Extracto
Introducción
El uso de los inhibidores de la 5-alfa reductasa (5-ARI) finasterida y la dutasterida para la prevención del cáncer de próstata sigue siendo objeto de debate. La FDA concluyó recientemente que el aumento de la prevalencia de los tumores de alto grado entre los tratados con 5-ARI pacientes no debe ser descuidado, y decidieron no permitir el uso de 5ARI para la prevención del cáncer de próstata. Este estudio se realizó para verificar los efectos de la finasterida en la migración celular y la invasión de la próstata y los relativos enzimas /proteínas en líneas celulares tumorales prostáticas humano normal y.
Materiales y Métodos
RWPE-1, células LNCaP, PC3 y DU145 se cultivaron a 60% de confluencia y se expusieron durante diferentes períodos a cualquiera de 10 mM o 50 mM finasteride que se diluyó en medio de cultivo. Se recogieron los medios condicionados y se concentraron, y se determinaron MMP2 y MMP9 actividades y TIMP-1 y la expresión de proteínas TIMP-2. La viabilidad celular, se analizó la migración y la invasión, y los extractos de células restantes se sometieron a detección (AR) del receptor de andrógenos mediante técnicas de Western Blot. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Resultados
La viabilidad celular no se vio afectada significativamente por la exposición finasterida. Finasteride regulación a la baja de manera significativa las actividades de MMP2 y MMP9 en RWPE-1 y células PC3 y la MMP-2 en las células DU145. TIMP-2 expresión en células RWPE-1 se upregulated después de la exposición. La invasión de células de las cuatro líneas celulares sometidas a prueba fue inhibida por la exposición a 50 mM de finasteride, y la inhibición de la migración ocurrió solamente para las células RWPE-1 y LNCaP. AR fue expresada por LNCaP, RWPE-1 y células PC3.
Conclusiones
A pesar de que el debate sobre la mayor incidencia de cáncer de próstata de alto grado entre los pacientes tratados con 5-ARI restos, nuestros hallazgos indican que el finasteride puede atenuar la agresividad del tumor y la invasión, lo que podría variar en función de la capacidad de respuesta de andrógenos de células de la próstata de un paciente
Visto:. Moroz a, FK Delella, Almeida R, Lacorte LM, Fávaro WJ, Deffune e, et al. (2013) Cell finasteride inhibe el cáncer de próstata humano Invasión a través de MMP2 y MMP9 regulación a la baja. PLoS ONE 8 (12): e84757. doi: 10.1371 /journal.pone.0084757
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Enero, 2013; Aceptado: 27 Noviembre 2013; Publicado: December 30, 2013
Derechos de Autor © 2013 Moroz y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una FAPESP (el Consejo de Investigación del Estado de Sao Paulo) financiación (proceso n. 2010 /16671-3) y un doctorado CAPES beca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común en los hombres y las cuentas por $ 8 mil millones y un costo promedio de $ 81.658 por paciente, desde el diagnóstico hasta la muerte, en los EE.UU. [1]. Un número de agentes que actualmente están siendo investigados por la prevención del cáncer de próstata [2]. Finasteride, un tipo 2 5-alfa reductasa (5-ARI) que bloquea la conversión de testosterona (T) en dihidrotestosterona (DHT) [3], es un medicamento bien conocido que se utiliza para el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata [ ,,,0],4] y se ha sugerido para actuar como agente quimiopreventivo del cáncer de próstata. La Prostate Cancer Prevention Trial (PCPT) demostró una reducción del 24,8% en los de grado bajo en general y el riesgo de cáncer de próstata con la administración de finasterida. Sin embargo, los cánceres de alto grado se observaron en el 6,4% de los pacientes tratados con finasterida, en comparación con el 5,1% de los hombres que recibieron un placebo [5], [6]. Este hallazgo condujo a una pregunta importante: no finasterida inducir cáncer de alto grado o aumentar su detección? Esta pregunta fue seguida de un intenso debate sobre la sobrestimación de hecho o de artefactos de los casos de alto grado en los pacientes tratados con finasterida [3], [7], que dividieron a los urólogos y los investigadores de la próstata. Más recientemente, el juicio REDUCIR informó resultados similares después del tratamiento con dutasterida 5-ARI. Reconociendo la importancia de esta cuestión, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha vuelto a analizar recientemente los datos del PCPT y reducir los ensayos y concluyó que los tratamientos finasterida y la dutasterida podrían aumentar el riesgo de una forma más grave de cáncer de próstata. Por lo tanto, se decidió no permitir el uso de estos agentes para la prevención del cáncer de próstata [8]. Además, un estudio experimental publicado recientemente reveló resultados similares a los del PCPT y reducir los ensayos [9]. Los autores demostraron que la incidencia de carcinoma poco diferenciado se incrementó en ratones C57BL /6 × TRAMP ratones FVB alimentados con una dieta suplementada finasteride, y se considera esto como un efecto adverso del tratamiento finasteride, en lugar de un efecto de artefactos [9].
