puede seguir 2007/712, Anders Bergh.); Fondo leones de Investigación del Cáncer de la Universidad de Umeå /Cancer Research Fund Norrland y los Fondos de Investigación de la Facultad de Medicina, Universidad de Umeå (C. J. Fowler) para el apoyo financiero. La fuente de financiación para el anticuerpo (el Dr. Mackie) fue NIH subvención DA11322. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la forma más común de cáncer en los hombres. Según el Instituto Nacional estadounidense del Cáncer (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/prostate), el número de nuevos casos de cáncer de próstata en los Estados Unidos en 2009 fue de 192.280, y el número de muertes debido a la la enfermedad fue de 27.360. Las opciones de tratamiento varían de esperanza a la prostatectomía, el tratamiento hormonal y la radiación dependiendo de la naturaleza del cáncer.
En los últimos años, se han acumulado pruebas que sugieren que el sistema endocannabinoide, que comprende el CB cannabinoide
1 y CB
2 receptores, su endógenos ligandos anandamida y 2-araquidonoilglicerol, y sus enzimas sintéticas y de degradación, juega un papel en la patogénesis y el posible tratamiento de tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata (para revisiones recientes, véase [1] - [3 ]). Así, por ejemplo, los cannabinoides producen una apoptosis mediada por el receptor CB en células de glioma como resultado de una producción sostenida de ceramida [4] y varios trabajos han informado de efectos tanto CB dependiente del receptor y -independiente de los cannabinoides de la viabilidad, la movilidad y invasividad de las dos líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-sensibles e insensibles [5] - [11]
in vitro
, un tono endocannabinoide local es un factor importante que controla la malignidad de las células del cáncer de próstata. . Por lo tanto, la modulación de los niveles de endocannabinoides, mediante el uso de inhibidores de la síntesis o el metabolismo de los endocannabinoides, resulta en un cambio en las propiedades invasivas de las células de cáncer de próstata de una manera consistente con un efecto protector de los endocannabinoides [8], [12]. La anandamida endocannabinoide es metabolizado por la enzima hidrolasa de amida de ácido graso (FAAH) y la sobreexpresión de la enzima en células PC-3 resultados en un fenotipo con un comportamiento invasivo aumentado
in vitro
[12]. Estos autores concluyeron que "inhibición de la actividad FAAH por inhibidores específicos puede ser una diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata" [12]. inhibidores de FAAH, que no producen el tipo de efectos en el comportamiento centrales asociados con los cannabinoides como Δ
9-tetrahidrocannabinol [13], se encuentran actualmente en el desarrollo de fármacos, principalmente con el dolor como una diana terapéutica, y el compuesto de ataque está en la fase II de su desarrollo
.
se sabe menos sobre el sistema endocannabinoide en el tejido del tumor de próstata, pero en un estudio con un gran número de pacientes con un seguimiento a largo plazo, se informó recientemente que la expresión de CB
1 receptores en el tejido tumoral obtenido el momento del diagnóstico se asoció con la gravedad de la enfermedad y el resultado [14]. Por lo tanto, los individuos con un CB
1 inmunorreactividad del receptor (CB
1IR) por encima o igual a la puntuación mediana para el conjunto de datos tuvieron una mayor incidencia de metástasis al momento del diagnóstico, y una mayor proporción de casos con una alta puntuación de Gleason (un indicador de la gravedad de la enfermedad basado en la morfología de los dos tipos de tumores más comunes en la muestra [15]) que aquellos individuos con un CB
1IR debajo de la mediana del conjunto de datos. Por otra parte, para los individuos que habían sido seguidos por la esperanza hasta la aparición de metástasis, un alto CB
1IR puntuación se asoció con una supervivencia específica de la enfermedad más baja [14]. Con respecto a la FAAH, se ha informado de que en un microarray de tejido disponible en el mercado, los núcleos de los tejidos de cáncer de próstata tenían una mayor expresión de la enzima que visto en el tejido normal [12]. Sin embargo, no se presentaron datos sobre la relación entre la inmunorreactividad FAAH (FAAH-IR) y la evolución de la enfermedad. Además, las posibles razones del alto nivel de FAAH-IR en el tejido tumoral no fueron investigados por estos autores. En consecuencia, en el presente estudio, hemos investigado la FAAH-IR en la micromatriz de tejido utilizado anteriormente por nosotros para caracterizar CB
1IR en el tejido tumoral [14], y los estudios realizados utilizando células cultivadas para ver si un componente conocido del microambiente del tumor puede afectar a la actividad de FAAH. Además, hemos investigado si FAAH-IR se correlaciona con otras variables patogénicos y de pronóstico, tales como el número local estadio del tumor y la puntuación inmunorreactivas para el receptor del factor de crecimiento epidérmico fosforilada (pEGFR).
