Extracto
proteína Fhit se pierde o se reduce en una gran fracción de tumores humanos, y su restauración desencadena la apoptosis y suprime la formación de tumores o la progresión en modelos preclínicos. A continuación, se describe la identificación de candidatos Fhit-proteínas que interactúan con localización citosólica y la membrana plasmática. Entre éstos, la anexina 4 (ANXA4) fue validado por la co-inmunoprecipitación y microscopía confocal como socio de este nuevo complejo de proteína Fhit. Aquí mostramos que la sobreexpresión de anexina A4 Fhit evita la translocación del citosol a la membrana plasmática en células de cáncer de pulmón A549 tratados con paclitaxel. Por otra parte, la administración de paclitaxel en combinación con Ad
FHIT
actúa sinérgicamente para aumentar la tasa de apoptosis de las células tumorales tanto
in vitro e
in vivo
experimentos.
Visto: Gaudio E, F Paduano, Spizzo R, Ngankeu A, Zanesi N, Gaspari M, et al. (2013) Fhit deslocaliza Anexina A4 desde la membrana plasmática al citosol y sensibiliza a las células del cáncer de pulmón de paclitaxel. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10.1371 /journal.pone.0078610
Editor: P. Srikumar Chellappan, Universidad de Catanzaro, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Marzo, 2013; Aceptado: September 14, 2013; Publicado: 6 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Gaudio et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por AIRC (Associazione Italiana Ricerca Cancro) y los Institutos nacionales de Salud (NIH) de subvención CA152758 (CMC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el
FHIT
gen, que abarca
FRA3B
, el sitio frágil común más activo en el cromosoma 3p14.2 [1], [2] es un miembro de la tríada de histidina (HIT) la familia de proteínas, que abarca un grupo de nucleótidos que se une e hidroliza proteínas con motivos de histidina tríada, representada en todos los organismos [3].
FHIT
codifica una proteína supresora de tumores cuya pérdida está implicada en una gran fracción de los cánceres; de hecho, su eliminación o pérdida de la expresión ha sido reportada en la cabeza y el cuello [4], [5], gastrointestinal [6], cervical [7], pulmón [8], de mama [9], [10], y hematopoyético tumores [11]. El papel de Fhit en la tumorigénesis se confirmó en ratones, donde
Fhit
la ablación genética dio como resultado el aumento de la susceptibilidad a un amplio espectro de tumores espontáneos [12], [13]. Por otra parte, la supresión de uno o ambos
FHIT
alelos en ratones sensibilidad a la sustancia cancerígena N-nitrosomethylbenzylamine (BNM) mejoradas, con más
Fhit
- /- Opiniones y
FHIT
+/- ratones desarrollar tumores del proventrículo (adenomas, papilomas y carcinomas invasivos) después de una dosis de ABNM comparación con los controles de tipo salvaje [12], [14] que se desarrolló muy pocos. Curiosamente,
FHIT
fue también utilizado con éxito como un gen terapéutico en líneas celulares de cáncer, en el que desencadena la apoptosis, y varios modelos preclínicos de
FHIT
cáncer -null, incluyendo de pulmón, esófago, páncreas, de mama y leucemia [15] - [20]. Sin embargo, los informes relativos a las modalidades de la función supresora Fhit han sido más escasa y más reciente. FHIT codifica un polifosfato diadenosina (apna) hidrolasa que escinde los sustratos tales como diadenosina
P
1,
P
3 trifosfato (APPPA) y diadenosina 5 ', 5' ' '-
P
1,
P
4-tetrafosfato (AppppA) a AMP además de los otros nucleótidos [21], [22]. A través de la expresión adenoviral de
FHIT
alelos mutantes, hemos demostrado que la unión del sustrato-Fhit es limitante para la supresión de tumores, mientras que no se requiere su actividad catalítica para la capacidad Fhit para activar la apoptosis [23]; Por otra parte, hemos demostrado que la muy conservadas Fhit tirosina 114 (Y114), que puede ser fosforilado por Src [24], es necesario para desencadenar la apoptosis mediada por Fhit dependiente de caspasa [25]. Más recientemente, mediante el uso de un enfoque proteómico, hemos identificado un complejo de proteína Fhit incluyendo Hsp60 y Hsp10, que puede mediar tanto la estabilidad Fhit y su localización mitocondrial; una vez en la mitocondria, Fhit se une y estabiliza ferredoxina reductasa (Fdxr), lo que conduce a la modulación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), un paso temprano en la apoptosis inducida por Fhit [26]. La evidencia de Fhit localización mitocondrial llevó también al descubrimiento de que aumenta la acumulación de Ca2 + en el orgánulo, de acuerdo con su papel en la apoptosis en condiciones adecuadas [27].