casos de cáncer de próstata de grado alto, tales como los observados en los pacientes tratados con 5-ARI, están asociados comúnmente con un aumento de la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), una familia de zinc y calcio endopeptidasas dependientes que son responsables de extracelular matriz (ECM) remodelación, lo que contribuye a fenotipos invasivos y metastásicos de células de cáncer de próstata [10] - [13], y disminución de la expresión de inhibidor de tejido de metaloproteinasas de la matriz (TIMP) [13], una clase de origen natural inhibidores de las MMP que firmemente regular su actividad y se expresan en una variedad de tipos de células [11].
Debido a que la degradación de ECM se sabe que es un paso importante en la progresión del cáncer [10], [12], [13], nuestro grupo ha estado investigando los efectos de la finasterida en la modulación de MMP y TIMP en un intento de explicar por qué los pacientes tratados con finasterida tenían cánceres de próstata de grado más alto. Hemos demostrado previamente que el tratamiento finasteride aumentó la expresión de MMP9 y la disminución de la expresión de MMP2 en la rata de próstata ventral [14], [15] y que downregulated los niveles de mRNA de TIMP-1 y TIMP-2 en la rata ventral de próstata [ ,,,0],15]. Por otra parte, hemos demostrado recientemente que la finasterida también reduce la actividad gelatinolítica MMP2 en una variedad de líneas celulares de próstata humano [16]. Hemos realizado el presente estudio para determinar si el tratamiento con finasterida interfiere con la migración y el potencial invasivo de la línea normal de las células de próstata humana las líneas de células epiteliales tumorales LNCaP, PC3 y DU145, que tienen diferente del receptor de andrógenos (AR) perfiles RWPE-1 y.
Materiales y Métodos
cultivos celulares
AR Un vial cada uno de los (no tumoral, tipo salvaje AR
+) RWPE-1, LNCaP (tumoral, mutado
+) y PC3 (tumoral, AR
-) líneas celulares fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC ™). DU145 (tumoral, AR
-) las células fueron amablemente donadas por el Dr. Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo, del Departamento de Fisiología - UFSCar, Brasil (adquirió originalmente de la ATCC ™). Aunque no isogénicas, se seleccionaron estas líneas celulares para ser representativa de 3 distintas situaciones in vivo de exposición finasteride: un paciente con una próstata normal (representada in vitro por la línea celular RWPE-1), un paciente con cáncer de próstata andrógeno-sensibles (representado in vitro por la línea celular LNCaP) y un paciente con cáncer de próstata resistente a la castración (representado in vitro por el PC3 y las líneas celulares DU145). Los experimentos se llevaron a cabo dos meses después de la adquisición de las líneas celulares. Las células RWPE-1 se cultivaron utilizando queratinocitos medio libre de suero (Invitrogen ™) suplementado con 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina, 5 ng /factor de crecimiento epidérmico humano recombinante ml (EGF) y 1% de antibiótico /solución antimicótica (Invitrogen ™). Las células LNCaP, PC3 y DU145 se cultivaron utilizando medio RPMI (Invitrogen ™) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) (Invitrogen ™) y 1% de antibiótico /antimicótico solución (Invitrogen ™). Todos los procedimientos de cultivo celular se realizaron bajo estrictas condiciones de esterilidad y se mantienen dentro de un 5% de CO
2 incubadora (Thermo Scientific ™). El vial inicial de cada línea celular se amplió hasta 10 viales e individualmente criopreservados en el medio de cultivo celular respectivo suplementado con 20% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich ™) para constituir el banco de células.