Métodos
Ética Declaración
el comité de ética de la investigación en Umea hospital universitario (regional de Ética Junta de Revisión en Umeå, Suecia) aprobó el estudio y la renuncia a la necesidad de consentimiento informado.
los pacientes
los, muestras incluidas en parafina fijadas con formalina utilizadas en el presente estudio se recogieron en el hospital central, Västerås, Suecia, entre 1975 y 1991 de un total de 412 pacientes diagnosticados con cáncer de próstata en la resección transuretral para las dificultades de la micción [16 ]. La presencia de metástasis se determinó utilizando una gammagrafía ósea poco después de la resección transuretral. Los pacientes fueron seguidos hasta el año 2003. Para los 388 casos en los que el tumor FAAH-IR se pudo calificar (ver más abajo), 281 fueron seguidos por la espera vigilante hasta la aparición de metástasis (el enfoque de tratamiento estándar en el momento). Los otros pacientes recibieron tratamiento hormonal, radioterapia o prostatectomía radical. Las puntuaciones de Gleason y el porcentaje de la muestra que contenían tumor fueron evaluados en cada muestra. La causa de muerte se realizó la evaluación de la historia clínica. microarrays de tejidos (núcleos con un diámetro de 0,6 mm) se construyeron usando un instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EE.UU.). Cada diapositiva de microarrays de tejidos (56 en total, por lo general con núcleos de 8 casos por diapositiva) contenía hasta ocho (usualmente cinco) muestras de tejido tumoral (se incluyeron dos áreas primarias y secundarias grado de Gleason) y hasta cuatro (cuatro por lo general) muestras de tejido no maligno de cada paciente [16].
La inmunohistoquímica
Las secciones se deparaffinized, rehidratada y se colocan en tampón citrato de pH 6,0. Después de hervir en una olla a presión durante 60 min, las muestras se colocaron en agua y luego en tampón de Ventana, después de lo cual se colocaron en un analizador automatizado Ventana (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ) a la que el anticuerpo FAAH (dilución 1 /2000) y el sistema secundario (Kit de detección de DAB iVIEW, Ventana Medical Systems Inc.) se añadieron. El anticuerpo utilizado, un anti-FAAH de conejo generado contra los últimos 102 aminoácidos de FAAH de rata, se ha caracterizado en detalle [17] y se encontró que producir el patrón de tinción apropiado (tinción somatodendrítica de las células principales) en el tejido fijado con formalina de hipocampo humano (datos no mostrados), consistente con las hipocampo de rata [18], [19]. CB
1 inmunorreactividad del receptor (CB
1IR) resultados estaban disponibles en la base de datos, y se ha informado en otras partes [14].
Los núcleos individuales fueron anotados bajo el microscopio para FAAH-IR por una investigador (LT) que era ciego a los datos clínicos de los pacientes. El sistema de puntuación usado fue esencialmente el mismo que el utilizado anteriormente para CB
1IR [14]. En resumen, para que el tejido epitelial, los núcleos se anotó para intensidad inmunorreactiva (0-3, donde 0 es ausente y 3 es alta) y la distribución en el tejido epitelial (0, 10, 25, 33, 50, 67 o 100% de la distribución total para cada intensidad). La distribución de la intensidad más común se fijó a 100 menos la suma de las otras intensidades. La distribución fraccionada a cada intensidad se multiplica por el puntaje de intensidad y los valores sumados para dar una puntuación final para el núcleo. Así, por ejemplo, un núcleo con intensidades de 1 (10%), 2 (10%) y 3 (el resto) (distribución entre paréntesis) recibiría una puntuación compuesta de 1 × 0,1 + 2 × 0,1 + 3 × 0,8 = 2,7 . Cuando identificable en el núcleo, el tejido epitelial basal y luminal se obtuvo por separado. paredes de los vasos de sangre se obtuvieron de la misma manera, pero con una distribución más simple (0, 50 y 100%). A lo largo de la puntuación, los ejemplos de núcleos marcados como 1, 2 y 3 estaban en la mano para la comparación como un "patrón interno". Núcleos de donde la estructura o la calidad del tejido no era suficientemente bueno o donde la tinción estaba claro fueron excluidos del estudio. Para cada medida, se calcularon los valores de la mediana de las puntuaciones compuestas para cada paciente y se introdujeron en la base de datos por un segundo investigador (CF). Como una medida de la fiabilidad de las puntuaciones epiteliales tumorales, 67 núcleos (16 pacientes) se anotó en dos ocasiones separadas por el mismo investigador. El coeficiente de correlación de Spearman para las puntuaciones individuales del núcleo entre este piloto y el estudio principal fue de 0,76 (n = 67, p & lt; 0,0001, 95% intervalo de confianza desde 0,63 hasta 0,85). El coeficiente de correlación intraclase para las medidas individuales (ICC (2,1), una medida de la reproducibilidad del método de puntuación) fue de 0,67 (intervalo de confianza del 95% 0,51 a 0,78, p & lt; 0,001).