La amplia distribución subcelular de Fhit nos animaron para continuar la búsqueda de socios de nueva proteína FHIT arrojar más luz sobre su papel en la supresión tumoral. Aquí, demostramos que Fhit interactúa con Anexina 4; esta interacción puede bloquear la translocación de Anexina 4 del citosol a la membrana plasmática durante el tratamiento de células de cáncer de pulmón con paclitaxel. Como consecuencia de ello, exógeno
FHIT
restauración en
FHIT
células cancerosas-null actúa de forma sinérgica con paclitaxel en el desencadenamiento de la apoptosis
in vitro
y la regresión del tumor
in vivo
. Tomados en conjunto nuestros resultados sugieren que la restauración Fhit podría tener un papel en la superación de la resistencia a fármacos y esa combinación con paclitaxel lata representa un enfoque válido para la terapia del cáncer.
Resultados
El aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células FHIT membranas
En nuestro enfoque proteómico anterior, hemos aislado una proteína compleja Fhit soluble a partir de las células cancerosas A549 [26]. Mediante el uso de un enfoque ligeramente modificado, cuyo objetivo es identificar las proteínas que interactúan Fhit-en las membranas celulares, se utilizó un adenovirus recombinante que lleva un
FHIT
ADNc modificado en su extremo 3 'con una secuencia que codifica una etiqueta de histidina y seis epítopo ( ad
FHIT-
His6), tal como se describe anteriormente [26]. Brevemente, las células de cáncer de pulmón A549 se infectaron o bien con Ad
FHIT
(utilizado como control) o Ad
FHIT-
His6 en MOI50 y se trató con ditiobis [succinimidilpropionato] (DSP), una cruz enlazador que atraviesa las membranas y correcciones de las proteínas en el complejo en las células vivas. Las células se lisaron y se aislaron membrana fracción enriquecida; proteína recombinante FHIT-His6 junto con sus compañeros de la proteína candidatos se aisló con perlas de níquel Avid para el epítopo etiqueta His6. Las proteínas purificadas se trataron con ditiotreitol (DTT) para escindir DSP y disociar el complejo, y se digirieron con tripsina; componentes de las proteínas fueron identificadas por líquido /cromatografía de espectrometría de masas tándem (LC-MS /MS). Después de la identificación de proteínas mediante la búsqueda de bases de datos, la inspección de los datos de LC-MS /MS se llevó a cabo para evaluar la presencia exclusiva de picos de masa que pertenecen a las proteínas asociadas candidato en muestras de células infectadas con Ad
FHIT-
His6. Las proteínas identificadas se enumeran en la Tabla 1.
proteína Fhit interactúa con Anexina 4
Se demostró previamente que la ausencia de la proteína Fhit en las células cancerosas como resultado de la resistencia a paclitaxel [28] ; Anexina 4, se ha reportado una proteína con tanto membrana plasmática y localización citoplasmática que se sobreexpresa en muchas células de cáncer; en particular, se ha demostrado que la anexina 4 sobre-expresión contribuye a las células cancerosas resistentes a paclitaxel [29]. Por lo tanto, para arrojar luz sobre los mecanismos de resistencia a los medicamentos en
FHIT
células cancerosas -minus, hemos decidido centrarse en Anexina 4 entre los socios FHIT candidatos recién identificados. Anexina 4 pertenece a una superfamilia de calcio estrechamente relacionadas y proteínas de unión a la membrana que participan en una variedad de funciones celulares, incluyendo el tráfico de vesículas, la división celular, la apoptosis, la señalización del calcio y la regulación del crecimiento. Se ha propuesto que algunos cambios en la expresión de anexina durante la génesis tumoral puede resultar en resistencia a los agentes quimioterapéuticos y que anexinas individuales pueden demostrar ser dianas terapéuticas [30] - [35]. El gen 4 Anexina (ANX4) codifica una proteína (a saber, ANX4 o A4) expresado casi exclusivamente en las células epiteliales [31] y se sobreexpresa durante el tratamiento paclitaxel y en líneas celulares resistentes a paclitaxel; transfección de ANX4 ADNc en células 293 T resultó en un aumento de tres veces en la resistencia a paclitaxel [29], [36]. Una correlación entre la presencia de Anexina 1 (Anexo1) y MDR (resistencia a múltiples fármacos) proteínas en células de cáncer de mama, siempre que la primera evidencia directa de un papel de una anexina en resistencia a múltiples fármacos [37].
