Extracto
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto quimiopreventivo de una novela de flavonoides, ampelopsin (AMP) sobre el crecimiento y la metástasis de las células del cáncer de próstata. AMP mostró la actividad más potente en la inhibición de la proliferación de LNCaP sensible a andrógenos y, en menor medida, las líneas celulares de cáncer de PC-3 humano de próstata independientes de andrógenos in vitro, principalmente por la inducción de la apoptosis asociada a la regulación por disminución de Bcl-2. Por otro lado, AMP mostró mucha menos actividad en la inhibición de la proliferación de células epiteliales de próstata normales que la de líneas celulares de cáncer de próstata. AMP también inhibió la migración y la invasión de células PC-3 in vitro relacionados con la baja regulación de la expresión de CXCR4. En el estudio en animales utilizando un modelo ortotópico tumor de próstata, AMP (150 y 300 mg /kg de peso corporal) inhibió el crecimiento de PC 3-tumores y de los ganglios linfáticos y metástasis pulmonares de una manera dependiente de la dosis. En comparación con los ratones de control, los ratones tratados con AMP a 300 mg /kg BW habían reducido el peso del tumor final en 49,2% (P & lt; 0,05), los ganglios nodo metástasis de 54,5% (P = 0,3) y metástasis de pulmón en un 93% (P & lt; 0,05), pero no tenían alteración aparente sobre la ingesta de alimentos o el peso corporal. Las actividades in vivo anti-crecimiento y anti-metástasis de AMP se asociaron con la inducción de apoptosis y la inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata, la reducción de la angiogénesis del tumor de próstata, y la reducción de la expresión de CXCR4. Nuestros resultados proporcionan evidencia de apoyo para justificar una mayor investigación para desarrollar AMP como un agente candidato eficaz y seguro novela contra la progresión y metástasis de cáncer de próstata
Visto:. Ni M, Y Gong, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) flavonoides ampelopsin inhibe el crecimiento y la metástasis de cáncer de próstata in vitro y en ratones. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10.1371 /journal.pone.0038802
Editor: Rakesh K. Srivastava, de la Universidad de Kansas Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Diciembre, 2011; Aceptado: 10-may de 2012; Publicado: 5 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Ni et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación del Ministerio de Salud de china & amp; Estados Fujian Provincial de Salud y Educación (WKJ2008-2-60), Fundación de Fujian Provincial del Departamento de Ciencia & amp; Tecnología (2011Y0015) y la Fundación para la Investigación Científica de la Explotación de Tecnología Industrial de Fujian Desarrollo y Reforma (2008-762) a FN, y el Departamento de Defensa (PC073988) y NCI /NIH (R21 CA133865) a JRZ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación de la menuscript
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer
próstata es el tumor maligno invasivo más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los EE.UU. se estima que 241,740 nuevos casos de cáncer de próstata se diagnostican alrededor de 28.170 hombres y morirían de cáncer de próstata en los Estados Unidos en 2012 [1]. modalidades terapéuticas actuales para el cáncer de próstata por lo general tienen una efectividad variable, desarrollar metástasis y la resistencia a las drogas, y tienen una alta toxicidad para los tejidos normales. Por lo tanto, la búsqueda de regímenes eficaces con efectos adversos moderados para la intervención de quimioprevención del cáncer de próstata sigue siendo la máxima prioridad en la investigación del cáncer de próstata.
componentes bioactivos en productos botánicos y hierbas medicinales pueden proporcionar candidatos eficaces y seguros para la quimioprevención y /o terapia del cáncer. textos médicos chinos clásicos contienen extensos registros empíricos de las terapias botánicas utilizadas para tratar a pacientes con cáncer y los sistemas relacionados con el cáncer. Sin embargo, la mayoría de estas fórmulas candidato botánicos están recomendados en base a las observaciones clínicas solamente. Por otra parte, estas observaciones clínicas eran casi siempre a partir de estudios observacionales no controlados o informes de casos anecdóticos. Hasta hace muy poco, ha habido poco esfuerzo para desarrollar preclínica mecanicista evaluación, y científica de los productos a base de hierbas botánicas como requisito previo para estudios clínicos en humanos.