La interleucina-4 (IL-4) inmunoreactividad receptor se evaluó en formalina fijo, embebidos en parafina cortes de tejido utilizando un anticuerpo monoclonal para el dominio extracelular del receptor recombinante humano IL-4 (MAB230, R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, EE.UU.). La dilución de anticuerpo era 1/200 y de la inmunorreacción se detectó usando el sistema de detección Ventana que el anterior. tejido del ganglio linfático sirvió como control positivo.
cultivo de células
células de cáncer de próstata humano LNCaP (paso oscila 32-38 y 14-19, respectivamente) PC-3 y, y R3327 AT las células de cáncer de próstata de rata -1 (rango 49-59) pasaje estaban disponibles en el Departamento. las células PC-3 se cultivaron en Hams F-10, 2 mM de L-glutamina, 10% de suero bovino fetal y 100 ml
-1 penicilina 100 g ml
-1 estreptomicina (plagas). células LNCaP se cultivaron en RPMI 1640, glutamina 2 mM, suero bovino fetal 10% y PEST. R3327 células AT-1 se cultivaron en RPMI 1640, suero bovino fetal 250 nM de dexametasona, 10% y PEST. células de carcinoma embrionario P19 de ratón (rango pasaje 17-19) se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares (Porton Down, Reino Unido). P19 células fueron cultivadas en MEM alfa 22571 con 10% de suero fetal bovino, 1% de aminoácidos no esenciales y de protección de plantas. Las células fueron cultivadas en 75 cm
2 frascos de cultivo a 37 ° C con 5% de CO
2 en la presión atmosférica humidificado. Las células se pasaron dos veces a la semana y medio de cultivo celular se cambió tres veces por semana.
interleucina-4 (IL-4) estimulación de la actividad FAAH en las células cancerosas cultivadas
Las células se colocaron en placas a una densidad de 1 × 10
6 células por pocillo en placas de 6 pocillos. Después de la incubación durante la noche a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2, el medio de cultivo celular se cambió, a medio suplementado con IL-4, y se incubó durante 24 horas adicionales. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS) y después de ello recogieron usando un policía de goma. En el hielo, las células se resuspendieron en PBS, se centrifugaron durante 5 minutos a 1000 x g y sedimento se resuspendió en tampón Tris 10 mM a pH 9. Los homogenados se almacenaron a -80 ° C en alícuotas hasta su uso. El contenido de proteína se determinó usando albúmina sérica bovina como estándar [20].
Se midió la actividad de FAAH tal como se describe por Boldrup et al. [21]. En pocas palabras, después de la incubación de homogeneizados con 2 M de [
3H] AEA marcado en la parte de la molécula de etanolamina (ensayo de pH 9), una mezcla de carbón vegetal (80 l de carbón vegetal 300 l 0,5 M de HCl por tubo) se añadieron y tubos se colocaron en hielo para detener la reacción. A continuación, el carbón se sedimentó por centrifugación, 2.500 × g durante 10 minutos, y las alícuotas del sobrenadante se transfirieron a viales de centelleo y contenido de tritio se determinó mediante espectroscopía de centelleo líquido con corrección de enfriamiento rápido. Los valores del blanco se definen como la cantidad acumulada de tritio para los ensayos realizados en ausencia de homogeneizados.
extracción de RNA y síntesis de ADNc
p>
6 células por pocillo en placas de 6 pocillos y tratados con IL-4 como se describe anteriormente. Para el análisis de PCR, el ARN total se extrajo utilizando el Kit miRNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió usando un instrumento Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.), y el ADNc se sintetizó a partir de 2 g de ARN total usando un kit de síntesis de ADNc con cebadores aleatorios (ADNc de alta capacidad inversa kit de transcripción; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para la PCR semi-cuantitativa, muestras de la misma grupo de tratamiento se agruparon (n = 6).