exposición Finasteride y la viabilidad celular
Todas las líneas celulares se descongelaron y se sembraron individualmente en 2 × 10
4 células /cm
2 en placas de 6 pocillos de cultivo (TPP ™). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado. Las concentraciones de finasteride fueron elegidos en base a un estudio previo, en el que 10 M y 50 M indujeron la modulación metabólica significativa sobre las células de la próstata tumoral [17]. Al llegar a 60% de confluencia, las células se lavaron tres veces con D-PBS estéril (GIBCO /Invitrogen ™), y se añadió el medio de cultivo recomendado (FBS libre) como sigue: 1) tratamiento de control - suplementado con 0,1% de DMSO; 2) una dosis baja de tratamiento finasterida - suplementado con 0,1% de DMSO más 10 M finasterida (Sigma ™); y 3) tratamiento con altas dosis de finasterida - suplementado con 0,1% de DMSO más 50 M finasterida (Sigma ™). Finasteride se diluyó en DMSO, y la solución DMSO /finasteride se diluyó en medio de cultivo. Durante todos los tratamientos de exposición finasterida, se observaron las células bajo un microscopio de contraste de fases invertido (Zeiss ™) para la morfología general y la contaminación bacteriana y fúngica. Después de 24, 48 y 72 horas de exposición, se recogió el medio condicionado (CM) y se almacenó individualmente a -80 ° C. Las células unidas restantes se recuperaron individualmente por digestión con tripsina, y una alícuota se evaluó la viabilidad mediante tinción con azul de tripano. Las células restantes se centrifugaron individualmente a 1200 rpm durante 10 minutos para obtener un sedimento celular para producir extractos de proteínas. FBS se eliminó durante la exposición finasterida, ya que se sabe que contienen altos niveles de MMP, que interferirían con los ensayos de gelatinolytic posteriores.
Medio Acondicionado y extracto de células Procesamiento
El CM se concentró 10 veces utilizando Centriprep® 10.000 MWCO (Millipore ™) tubos por centrifugación a 4900 rpm durante 30 minutos. Los respectivos sedimentos celulares se sometieron a la extracción de proteínas utilizando un filtro en casa-producido 50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, mM CaCl 10
2, 0,1% de Triton X-100 de tampón de extracción de proteína suplementado con 1% de cóctel inhibidor de la proteasa (Sigma-Aldrich ™) para obtener extractos de células. El tampón de extracción de proteínas fue elegido después de la comparación con un tampón comercial (tampón RIPA, Thermo Scientific ™), que reveló-mejor conservado actividad gelatinolítica MMP por zimografía (datos no mostrados). La extracción de proteínas se llevó a cabo mediante pipeteo repetitivo y agitación en vórtex, seguido de 1 hora de reposo en hielo y una centrifugación final a 5000 RPM durante 20 minutos a 4 ° C. Finalmente, los extractos de proteínas CM y se presentaron a la cuantificación de proteínas utilizando un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) y la proteína espectrofotómetro A280 /260 de protocolo. Es importante hacer hincapié en que el CM fue FBS libre; Por lo tanto, todas las proteínas en el CM fueron producidos por las células.
MMP2 y MMP9
Ensayos de actividad
El total (pro-forma + forma activa) actividades de MMP2 y MMP9 en el CM y extractos celulares se midieron utilizando la Actividad los ensayos Biotrak® (GE Healthcare Life Sciences ™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cantidades iguales (100 g) de CM agrupado o extracto de células (por tratamiento por triplicado) se pipetearon en una microplaca de 96 pocillos recubierta con anticuerpos anti-humana-MMP2 o anti-humano-MMP9. Normas de humana recombinante pro-MM2 o pro-MMP9 se pipetearon en los pocillos respectivos, con valores que van de 0,19 a 3 ng /ml (para la MMP-2) y 0.125 a 4 ng /ml (para MMP9) según las instrucciones del fabricante. Después de una incubación durante la noche a 4 ° C y el lavado, 50 l de una p-aminofenilmercúrico acetato 0,5 mM solución (APMA) se pipeteó en cada pocillo para activar los pro-formas de MMP2 y MMP9. se añadió (uroquinasa modificados + S-2444 ™ sustrato peptídico) Posteriormente, 50 l de un reactivo de detección a todos los pocillos. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 6 (para MMP2) o 2 horas (para MMP9), y se midió la densidad óptica integrada (IOD) a 405 nm usando un lector de placas espectrofotométrico. Por último, un factor de cambio gráfico se hizo dividiendo los IODs obtenidos a partir de las CM /extractos tratados por sus respectivos valores de control. Por otra parte, las actividades de MMP2 y MMP9 se evaluaron utilizando zimografía de gelatina estándar, tal como se describe anteriormente [16].