Para evaluar Fhit y la interacción Anexina 4, se realizó un experimento de co-inmunoprecipitación utilizando lisados de proteína preparados como se describe anteriormente (Figura 1, a y B). FHIT y Anexina 4 colocalización se investigó mediante microscopía confocal. Como se muestra en la Figura 1E, tanto Fhit y Anexina 4 muestran principalmente una colocalización subcelular citoplasmática.
A. las células de cáncer de pulmón A549 fueron infectadas con Ad
FHIT
tipo -wild o Ad
FHIT-
His6 en MOI50; 48 h después de la infección, las células se trataron con DSP y se lisaron con Mem-PER eucariota Membrana Kit Protein Extraction para proporcionar los lisados totales enriquecidos en la fracción de membrana. Total lisados se inmunoprecipitaron con perlas de níquel. Los inmunoprecipitados se analizaron por inmunotransferencia (IB) con anticuerpos anti-anexina A4 anti-Fhit y. células A549 B. fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido de expresión que codifica los mamíferos
Annexin4-
V5 (8 g). 48 h después de la transfección, las células se trataron con DSP y los lisados totales se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-V5. Los inmunoprecipitados se sondearon por inmunotransferencia (IB) con anti-Fhit y anti-Anexina 4 anticuerpos. DISCOS COMPACTOS. Las células HEK293 se tretated o tretaed con paclitaxel durante 24 horas (800 nm) y se lisaron simulacro. Total de lisados de proteínas se Immunoprecipited con IgG, FHIT y Anexina 4 anticuerpos, tal como se indica. La detección de Anexina endógeno 4 y Fhit se realizó sin el uso de la DSP reticulante.
Como se muestra en la Figura 1A y 1B, y la interacción Fhit Anexina 4 se detectó principalmente en extractos citosólicos. Hemos llevado a cabo más experimentos de co-inmunoprecipitación en endógena Fhit y Anexina 4 proteínas en células HEK293 y se demostró la interacción entre estas proteínas también en ausencia de la DSP reticulante, ya sea con o sin paclitaxel (Figuras 1C y 1D). La inmunoprecipitación llevó a cabo con anticuerpo Fhit seguido de una inmunotransferencia realizada con un antisuero Anexina 4, era claramente sugerente de un complejo endógeno Fhit-Anexina 4 en cells.The intacto forma directa de los IPs entre proteínas endógenas eran claramente indicativo de la interacción (IP : Fhit, y IB: Anexina 4). Desafortunadamente, debido a dificultades técnicas debido a la co-migración de IgG y la proteína Fhit, el enfoque inverso, es decir la inmunoprecipitación de endógeno proteína anexina 4 seguido por la detección Fhit, se unsuccessuful.
Fhit bloques sobreexpresión Anexina 4 translocación del citosol a la membrana plasmática
Fhit y Anexina 4 expresión de la proteína se evaluó en un panel de líneas celulares de cáncer (Figura S1), la expresión Fhit se pierde en la mayoría de líneas celulares investigadas. Para arrojar luz sobre el significado del complejo proteína Anexina Fhit-4, hemos realizado experimentos en dos de ellos, A549 y Calu-2, que muestran la expresión Fhit ligera o ninguna, respectivamente. Para definir mejor la localización subcelular de la proteína compleja Fhit-Anexina 4, hemos realizado experimentos de fraccionamiento celular. Como se muestra en las Figuras 2A y 2C, Anexina basal 4 se distribuye tanto en el citosol y la membrana plasmática. El tratamiento de células A549 y de cáncer de pulmón Calu-2 con paclitaxel inducida por el agotamiento de citosólica de Anexina 4 que se sometió a una translocación aparentemente completa en el lado interno de la membrana plasmática. sobreexpresión Fhit bloqueado Anexina 4 translocación desde el citosol a la membrana plasmática, observado después de la administración de paclitaxel. Para demostrar que los efectos fueron impulsados específicamente por el Fhit-Anexina 4 interacción, un experimento similar se realizó teniendo en cuenta la localización subcelular de Anexina 1 y MDR (proteína de resistencia a múltiples fármacos), que están ambos implicados en la resistencia a la quimioterapia [37] , [38]. Como se muestra en las Figuras 2B y 2D, ni Anexina I ni MDR localizaciones subcelulares fueron influenciados por Fhit sobreexpresión. Tomados en conjunto, estos datos indican que la proteína Fhit interfiere específicamente con Anexina 4 translocación del citosol a la membrana plasmática, observada en A549 tratados con paclitaxel y Calu-2 células.