Semi-PCR cuantitativa
Los niveles de mRNA de CB humana
1, FAAH y GAPDH se analizaron usando un kit Taq PCR Core (Qiagen, Hilden, Alemania), un termociclador Biometra TProfessional (Biometra, Göttingen, Alemania) y los siguientes cebadores: hFAAH (197 pb), hacia adelante 5'-TGGAAGTCCTCCAAAAGCCCAG-3 ', inversa 5' - TGTCCATAGACACAGCCCTTCAG-3 ', HCB
1 (165 pb), hacia adelante 5'AAGGTGACATGGCATCCAAAT-3', 5'-reversa AGGACGAGAGAGACTTGTTGTAA-3 ', y hGAPDH (180 pb), hacia adelante 5'CAACTACATGGTTTACATGTTC-3', revertir 5'GCCAGTGGACTCCACGAC-3 '. Las condiciones para la PCR fueron: desnaturalización a 94 ° C durante 2 min, recocido durante 40 s a 57 ° C (GAPDH) o 60 ° C (FAAH, CB
1), seguido de elongación a 72 ° C durante 60 s; en los ciclos posteriores de desnaturalización se realizó a 94 ° C durante 40 s. Para FAAH y CB
1, los análisis incluyeron 35 ciclos, mientras que 25 ciclos fueron utilizados para GAPDH.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Además de la PCR semi-cuantitativa sobre muestras agrupadas , se realizó el análisis de muestras individuales utilizando cuantitativa en tiempo real PCR. Se utilizaron tanto SYBR Green (FAAH, CB
1, GAPDH) y TaqMan (ß-actina) cinética. Para FAAH, CB
1 y GAPDH, los cebadores descritos anteriormente se utilizan junto con energía SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), mientras que se detectó humana ß-actina usando un cebador pre-hechos mezcla -probe (Hs00357333_g1, Applied Biosystems), junto con TaqMan universal Master Mix PCR (Applied Biosystems). Las amplificaciones se realizaron en un sistema ABI PRISM 7900 HT de detección de secuencias y software (Applied Biosystems), y las muestras se analizaron por triplicado. Tanto GAPDH y ß-actina fueron utilizados como genes de limpieza, con resultados similares (datos de ß-actina no presentados). La expresión relativa de FAAH y CB
1was calculada a partir de
Ct
valores utilizando el método de la curva estándar.
Western Blot
Para el Western Blot, las muestras de proteína se sometieron a electroforesis en 10% SDS - geles de poliacrilamida en condiciones reductoras y las proteínas fraccionadas se transfirieron electroforéticamente a una membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital en la leche en polvo al 5% no grasa, 0,05% de Tween-20 en PBS (PBS-T) antes de la incubación con el anticuerpo policlonal de conejo primaria contra FAAH (1:1000-1 :5000; el mismo anticuerpo como se usa en la parte inmunohistoquímico del estudio) o anticuerpo policlonal de conejo primaria contra actina (1:8000; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS-T 3% (FAAH) o PBS-T 5% (actina) leche en polvo no grasa. Después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Amersham Biosciences), las proteínas se detectaron utilizando mayor sistema de detección de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences). tamaños moleculares de las bandas de proteínas se determinaron por electroforesis en paralelo de marcadores de peso molecular (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Suecia). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un kit de ensayo de proteína BSA (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.)
Los compuestos
La anandamida (etanolamina-1-
3H; actividad específica:. 2.2 TBqmmol
-1) se obtuvo de American Radiolabeled Chemicals Inc. (St. Louis, MO, EE.UU.). anandamida no marcada y URB597 se obtuvieron del Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, EE.UU.). Se obtuvo la interleuquina-4 de Sigma-Aldrich.