TIMP-1 y TIMP-2 Proteína cuantificación
El TIMP-1 y TIMP-2 los niveles de proteína en el CM se midieron mediante ELISA en fase sólida Biotrak® Ensayos humano (GE Healthcare Life Sciences ™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cantidades iguales (100 g) de CM agrupado (por tratamiento por triplicado) se pipetearon en una microplaca de 96 pocillos recubierta con anticuerpos anti-humanos-TIMP-1 o anti-humano-TIMP-2. Normas de recombinante humano TIMP-1 o TIMP-2 se pipetearon en los respectivos pocillos de la placa, con valores que van de 3,13 a 50 ng /ml (para TIMP-1) y de 8 a 128 ng /ml (para TIMP-2). Después de una incubación de 2 horas a 25 ° C y el lavado, 100 l de una solución de conjugado de peroxidasa se pipeteó en todos los pocillos, y las placas se incubaron adicionalmente durante 2 horas a 25 ° C. Posteriormente, se añadió 100 l de una tetrametilbencidina (TMB) /peróxido de hidrógeno solución a todos los pocillos. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la IOD se midió a una nm 630 usando un lector de placas espectrofotométrico. Por último, un factor de cambio gráfico se hizo dividiendo los IODs obtenidos de los tratamientos tratados por sus respectivos valores de control.
Migración de ensayo
El potencial de migración de todas las líneas celulares se investigó utilizando la BD BioCoat ™ Migración Insertar (BD Biosciences ™). La membrana porosa (8 micras de tamaño de poro) se hidrató con 500 l de medio a base de bicarbonato libre de suero durante 2 horas. Después de la hidratación, 500 l de medio RPMI 1640 con FBS al 5% (para LNCaP, las células PC3 y DU145) se añadió o 500 l de medio de queratinocitos con FBS al 5% (para las células RWPE-1) a la cámara baja del 24 pocillos plato. Estas líneas celulares de próstata se cultivaron previamente en 50 mM Medio Medio o control finasteride durante 72 horas, se recogieron e individualmente cultivada en 200 l de medio libre de suero (con o sin 50 mM finasteride) en la pieza de inserción a una densidad de 1 × 10
5 células totales. Las placas se incubaron con 5% de CO
2 a 37 ° C durante 22 horas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células que no migran, los cuales estaban ubicados en la parte superior de la membrana de inserción, se rasparon con un hisopo de algodón. Las células que migraron a través de los poros de la membrana, que fueron atraídos por el FBS, se fijaron en metanol al 100% y se tiñeron con solución de azul de toluidina al 0,1% durante 2 minutos. Las células migraron fueron fotografiados digitalmente bajo magnificación de 200X utilizando un microscopio óptico (Nikon ™). Los experimentos se realizaron por triplicado, y de 5 campos al azar fueron fotografiados y se sometieron a recuento celular utilizando el software gratuito ImageJ®. El índice de migración se calculó como la media ± SD de células contadas por campo, y las células de control se compararon con las células tratados con finasterida. fibroblastos de piel humana (ATCC WS1-) se utilizaron como controles positivos y fueron expuestos a las mismas condiciones de ensayo como las células de la próstata.