A-C. Las células A549 y cáncer de pulmón Calu-2 fueron infectadas con Ad
GFP
o Ad
FHIT
en MOI50; 48 h más tarde, las células fueron modelo de tratamiento o tratados con paclitaxel (800 nM) durante 24 h más. Las proteínas de las fracciones citosólicas y de membrana se separaron en un gel de poliacrilamida, se transfirieron a filtro de nitrocelulosa, y se sondaron con Anexina 4 anticuerpo. GAPDH y E-cadherina se utilizaron para normalizar la carga de proteínas de proteínas citosólicas y de membrana plasmática, respectivamente. B-D. las células de cáncer de pulmón A549 y Calu-2 fueron infectadas con Ad
GFP
o Ad
FHIT
de tipo -wild; 48 h después, las células se trataron con paclitaxel (800 nM) durante 24 h más. Las proteínas de las fracciones citosólicas y de membrana se separaron en un gel de poliacrilamida, se transfirieron a filtro de nitrocelulosa, y se sondaron con anexina 1 y MDR (proteína de resistencia a múltiples fármacos) anticuerpos. GAPDH y E-cadherina se utilizaron para normalizar la carga de proteínas de proteínas citosólicas y de membrana plasmática, respectivamente.
Anexina 4 agotamiento combinado con Fhit sobreexpresión y tratamiento con paclitaxel induce sinérgicamente inhibición de la proliferación y desencadena la apoptosis de las células del cáncer de pulmón
para investigar el papel del bloque mediada por Fhit de Anexina 4 translocación desde el citosol a la membrana plasmática en el mecanismo de resistencia a los medicamentos, se realizó curvas de crecimiento de células en diferentes condiciones. Como se muestra en la Figura 3A y 3B para A549 y Calu-2 células de cáncer de pulmón, el número de células se redujo en Ad
FHIT-
células infectadas en comparación con los controles; se observó una inhibición del crecimiento celular ligeramente más fuerte en las células tratadas con paclitaxel. Por último, de acuerdo con los informes anteriores [26], se observó un efecto sinérgico sobre la inhibición de la tasa de proliferación en las células A549 tratadas con paclitaxel más Ad
FHIT
. En un experimento representativo se ilustra en la Figura 3C, la citometría de flujo se utilizó para investigar perturbaciones del ciclo celular en células A549 infectadas con Ad
FHIT
, con (800 nM durante 24 h) o sin tratamiento con paclitaxel; Las células A549 infectadas con Ad
FHIT
mostró un pico sub-G1 era detectable (13%), en consonancia con nuestros resultados anteriores [26]; se obtuvo un efecto similar después de 800 nM la administración de paclitaxel. Se detectó un efecto sinérgico después de la combinación de anuncios
FHIT Opiniones y tratamiento con paclitaxel (25% de la fracción sub-G1).
A-B. Las células A549 y Calu-2 fueron modelo de infectados, Ad
GFP
o Ad
FHIT
células infectadas en MOI10 durante 24 h, después se trató con o sin paclitaxel 800 nM para adicional de 6 horas y contó . Los gráficos de barras muestran la media ± SEM de los valores de tres experimentos diferentes (* P & lt; 0,05). El methos Chou-Talalay se aplicó para calcular la naturaleza de las combinaciones (CI & lt; 1, el sinergismo). C. células A549 eran o maqueta infectado o infectado con Ad
GFP
o Ad
FHIT
, o dejaron sin tratar o tratados con paclitaxel 800 nM, y después se analizaron mediante citometría de flujo.