Estadísticas
Con la excepción de la Cox de riesgos proporcionales de regresión y el coeficiente de correlación intraclase análisis, que se llevó a cabo utilizando el software SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.), todos los cálculos estadísticos se realizaron con el paquete estadístico integrado en el programa GraphPad Prism 5 equipo para Macintosh (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Para los análisis de supervivencia, un evento se define como la muerte por cáncer de próstata y entró en la base de datos como "evento = 1". La muerte por otras causas fue censurado, al igual que los casos en que el paciente estaba todavía vivo en la fecha de la última de seguimiento. Estos se agruparon como "evento = 0". Los casos (n = 3), donde no se conocía el resultado de la enfermedad fueron excluidos de los análisis de la supervivencia. La duración de la supervivencia libre de eventos se define como el tiempo desde el diagnóstico hasta la fecha de muerte por cáncer de próstata, la muerte por otras causas, o si se ha producido ninguna muerte, hasta la fecha del último seguimiento.
funcionamiento del receptor característica (ROC) se utilizaron para definir puntos de corte para la FAAH-IR, que luego se utiliza para construir las curvas de supervivencia utilizando el método de Kaplan-Meier. Las diferencias en los resultados entre los grupos fueron evaluados con la prueba de log-rank. Se realizaron riesgos proporcionales de Cox análisis de regresión para evaluar la influencia de la puntuación de la FAAH en el resultado en diferentes CB
1IR puntos de corte. Las diferencias en la distribución de las variables entre los grupos de pacientes se analizaron mediante la prueba de chi-cuadrado.
Para los lectores no familiarizados con los métodos estadísticos utilizados para evaluar la influencia de la FAAH-IR sobre la evolución de la enfermedad, una breve explicación de su utilidad se justifica, en particular con respecto a la elección de los valores de corte para FAAH-IR. La prueba ROC fue desarrollado originalmente para facilitar la interpretación de las señales de radar, y traza el número de verdaderos negativos (1- la fracción de falsos positivos, denominados 1 - especificidad).
vs
verdaderos positivos (sensibilidad) en un punto de corte determinado valor (es decir, para los casos con una puntuación igual o mayor que el valor seleccionado). El área bajo la curva ROC se puede calcular. Para una prueba sin ningún tipo de valor diagnóstico, la curva será una línea recta con una superficie de 0,5. Una prueba perfecta daría un valor de 1,0, por lo que cuanto más lejos de 0,5 el valor, mejor será la prueba. Para una prueba con un área bajo la curva significativamente mayor que 0,5, un tema importante es la elección del punto de corte, el valor elegido como una señal de que el paciente puede tener la enfermedad en cuestión. Si el valor de corte es demasiado baja, entonces la sensibilidad será alto, pero habrá un gran número de falsos positivos. Si el valor de corte está en lo alto, entonces el número de falsos positivos será menor, pero un gran número de verdaderos positivos se puede perder. La elección del punto de corte es por tanto un compromiso entre maximizar el número de verdaderos positivos encontrado y minimizar el número de falsos positivos. Elección de corte depende de la importancia relativa de la falta de verdaderos positivos
vs.
Diagnosticar a un resultado negativo para la enfermedad en cuestión, sino una forma útil de identificar un punto de corte óptimo es determinar el punto de corte con la distancia vertical máxima entre el valor observado y el valor correspondiente para una prueba sin valor diagnóstico, calculada como la máxima sensibilidad + especificidad -1. Este valor se denomina el índice de Youden, J, y hemos utilizado este valor aquí por (J denominado
FAAH) FAAH-IR. Para las revisiones útiles en las curvas ROC y la elección de los valores de corte óptimos, véase [22] - [24]
Con respecto a los análisis estadísticos de las curvas de supervivencia, el método de Kaplan-Meier, donde las diferencias en los resultados entre. grupos se prueba con la prueba de log-rank, proporciona un método útil (y visual) para evaluar las diferencias en las curvas de supervivencia. La riesgos proporcionales de Cox análisis de regresión del peligro "como una función de las variables explicativas y los coeficientes de regresión desconocidos multiplicado por una función arbitraria y de tiempo desconocido" (cita del artículo original de Cox [25]), esto es, evalúa la contribución de las diferentes los posibles factores de riesgo en el punto final medido (en este caso, la muerte por cáncer de próstata), sin hacer suposiciones sobre la curva de supervivencia básica en sí.
resultados
Distribución de la inmunorreactividad de FAAH en la no tejido maligno y el tumor
FAAH-IR se anotó en los núcleos de un total de 412 pacientes. De éstos, no se encontraron registros para seis pacientes en la base de datos, y así los datos de estos pacientes no fueron incluidos en los análisis.