La hierba china
Ampelopsis grossedentata
está ampliamente distribuido en Sur de china y se utiliza para tratar la tiña corporis frío y. Contiene una rica fuente de fitoquímicos con ampelopsin (AMP, (2R, 3R) 3,5,7-trihidroxi-2- (3,4,5-trihidroxifenil) -2,3-dihydrochromen-4-ona) la mayor flavonoide. AMP también se llama dihidromiricetina y tiene una estructura similar a la miricetina (3,5,7-trihidroxi-2- (3,4,5-trihidroxifenil) -4-cromenona), un flavonoide natural que se encuentra en las uvas, bayas, frutas, verduras, hierbas y otras plantas con determinadas actividades contra el cáncer. Como el principal constituyente bioactivo de
Ampelopsis grossedentata, España AMP ha demostrado ser el principal responsable de las actividades biológicas observadas, incluyendo hipoglucemia [2], anti-oxidante [3], [4] y hepatoprotector [4], [5] actividades. AMP también mejoró las Chemokinesis y quimiotaxis efectos de granulocitos neutrófilos y monocitos [6].
AMP ha demostrado poseer ciertas actividades contra el cáncer. AMP inhibió el crecimiento [7] y la invasión de células de melanoma in vitro [8], [9], y la metástasis inhibido de tumor de melanoma in vivo [8], [9]. AMP inhibió el crecimiento de tumores de pulmón in vivo mediante la inhibición de la proliferación [10]. AMP tenía actividad anti-angiogénesis mediante la inhibición de la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a partir de células de carcinoma hepatocelular humano in vitro y también inhibió el crecimiento de carcinoma hepatocelular humano en ratones [11]. AMP también invierte resistencia a múltiples fármacos en células de leucemia in vitro, en parte, a través de la disminución de la expresión de la glicoproteína p [12]. Por otro lado, el efecto de la AMP sobre el crecimiento y la progresión del cáncer de próstata no se ha estudiado.
Los objetivos de este estudio fueron evaluar sistemáticamente AMP como quimiopreventivo potencial y candidato terapéutico frente a la progresión del cáncer de próstata en un utilizando tanto in vitro como in vivo en sistemas, y para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes de acciones de AMP. Nuestros resultados proporcionados evidencia experimental para apoyar el desarrollo futuro de la AMP como un agente candidato eficaz y seguro para la prevención y /o terapia del cáncer de próstata.
Resultados
Efectos de la AMP, el extracto total de flavonoides (TFE) y miricetina sobre la proliferación de líneas de cáncer de próstata de células y las células epiteliales normales de la próstata (PrEC) in vitro
primero Se comparó la actividad entre AMP, TFE y miricetina en la inhibición de la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata y PrEC. El análisis de pureza AMP por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) mostró que AMP pureza fue de alrededor del 95%, y el cromatograma de HPLC representativo se muestra en la Fig. S1. TFE concentraciones se calcularon en función de su nivel de AMP, por tanto, la diferencia de actividad entre TFE y AMP se atribuye a otros fitoquímicos en TFE. Como se muestra en la Fig. 1 (A, B, C), AMP y TFE pueden observar las actividades similares en la inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata o células normales de la próstata, lo que sugiere que el AMP es el principal flavonoide bioactivo en TFE. AMP o TFE inhibieron la proliferación de la línea celular LNCaP en el IC
50 de aproximadamente 25 mM (Fig. 1A), y que de la línea celular PC-3 en el IC
de 50 a unos 60 mM (Fig. 1B). Por otro lado, AMP o TFE mostraron mucha menos actividad en la inhibición de la proliferación de células epiteliales normales de la próstata que la de líneas celulares de cáncer de próstata (Fig. 1C), lo que sugiere que AMP o TFE pueden tener efecto secundario moderada /mínima.
R: los efectos dependientes de la dosis de AMP, TFE y miricetina sobre la proliferación de la línea celular LNCaP andrógeno-sensibles; B: Los efectos dependientes de la dosis de AMP, TFE y miricetina sobre la proliferación de la línea celular PC-3 independiente de andrógenos; C: Los efectos dependientes de la dosis de AMP, TFE y miricetina sobre la proliferación de PrEC. Los valores son medias ± SEM de al menos tres experimentos independientes, cada uno por triplicado.