Estos datos sugieren que la restauración de la función Fhit a las células malignas Fhit-negativos, en combinación con paclitaxel, podría representar un nuevo enfoque potencial para el tratamiento de pacientes afectados por cáncer de pulmón. De hecho, reduciendo el umbral de sensibilidad a la administración de fármacos en Anexina 4 mediada por tumores quimiorresistentes, restauración Fhit podría representar un enfoque interesante para obtener un mejor resultado pacientes.
Para determinar si la interacción entre Fhit y Anexina 4 podría tener un papel en la inhibición del crecimiento celular mediada por Fhit y la apoptosis, Anexina 4 fue silenciada con pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) diseñados para bloquear la expresión de la proteína Anexina 4. Como se muestra en la Figura 4A, los niveles de anexina 4 de expresión de proteínas se redujeron significativamente después de Anexina 4 siRNAs transfección, en ausencia o presencia de paclitaxel. De acuerdo con estudios anteriores [36], las células falsamente transfectadas y células transfectadas con siRNAs revueltos mostraron Anexina 4 upregulation proteína después de la administración de paclitaxel en comparación con los controles, mientras que no se observaron cambios en las muestras de A549 Anexina 4-agotado ya sea en ausencia o presencia de paclitaxel. La combinación de tratamiento con paclitaxel con Anexina 4 agotamiento tuvo un efecto sinérgico sobre la inhibición de la proliferación celular, con el número de células siendo significativamente inferior en comparación con el tratamiento con paclitaxel o Anexina siRNA 4-específica solo (Figura 4B). No se observó ningún efecto sobre la proliferación después de la transfección con siRNAs revueltos. También probamos la tasa de proliferación de células A549 después de Anexina 4 silenciamiento o la infección con Ad
FHIT
en MOI25 o tratamientos combinados (Figura 4C). Anexina 4 agotamiento y la sobreexpresión Fhit causó una reducción significativa del número de células en comparación con los controles; una reducción adicional dramático en el número de células se observó mediante la adición de paclitaxel, lo que indica un efecto sinérgico.
A. A549 células fueron transfectadas de manera simulada o transfectadas con Anexina 4 siRNAs (50 NM) o siRNAs revueltos (50 nM) durante 72 h. Células lisados se inmunotransfirieron con Anexina 4 y anticuerpos GAPDH. B. Las células A549 fueron falsamente transfectadas o transfectadas con Anexina 4 siRNAs (50 NM) o revueltos siRNA (50 nM), infectadas con Ad
FHIT
en MOI25 durante 72 h, y luego se deja sin tratamiento o tratadas con paclitaxel ( 800 nM). Se contaron las células primero a las 12 h después del tratamiento de paclitaxel. Los gráficos de barras muestran la media ± SEM de los valores a partir de 3 experimentos (* P & lt; 0,05). El methos Chou-Talalay se aplicó para calcular la naturaleza de las combinaciones (CI & lt; 1, el sinergismo). células de C. A549 se falsamente transfectadas o transfectadas con Anexina 4 siRNA (50 nM) o siRNAs revueltos (50 nM) durante 72 h, a continuación, no tratados o tratados con paclitaxel. Se contaron las células primero 12 h después del tratamiento de paclitaxel. Los gráficos de barras muestran la media ± SEM de los valores a partir de 3 experimentos (* P & lt; 0,05). El methos Chou-Talalay se aplicó para calcular la naturaleza de las combinaciones (CI & lt; 1, el sinergismo). D. células A549, se trató como se describe en B y C, se analizaron mediante el ensayo de TUNEL.
Un ensayo de TUNEL confirmó que todas las poblaciones sub-G1 descritos en la Figura 3C se componen predominantemente de células apoptóticas (Figura 4D). Por otra parte, también los efectos sobre la inhibición de la proliferación de células fueron acompañados por los resultados de un ensayo de TUNEL; de hecho, la apoptosis alcanzó su mayor medida en las células de Anexina-4 empobrecido infectadas con Ad
FHIT Opiniones y tratados con paclitaxel (Figura 4D).