Curación de Heridas Ensayo
La migración celular se investigó adicionalmente usando una migración diferente ensayo para la PC3 y DU145 líneas celulares, que fueron cultivadas en placas de 6 pocillos a 4 x 10
4 células /cm
2 hasta que se alcanzó el 100% de confluencia. Las monocapas fueron heridos (rayado) en una línea recta a través del pozo con una punta de pipeta de 200 l usando una, de 6 pocillos tapa de la placa de cultivo estéril como una regla, para obtener un rasguño regular. A continuación, las monocapas de heridos se lavaron dos veces con D-PBS (GIBCO /Invitrogen ™) para eliminar los restos celulares. El medio de cultivo con o sin 50 mM de finasteride se añadió a los pocillos de control y de tratamiento. El área de la herida fue inspeccionada posteriormente después de 24, 48, 72 y 96 horas usando un microscopio de contraste de fase invertida con la cámara digital. La velocidad de cicatrización de la herida se calculó como el porcentaje de la herida inicial hasta el cierre total de la herida en los diferentes puntos de tiempo utilizando el software gratuito ImageJ®.
Matrigel invasión de ensayo
Los potenciales invasivos de todos cuatro líneas celulares fueron investigados utilizando BD BioCoat Matrigel ™ ™ invasión Inserción (BD Biosciences ™). La membrana porosa matrigel recubierto (8 micras de tamaño de poro) se hidrató con 500 l de medio a base de bicarbonato libre de suero durante 2 horas. Después de la hidratación, 500 l de medio RPMI 1640 con FBS al 5% (para LNCaP, las células PC3 y DU145) se añadió o 500 l de medio de queratinocitos con FBS al 5% (para las células RWPE-1) a la cámara baja del 24 pocillos plato. Estas líneas celulares de próstata se cultivaron previamente en 50 mM Medio Medio o control finasteride durante 72 horas, se recogieron y se cultivaron individualmente en 200 l de medio libre de suero (con o sin 50 mM finasteride) en la pieza de inserción a una densidad de 1 × 10
5 células totales. Las placas se incubaron en una incubadora con 5% de CO
2 a 37 ° C durante 22 horas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células no invadida en la parte superior de la membrana de inserción se rasparon con un hisopo de algodón. Las células que invadieron la matriz de Matrigel y migraron hacia el lado opuesto de la membrana, que fueron atraídos por las FBS, se fijaron en metanol al 100% y se tiñeron con solución de azul de toluidina al 0,1% durante 2 minutos. Las células invadidas se fotografiaron digitalmente bajo magnificación de 200X utilizando un microscopio óptico (Nikon ™). Los experimentos se realizaron por triplicado, y de 5 campos al azar fueron fotografiados y se sometieron a recuento celular utilizando el software gratuito ImageJ®. El índice de invasión se calculó como la media ± SD de células contadas por campo, y las células de control se compararon con las células tratados con finasterida.
Western Blotting
Se usaron los extractos de células restantes para determinar los niveles de expresión de AR. Esta determinación se llevó a cabo debido a la literatura discrepante en la expresión de estos receptores por estas líneas celulares. Brevemente, una muestra de proteína (70 g) que había sido cuantificados previamente usando el NanoDrop (Thermo Scientific ™) espectrofotómetro 2000 se cargó en un gel de SDS-PAGE 10% en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Sigma Co ™), que posteriormente fue bloqueada con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM y 0,1% de Tween-20 (TBS- T) durante 1 hora. Las membranas se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche con el anticuerpo AR (Genetex ™). Las membranas se lavaron 5 veces durante 5 minutos en TBS-T y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios, conjugados con peroxidasa adecuadas (Abcam ™). Después de lavar en TBS-T, las membranas se visualizaron utilizando 3,3 'diaminobencidina y fotografiada.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos fueron analizados utilizando el software INSTAT ™ usando el de dos colas prueba de la t de Student (P & lt; 0,05) para comparar los diferentes tratamientos y sus respectivos controles (viabilidad, la migración, la invasión), o mediante el test post hoc ANOVA y de Dunnet (MMP y TIMP ensayos)
resultados
.
la exposición y la viabilidad celular Finasteride
la viabilidad celular no se vio afectada significativamente por ninguna de las dosis de finasterida que se emplearon en la presente investigación. Células no presentan aspectos de la muerte celular o la pérdida de viabilidad, incluso después de 72 horas de exposición a 50 mM finasterida (Figura S1).