Un ejemplo de la FAAH-IR para el tejido no maligno se muestra en la Higo. 1A. FAAH-IR se observó en las células epiteliales, y en los vasos sanguíneos, así como en las células (posiblemente linfocitos, que expresan FAAH [26]) la infiltración del estroma en algunos núcleos. En total, 1247 núcleos de 377 pacientes por FAAH epiteliales no malignas. De éstos, 733 núcleos de 307 casos tenían basal definibles: morfología luminal y la FAAH-IR para estos casos se califican por separado y utilizados en los análisis. Además, 993 núcleos de 369 casos se anotó para la FAAH-IR en las paredes de los vasos sanguíneos. La distribución acumulativa de las puntuaciones en las células epiteliales basales y luminales se muestra en la Fig. 1B, donde está claro que la mediana FAAH-IR es mayor en las células epiteliales basales que en las células luminales. De hecho, de los 733 núcleos anotó, la puntuación basal FAAH-IR fue mayor que la puntuación correspondiente en luminal 724 núcleos y los dos puntajes eran iguales en 9 núcleos. La puntuación luminal nunca fue mayor que la puntuación basal. El vaso sanguíneo FAAH-IR se obtuvo de forma ligeramente diferente, por lo que una comparación directa de los valores no es relevante. Sin embargo, hubo una correlación significativa entre FAAH-IR basal de los vasos sanguíneos y FAAH-IR, pero no entre el luminal de los vasos sanguíneos y FAAH-IR (Tabla 1).
Panel A. Ejemplo de FAAH-IR en un núcleo de tejido de la próstata no maligno obtenido en la resección transuretral de un paciente de 75 años de edad. Los asteriscos indican los vasos sanguíneos, y el símbolo#indica células positivas FAAH, presumiblemente la infiltración de linfocitos. En el panel C, se muestra la FAAH-IR en un núcleo de tejido del tumor de un paciente de 64 años. Las líneas en la parte superior derecha por encima de los núcleos indican 100 micras. El panel B muestra las frecuencias acumuladas de las puntuaciones de FAAH-IR para la basal y el tejido luminal no maligno (N) epitelial (n = 307 en ambos casos) y para el tejido tumoral (T) epitelial (n = 388). Los valores de la mediana (con rango intercuartil entre paréntesis) fueron: basal (N), 2,625 (2,125 a 2,9); luminal (N), 1,25 (1-1,75); epitelial (T), 2.05 (01.08 a 02.03). Los valores medios fueron significativamente diferentes entre sí (p & lt; 0,001, prueba de comparación múltiple de Dunn siguiente significativa prueba de Kruskal-Wallis). El panel D muestra la relación del tumor epitelial FAAH-IR a la puntuación de Gleason (GS) al momento del diagnóstico. Las puntuaciones FAAH-IR se dividieron en cuadrantes donde I se refiere a las puntuaciones entre & lt; 1.8 (n = 96), II entre 1,8 y 2 (n = 94), III entre 2,05 y 2,25 (n = 99) y IV entre 2,3 y 3 (n = 99). La distribución de los grupos GS fue significativamente diferente en los cuadrantes (χ
2 = 27,03; gl = 9, p & lt; 0,0005).
Un total de 1851 núcleos de 388 casos se anotó para FAAH-IR en las células epiteliales del tumor. Para los vasos sanguíneos, se puntuaron 1201 núcleos de 360 pacientes. Un ejemplo de la tinción para un núcleo de tumor se muestra en la Fig. 1C y la distribución acumulativa de las puntuaciones epiteliales se muestran en la Fig. 1B, donde se puede observar que la puntuación media fue significativamente mayor que la puntuación luminal no maligno, pero inferior a la puntuación basal.