Fhit /Anexina 4 interacción más paclitaxel regresión tumoral inducida en un modelo preclínico de cáncer de pulmón
Para investigar los efectos de la interacción Fhit /anexina A4
in vivo
con o sin paclitaxel en un modelo preclínico de cáncer de pulmón, se realizó un experimento en 11 grupos de ratones (n = 5 ratones /grupo). Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio aprobó este estudio. Tres grupos fueron inyectados por vía subcutánea con 1 x 10
células 7 A549. Cuando los tumores alcanzaron 15 mm de diámetro, los ratones fueron tratados de forma simulada, se trató con DMSO o tratados con una sola administración IV de 40 mg /kg de paclitaxel; Los ratones se controlaron de manera regular. Tres días después, los ratones fueron sacrificados y los tumores se evaluaron en peso. Los tumores de los ratones tratados con paclitaxel mostraron una reducción del 50% en comparación con los controles. Este punto de tiempo corto nos permitió aumentar los efectos de ambos tretaments individuales y su combinación, al igual que con los puntos de tiempo más largos los efectos del tratamiento Fhit estarían cubiertas por el paclitaxel. Se inyectaron dos grupos de ratones con 1 x 10
7 células A549 previamente infectadas con Ad
GFP
o Ad
FHIT
en MOI50, y dos más grupos fueron inyectados con 1 x 10 células
7 A549 previamente infectadas con Ad
FHIT
a baja multiplicidad de infección (MOI5); uno de los últimos grupos también se trató con paclitaxel, como se describe anteriormente. El peso del tumor mostró una reducción del 83% en comparación con los controles en los ratones inyectados con Ad
FHIT
MOI50 células pre-infectados versus reducción del 27% en los ratones inyectados con Ad
FHIT
MOI5; Curiosamente, Ad
FHIT
xenoinjertos MOI5 tratados con paclitaxel mostraron regresión tumoral al 7% de los tumores de control, lo que indica un efecto sinérgico de Fhit y paclitaxel.
Para completar el panel, dos grupos de ratones fueron inyectado con Anexina 4-agotado células (una de las cuales fue tratado con paclitaxel, como se describe anteriormente) y dos grupos más con células de Anexina 4-agotado pre-infectadas con Ad
FHIT
MOI5 (uno tratado con paclitaxel). Anexina 4-agotado células mostraron una reducción del tumor leve pero no significativo en comparación con los controles, mientras que se observó una reducción mayor en xenoinjertos de Anexina 4-agotado tratados con paclitaxel frente a xenoinjertos tratados con paclitaxel solo (70% y 50%, respectivamente). Por último, prácticamente no se detectaron tumores en ratones portadores de xenoinjertos con Anexina derribado 4 pre-infectadas con Ad
FHIT
MOI5 más paclitaxel. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Figura 5A y 5B. Tomados en conjunto, estos datos ponen de relieve la importancia de la interacción Fhit /Anexina 4
in vivo
y poner de relieve el valor de la terapia génica Fhit combinada y la quimioterapia en modelos preclínicos de cáncer.
A. Los ratones desnudos se inyectaron por vía subcutánea con 1 x 10
células 7 A549. Algunos grupos (n = 5 ratones /grupo) fueron inyectados con las células tratadas simuladas, otros con las células transfectadas con Anexina 4 siRNA o infectadas con Ad
FHIT
(MOI5 o MOI50) o combinaciones de ambos. Cuando los tumores alcanzaron 15 mm de diámetro, los ratones fueron tratados de forma simulada, se trató con DMSO o tratados con una sola administración IV de 40 mg /kg de paclitaxel; Los ratones se controlaron de manera regular. Tres días después de PTX, los ratones fueron sacrificados y los tumores se evaluaron en peso. Los gráficos de barras muestran la media ± SEM de los valores a partir de 5 ratones (* P & lt; 0,05). El methos Chou-Talalay se aplicó para calcular la naturaleza de las combinaciones (CI & lt; 1, el sinergismo). B. volúmenes de los tumores se presentan con el tiempo.