MMP2 y MMP9 Ensayos de actividad
En las condiciones de control, se observaron que las células PC3 secretan el doble de MMP2 y MMP9 en su CM como células RWPE-1 (valores IOD - datos no mostrados). células LNCaP no secretan niveles detectables de MMP2 o MMP9 en su CM (IOD valores de datos - no se muestra). Sin embargo, las células DU145 secretada altas cantidades de MMP2 y MMP9 (Figura 1a). Para los extractos de células, no hay línea celular presentó las actividades MMP2 o MMP9 detectables, lo que demuestra que estas líneas celulares no tienen MMPs en su membrana (datos no mostrados).
a) El medio acondicionado (CM) de no tratado (Control ) y las células DU145 tratados con finasterida se recogió, se concentró y se analizaron en cuanto a las actividades de MMP2 y MMP9 utilizando un ensayo de zimografía de gelatina. (S) Normas, (P) de extracto de tejido de una úlcera gástrica que se utilizó como control positivo. Estas células secretan altas cantidades de MMP2 y MMP9 en su CM, como se muestra por las bandas brillantes en el fondo oscuro. b) finasterida en dosis altas (50 mM) regulado por disminución la actividad de MMP-2 hasta el 43% después de 72 horas de exposición, tal como se cuantifica utilizando el software ImageJ ™. Los datos se expresan como factor de cambio gráfica de los valores de IOD que se obtuvieron de las bandas en el (a) cifra de células tratados con finasterida más de las células de control. (**) Los valores estadísticamente significativa con p & lt; 0,01. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Tras la exposición finasteride, se observó que, para las células RWPE-1 a la dosis baja empleada (10 mM), 72 horas de exposición fue suficiente para inducir la regulación por disminución significativa tanto de la actividad de ambas MMPs en la CM (Figura 2a); estos valores se redujeron en 25% y 30% para MMP2 y MMP9, respectivamente, en relación con los valores de control. Por otro lado, para la dosis alta finasteride empleado (50 mM), las actividades de MMP2 y MMP9 se downregulated significativamente en todos los puntos que se probaron, hasta el 90% y el 55% después de 72 horas de exposición, respectivamente (Figura 2a) se recogieron.
a) el medio acondicionado de tratar (control) y se trató finasteride-células RWPE-1, se concentró y analizó para las actividades de MMP2 y MMP9 utilizando sus respectivos Ensayos de actividad Biotrak®. finasteride de dosis baja (10 mM) durante 72 horas de exposición downregulated MMP2 y MMP9 actividad de 25% y 30%, respectivamente, en comparación con los valores de control. finasteride de dosis alta (50 mM) downregulated actividades MMP2 y MMP9 en todos los puntos de tiempo ensayados, hasta 90% y 55% después de 72 horas de exposición, respectivamente. se recogieron b) El medio acondicionado de tratar (control) y se trató finasteride-células RWPE-1, se concentró y se analizó para TIMP-1 y TIMP-2 expresión de la proteína usando sus respectivos ensayos Biotrak®. la exposición finasterida, en ambas dosis, induce la regulación positiva de la expresión de TIMP-2 en el punto de 72 horas, hasta un 150% más que la expresión de los niveles de control. Los datos se expresan como factor de cambio gráfica de los valores de IOD que se obtuvieron para las células tratados con finasterida más de las de las células de control. (*) Los valores estadísticamente significativa con p & lt;.
0,05
En la línea celular PC3, exposición a dosis bajas finasterida indujo la regulación a la baja significativa de las actividades de MMP2 y MMP9 en sólo el punto de tiempo de 24 horas (Figura 3a ). Por otra parte, altas dosis de finasteride inducida significativamente la regulación a la baja de MMP2 en los puntos de tiempo de 48 horas y 72 horas y de MMP9 en todos los puntos que se evaluaron, con una reducción de hasta 70% (Figura 3a).