Las muestras utilizadas aquí se han investigado previamente por nosotros con respecto la expresión de epitelial CB
1 receptores [14]. Para las muestras no malignas, no hubo correlación significativa entre el CB
Partituras 1IR y ya sea basal, luminal de los vasos sanguíneos o FAAH-IR. Por el contrario, una correlación significativa entre el CB tumor
1IR y el epitelial del tumor y los vasos sanguíneos FAAH-IR se observó (Tabla 1).
actividad FAAH en líneas celulares de cáncer de próstata se ve afectada por la interleucina-4
una explicación para el hallazgo de que el tumor epitelial FAAH-IR es superior a FAAH-IR en el tejido epitelial de próstata normal [12] es que un constituyente del microambiente del tumor afecta a su actividad. El T
H2 citocina interleucina-4 (IL-4), que se ha informado para regular FAAH y CB
1 receptores en los linfocitos y las células Jurkat [26] - [28], está implicada la patogénesis de varios cáncer tipos, incluyendo el cáncer de próstata (ver [29] - [35]). IL-4 receptores han sido reportados en tanto las células epiteliales tumorales y en líneas celulares de cáncer de próstata en cultivo [29], [36]. Se confirmó la presencia de IL-4 IR en el tejido epitelial del cáncer de próstata (Fig. 2A), y encontramos que la incubación de ambas PC-3 células humanas andrógeno-insensible y de rata Dunning R3327 células de cáncer de próstata en-1 con IL-4 para 24 h produjo un aumento significativo en la actividad de FAAH de las células (Fig. 2B y C). Un resultado similar se observó con células LNCaP de cáncer de próstata humanos (datos no mostrados). Este efecto de la IL-4 no es única para las células del cáncer de próstata, ya que también se observó células P19 de ratón de teratocarcinoma (Fig. 2D).
Panel A, IL-4 inmunoreactividad receptor en una muestra de tejido del tumor de próstata ( puntuación de Gleason 8). La línea en la parte inferior izquierda de la imagen representa a 100 micras. Los paneles B-D, efecto de la IL-4 sobre la actividad FAAH de células PC-3 de cáncer de próstata humano (B); rata R3327 AT-1 en las células de cáncer de próstata (C) y células P19 de ratón de teratocarcinoma (D). Las líneas celulares se incubaron durante 24 h con 5 ng /ml de IL-4 y la actividad FAAH en los homogeneizados de células se determinó utilizando 2 M [
3H] anandamida como sustrato. La actividad de la enzima en todos los casos fue totalmente bloqueado por el inhibidor de la FAAH URB597 selectiva. Los datos son medias y s.e.m., n = 4-5; * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, prueba t emparejada. En los paneles (E) y células PC-3 y LNCaP (F) se incubaron con IL-4 (5 ng /ml) durante 24 h. Extracción de ARN, síntesis de ADNc y el análisis de PCR se realizaron como se describe en la sección "Métodos". análisis PCR Panel E. Semi-cuantitativa de la expresión FAAH mRNA en las células LNCaP PC-3 y. La expresión de mRNA de FAAH se normalizó contra GAPDH. El análisis semi-cuantitativo de PCR se realizó usando muestras reunidas (n = 6). Análisis en tiempo real PCR Panel F. cuantitativo de la expresión mRNA FAAH, normalizado contra GAPDH. PCR datos cuantitativos se visualizan como medios (n = 6) y SEM, donde el grupo de control no tratado media se define como 100%.
En experimentos posteriores, los efectos de tratamiento con IL-4 sobre la proteína FAAH y se evaluaron mRNA. El tratamiento de células LNCaP PC-3 y con IL-4 durante 24 h no regulaba la expresión de mRNA de FAAH, como se evaluó tanto por PCR semi-cuantitativa y PCR cuantitativa (Fig 2E, 2F) en tiempo real. En un experimento adicional, las células PC-3 fueron tratados con IL-4 (5 ng /ml) durante 3 h, para estudiar la posible regulación temprana de expresión FAAH. Al igual que en el experimento de 24 h, sin embargo, el tratamiento de células PC-3 con IL-4 durante 3 h no regulan la expresión de ARNm de FAAH (datos no mostrados). En contraste con la situación de las células Jurkat y linfocitos T, la expresión de CB
1 en las células LNCaP no estaba regulado por la IL-4: la expresión relativa de CB
1 /GAPDH (% de los controles no tratados, medios ± sem, n = 6) después de 24 h de tratamiento con vehículo o IL-4 fue de 100 ± 33 y 109 ± 20, respectivamente. Las células PC-3 utilizados en nuestro laboratorio no expresaron niveles detectables de CB
1 mRNA (datos no mostrados).
transferencias de Western preliminares análisis se llevaron a cabo también usando lisados de células PC3 tratadas durante 24 h con vehículo o 5 ng /ml de IL-4.