Discusión
La pérdida de expresión Fhit durante la tumorigénesis ha sido reportado en la mayoría de los tipos de cáncer humano. Su papel en enfermedades malignas está subrayada por el hecho de que la pérdida de Fhit es un evento temprano en los tumores, como se informó para las lesiones precancerosas del pulmón. Además, el éxito
FHIT
terapia génica en una serie de modelos preclínicos de cáncer humano hace que la proteína Fhit un buen candidato para la búsqueda de terapias innovadoras [1]. A pesar de los esfuerzos para aclarar cómo funciona la proteína Fhit, la definición de mecanismos específicos mediante los cuales Fhit modula funciones supresoras tumorales apoptóticas y otros ha sido un desafío. Esto se debió principalmente al hecho de que, hasta hace pocos años, Fhit no tenía compañeros de la proteína confirmó identificados por estudios convencionales destinados a aislamiento de los complejos proteína-proteína. Hemos informado el aislamiento de proteínas que interactúan Fhit-por un enfoque de la proteómica [26]; la investigación condujo al aislamiento y caracterización de un complejo de proteínas Fhit soluble que contiene Hsp10 /Hsp60 y ferredoxina reductasa (Fdxr), entre otras proteínas mitocondriales. En ese estudio, hemos demostrado que complejos Hsp10 /Hsp60 estuvo implicado en la translocación de proteínas en la mitocondria Fhit, donde su interacción con Fdxr estuvo implicado en la modulación de la producción de especies reactivas del oxígeno, el primer paso en la apoptosis mediada por Fhit. Este enfoque, dirigido a la identificación de complejos de proteínas, sugirió que los estudios de seguimiento para identificar otros interactores FHIT y sus vías de señales funcionales. En los estudios de fraccionamiento subcelular, se detectó proteína Fhit en todos los compartimentos celulares, pero núcleo [26]. Por lo tanto, hemos aislado nuevos complejos de proteínas a partir de lisados de proteínas Fhit A549 enriquecidas en las membranas celulares. Este enfoque produce una lista de candidatos, los interlocutores FHIT, algunos de los cuales también fueron identificados en nuestro análisis anterior [26]. Entre estos nuevos candidatos, se había informado anexina A4 (ANXA4) para jugar un papel en la resistencia a los medicamentos, con su expresión aumenta en clones resistentes a paclitaxel [36], un fármaco comúnmente usado en el tratamiento de pacientes con cáncer. Como hemos demostrado en el pasado que Fhit sí está involucrado en la superación de la resistencia a paclitaxel [26], [27], decidimos explorar esta correlación potencial con más detalle.
La interacción entre Fhit y la respuesta a la quimioterapia ha sido ya examinada por Andriani et al [41]. En particular, la expresión Fhit resultó en sensibilidad reducida al etopósido, doxorrubicina, y topotecan. Esta característica se asocia con la regulación por disminución inducida por Fhit de topoisomerasas de ADN I y II. En contraste, la expresión Fhit produjo un ligero aumento en la sensibilidad al cisplatino, como se muestra mediante ensayos de formación de colonias [41].
La inactivación de ambos genes FHIT y TP53 se observa con frecuencia en no pequeñas de cáncer de pulmón de células primarias ( NSCLC) y líneas de células y pueden contribuir a la resistencia a los estímulos apoptóticos provocados por diversos fármacos anti-tumorales [42]. En este estudio, hemos demostrado que la administración de paclitaxel induce tanto Anexina A4 regulación y modificación de su distribución intracelular; de hecho, después del tratamiento con paclitaxel, anexina A4 se mueve desde el citosol a la membrana celular. Curiosamente, Fhit sobreexpresión en células de cáncer de pulmón Fhit-negativos evita la translocación anexina A4 del citosol a la membrana celular; Además, el tratamiento simultáneo de las células cancerosas A549 con Ad
FHIT
y paclitaxel es mucho más eficaz en el desencadenamiento de la apoptosis de las células cancerosas en comparación con los controles; se obtuvieron resultados similares con la administración de paclitaxel a las células A549-agotado A4 anexina. Estos datos sugieren que tanto la anexina A4 sobreexpresión y su membrana plasmática localización subcelular en las células cancerosas resistentes a paclitaxel no es un efecto espectador, sino que desempeña un papel activo en los mecanismos de resistencia a los medicamentos; nuevas investigaciones sobre la función de la anexina A4 en la membrana celular pueden arrojar luz sobre los complejos mecanismos de resistencia a los fármacos en los pacientes con cáncer. Estos
in vitro
resultados más apoyo en un modelo preclínico de cáncer de pulmón; De hecho, tanto
FHIT
terapia génica y A4 anexina agotamiento actuaron sinérgicamente con paclitaxel en la inducción de la regresión del tumor en ratones en comparación con los controles; esta combinación podría ser de interés útiles en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón. En conclusión, la investigación previa y reciente subraya la pérdida Fhit, una característica común en el cáncer humano, como un marcador de mal pronóstico en pacientes con cáncer, lo que sugiere que los tumores Fhit-negativos son propensos al desarrollo de resistencia a los medicamentos.