se recogió
a) el medio condicionado de células PC3 tratadas y no tratadas con finasterida, se concentró y se analizó la actividad de MMP2 y MMP9 utilizando sus respectivos Ensayos de actividad Biotrak®. Baja dosis de exposición finasterida (10 M) no indujo la regulación a la baja de las actividades de MMP2 o MMP9, excepto en el punto de tiempo de 24 horas. Altas dosis de finasterida indujo la regulación a la baja de la MMP-2 en los puntos de tiempo de 48 horas y 72 horas y de MMP9 puntos de tiempo evaluados en absoluto, una reducción de hasta el 70%. se recogió b) El medio acondicionado de sin tratar (control) y células PC3 tratados con finasterida, se concentró y se analizó para TIMP-1 y TIMP-2 expresión de la proteína usando sus respectivos ensayos Biotrak®. exposición Finasteride no indujo ninguna modulación significativa de TIMP-1 y TIMP-2 expresión, excepto para la dosis de 10 mM finasteride a las 24 horas de exposición. Los datos se expresan como un factor de cambio de los valores de IOD obtenidos para las células tratadas con finasterida más de las células de control. (*) Los valores estadísticamente significativa con p & lt;. 0.05
Dado que los resultados de las otras líneas celulares mostraron que sólo el finasteride de dosis alta ejerce efectos sobre la actividad MMP, sólo la alta dosis en 72 horas fue investigado por la línea celular DU145. Para la línea celular DU145, altas dosis de finasteride indujo una regulación a la baja significativa de las actividades de MMP2 de aproximadamente 43% (Figura 1b) (p & lt; 0,01). Sin embargo, las actividades MMP9 no fueron significativamente modulada por la exposición finasteride (Figura 1b).
TIMP-1 y TIMP-2 de proteínas Cuantificación
Cuando las líneas celulares se cultivaron sin finasteride, células PC3 produjo dos veces más TIMP-1 de las células RWPE-1; sin embargo, la cantidad de TIMP-2 era el mismo (valores IOD). células LNCaP producen bajos niveles de TIMP-1 y TIMP-2, que se acercaba a la menor límite de detección del ensayo (valores IOD). DU145 células producidas grandes cantidades de TIMP-1 (valores IOD - datos no mostrados)
Tras la exposición finasterida de la línea celular RWPE-1 probado, ambas dosis indujeron significativamente la regulación positiva de la expresión de TIMP-2 en la hora 72. punto de tiempo, lo que era hasta un 150% más que la expresión tratamiento de control (Figura 2b). En cuanto a las células PC3, TIMP-1 y TIMP-2 expresión no mostró modulación significativa, excepto para la dosis de finasteride 10 micras, con 24 horas de exposición (Figura 3b). La finasterida no indujo cambios significativos en la expresión de TIMP-1 o TIMP-2 en líneas celulares LNCaP o DU145 (datos no mostrados).
Migración de ensayo
En medio de cultivo regular, el líneas celulares ensayadas exhibieron diferentes potenciales de migración. Las células migraron RWPE-1 más (media de 32 células /campo) que las células PC3 (media de 24 células /campo), los cuales, a su vez, emigraron más de las células LNCaP (media de 8 células /campo). DU145 fue la línea celular más que migra investigado (media de 85 células /campo) (Figura 4). Después de 72 horas de exposición finasteride (50 M), la migración se inhibió de manera significativa en las células RWPE-1 (P & lt; 0,01) y las células LNCaP (p & lt; 0,05). PC3 y la migración de células DU145 fue ligeramente inhibido; sin embargo, la inhibición no fue significativa (p & gt; 0,05) (Figura 4). fibroblastos WS1 humana (control positivo) migran rápidamente a través de las membranas (Figura 4) guía.