Materiales y métodos
Declaración de Ética
los ratones se mantuvieron y los experimentos con animales llevados a cabo bajo las directrices institucionales establecidos para el animalario de la Universidad Estatal de Ohio. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Estatal de Ohio. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio (número de protocolo de IACUC: 2010A00000146; fecha de aprobación 8/15/2011). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Experimentos
Cultivo de células y transfección
Las células A549 se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO
2 en el medio de crecimiento apropiado con suplementos añadió como se recomienda. Se utilizaron células HEK-293 para la generación y amplificación de adenovirus recombinantes [18]. Las transfecciones de Anexina 4 pequeños RNAs de interferencia (piscina inteligente, Dharmacon) se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
inmunotransferencia y análisis de fraccionamiento
Las proteínas totales se extrajeron con Nonidet P40 (NP-40 ) tampón de lisis; proteínas citosólicas y de membrana plasmática se extrajeron mediante el sistema de fraccionamiento celular FractionPREP (Biovision). Total de lisados con las proteínas de membrana de plasma enriquecido, que se utilizan tanto para la espectrometría de masas y análisis de las inmunoprecipitaciones, se obtuvieron utilizando Mem-PER eucariota Membrana Kit Protein Extraction (Pierce).
Para la inmunotransferencia, las proteínas (50 g) se separaron en poliacrilamida geles y se transfirieron a membranas de filtro de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en leche en polvo 5% no grasa, se incubaron con anti-Anexina primaria 4, GAPDH, y anticuerpos E-cadherina (Santa Cruz Biotechnology), detectados por los anticuerpos secundarios apropiados, y reveladas por quimioluminiscencia potenciada (ECL; Amersham Inc .).
Protein Interaction Analysis
Co-immunoprecipitation experimentos, con o sin ditiobis [succinimidilpropionato] (DSP), un agente de reticulación de Pierce, se llevaron a cabo mediante la incubación de 1 mg del total lisados de proteínas (que contienen fracción de membrana de plasma enriquecido), ya sea con NIN-TA perlas de níquel de agarosa magnética (Qiagen) o con anti-V5 anticuerpo conjugado con perlas de Sepharose, durante la noche a 4 ° C; Después del lavado, las perlas se hirvieron en 1 x tampón de muestra SDS y las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida al 4-20% (Bio-Rad).
inmunofluorescencia
células A549, pre-infectado con Ad
FHIT
, se fijaron en PFA al 4% (paraformaldeyde) durante 10 min, permeabilized 4 min con Triton al 0,05% y se analizó por microscopía confocal. Anexina endógena 4 se detectó con un anticuerpo primario de BD; anticuerpo secundario (594 nm) era de Molecular Probes.
in vitro tasa de crecimiento evaluación
Las células A549 se sembraron a 1 x 10
5 células por placa de 60 mm de diámetro y con infección simulada o infectadas con Ad
GFP
o Ad
FHIT
a MOI (multiplicidad de infección) 50 y se trata con 800 nM de paclitaxel. Las células fueron monitoreados y contados en veinticuatro intervalos h después de la infección. Paclitaxel (LC-Laboratories) se disolvió en DMSO como una solución madre 1 mM.
Generación de vectores adenovirales recombinantes
Los adenovirus llevar a
FHIT
o
FHIT-
His6 ADNc (Ad
FHIT
y Ad
FHIT-
His6, respectivamente) bajo el control transcripcional de un promotor de citomegalovirus fueron generados por recombinación homóloga en células HEK-293 como se ha descrito anteriormente [26] . El anuncio
Gráficos vectoriales GFP se utilizó como control.
digestión de proteínas
complejos de proteínas inmunoprecipitadas se digirieron con tripsina de grado de secuenciación de Promega utilizando los Multiscreen Solvinert placas de filtro de Millipore (Bedford ).