Las líneas celulares de próstata se cultivaron previamente en 50 mM finasteride o medio de control durante 72 horas y se cultivaron individualmente en 200 l de suero libre de medio (con o sin 50 mM finasteride) en el inserto de la migración a una densidad de 1 x 10
5 células totales. Después de 22 horas, se fijaron las células que migraron a través de la membrana porosa 8 micras, se tiñeron y se contaron dentro de los cinco campos aleatorios utilizando un microscopio de luz. Los experimentos se realizaron por triplicado. fotomicrografías representativas de células no tratadas y tratadas con finasterida se muestran en el lado izquierdo. fibroblastos humanos (línea celular WS1) se emplearon como células de control de la migración positiva y una imagen representativa se muestra en la parte inferior izquierda. Barra de escala = 40 micras. Finasteride inhibe significativamente la migración de las células de las líneas celulares RWPE-1 y LNCaP, pero no del PC3 y DU145 líneas celulares. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de las células que migran. (*) Los valores estadísticamente significativa con p & lt; 0,05. (**) Los valores estadísticamente significativa con p & lt;. 0,01
Curación de Heridas Ensayo
Para confirmar que los potenciales de migración de líneas celulares PC3 y DU145 no fueron influenciados por la exposición finasterida, una diferente ensayo de migración se llevó a cabo para estas líneas celulares. Después de que el área de la herida fue infligido sobre las monocapas, era posible observar que, para ambas líneas celulares, finasteride migración de células ligeramente inhibido (Figura 5a y 5c); Sin embargo, esta diferencia no fue significativa (Figura 5b y 5d), que confirmó los resultados que se obtuvieron a partir del ensayo de migración de inserción anterior (Figura 4).
Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos a 4 x 10
4 células /cm
2 hasta que se alcanzó el 100% de confluencia. Las monocapas se rascaron en una línea recta, y entonces las monocapas de heridos se les dio medio de cultivo con o sin 50 mM finasteride. El área de la herida fue inspeccionada después de 24, 48, 72 y 96 horas usando un microscopio de contraste de fase invertida con una cámara digital. a) Imágenes representativas que muestran el cierre de la herida de las células PC3 tratados con finasterida y de control en 0 a 72 horas. Rojo destacó áreas representan el área de la herida abierta. Barra de escala = 50 micras. áreas b) El rojo destaca inicial se midieron utilizando el software ImageJ ™, y las áreas restantes se calculan como un porcentaje del área de la herida inicial. Un gráfico de la herida cierre se realizó dividiendo los valores del área que se obtuvieron en los puntos de tiempo indicados para el control y las células tratados con finasterida. Finasteride inhibe ligeramente la migración celular; sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p & gt; 0,05). c) Imágenes representativas que muestran el cierre de la herida de las células DU145 tratados con finasterida y de control en 0 a 72 horas. Rojo destacó áreas representan el área de la herida abierta. Barra de escala = 50 micras. d) Como se observa para las células PC3, finasterida migración celular ligeramente inhibido (p & gt;. 0,05) guía empresas
Matrigel invasión de ensayo
En medio de cultivo regular, las líneas celulares exhibieron diferentes potenciales de invasión . DU145 y PC3 células fueron las líneas celulares más invasivas, con un medio de 97 células /campo y 75 células /campo, respectivamente (Figura 6). La línea celular LNCaP, que también era tumoral, curiosamente exhibió un potencial invasivo baja, con una media de 5 células /campo (Figura 6). La línea celular no tumoral RWPE-1 también exhibió un bajo potencial invasivo, como se esperaba, con una media de 9 células /campo (Figura 6).
Las líneas celulares de próstata se cultivaron previamente en 50 mM finasterida o control medio durante 72 horas y cultivado individualmente en 200 l de medio libre de suero (con o sin 50 mM finasteride) en el inserto invasión Matrigel® a una densidad de 1 x 10
5 células totales. Después de 22 horas, se fijaron las células que invadieron a través de la matriz de Matrigel y membrana porosa, se tiñeron y se contaron dentro de los cinco campos aleatorios utilizando un microscopio de luz. Los experimentos se realizaron por triplicado. Imágenes representativas de las células no tratadas y tratadas con finasterida se muestran en el lado izquierdo. Barra de escala = 40 micras. Finasteride inhibe significativamente la invasión de células de todas las líneas celulares ensayadas. Los datos se expresan como la media ± SD de las células invasoras. (*) Los valores estadísticamente significativos, con p & lt; 0,05. (**) Los valores estadísticamente significativos, con p & lt; 0,01. (***) Los valores estadísticamente significativos, con p & lt;. 0.001
El finasteride inhibe la invasión de células en todas las líneas celulares ensayadas. DU145 y la invasión de células PC3 se redujo significativamente (p & lt; 0,001), seguido de RWPE-1 (p & lt; 0,01) y LNCaP (p & lt; 0,05). (Figura 6)
Western Blotting
AR