En contraste, miricetina mostraron actividad más potente en la inhibición de la proliferación de PrEC que la de LNCaP o PC-3. Aunque miricetina inhibieron el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata en el IC
años 50 & gt; 60 M (Fig. 1A, 1B), que inhibe las células PrEC de crecimiento en el IC
50 aproximadamente 35 mM (Fig 1C). Debido a la actividad potente contra el cáncer y los efectos secundarios mínimos de AMP, que se utilizó para la evaluación adicional.
Efectos de la AMP en la progresión del ciclo celular de las líneas celulares de cáncer de próstata in vitro
AMP en 25 y 50 mu M aumentó significativamente la fracción de células LNCaP en la fase S de 20% a 28% (P & lt; 0,05) y 74% (P & lt; 0,001), respectivamente (Fig 2B.). Por otro lado, AMP a 25 y 50 mu M aumentó la fracción de células PC-3 en la fase S del 22% al 28% (P & gt; 0,05) y 34% (P & lt; 0,05), respectivamente (Fig. 2E), y en G2 M fases de 17% a 23% (P & lt; 0,05) /y 24% (P & lt; 0,05), respectivamente (Fig 2F.)
a, B, y C:. El efecto dependiente de la dosis de AMP sobre la distribución de células LNCaP en G1 (a), S (B) y G2 /M (C) fases; D, E, y F: El efecto dependiente de la dosis de AMP sobre la distribución de las células PC-3 en G1 (D), S (E) y las fases G2 /M (F). Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes, cada uno por duplicado. Dentro del panel, el valor de una carta es significativamente diferente de la del control, a, p & lt; 0,05; b, p & lt; 0,01; c, p & lt;. 0.001
Varios biomarcadores relacionados con el ciclo celular, tales como ciclo de división celular 2 (CDC2), Cdc25C, la ciclina B1 y la quinasa 2 (CDK2) dependiente de ciclina, se determinaron por Western blot análisis. AMP significativamente downregulated nivel de proteína CDK2 en células LNCaP (Fig. 3B, 3C) y CDC2 nivel de proteínas en las células PC-3 (Fig. 3E, 3F), pero no otros biomarcadores relacionados con el ciclo celular.
A y D : el efecto dosis-dependiente de AMP en la proporción de la fragmentación del ADN (sub-G
0), un marcador de la apoptosis, en LNCaP (a) y PC-3 líneas celulares (D); B y E: Las imágenes de Western Blot representativo que muestra los efectos de la AMP en los niveles de proteína de la progresión del ciclo celular y biomarcadores relacionados con la apoptosis en LNCaP (B) y (e) las líneas celulares PC-3; C y F: La cuantificación de los niveles de proteína alterado de manera significativa en LNCaP (C) y las líneas celulares PC-3 (F) por densitometría después de la normalización de beta-actina. Las imágenes para la cuantificación fueron de al menos dos experimentos independientes. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes, cada uno por duplicado. Dentro del panel, el valor de una carta es significativamente diferente de la del control, a, p & lt; 0,05; b, p & lt; 0,01; c, p & lt;. 0.001
Efectos de AMP sobre la inducción de la apoptosis de líneas celulares de cáncer de próstata in vitro
AMP fragmentación también aumentó significativamente ADN de las células del cáncer de próstata, un sello distintivo de la apoptosis. AMP a 25 y 50 M inducida significativamente la fragmentación del ADN de células LNCaP por 15 veces (P & lt; 0,001) y 70 veces (P & lt; 0,001), respectivamente (Fig. 3A), y las células por 86% 3 PC-(P & lt; 0,05 ) y 270% (P & lt;. 0,001), respectivamente (Fig 3D), en comparación con los controles correspondientes. células LNCaP se trataron adicionalmente con AMP a 25 y 50 mM y los biomarcadores moleculares relacionados con la apoptosis se determinó por análisis de transferencia de Western. AMP apoptosis inducida de células LNCaP y PC-3 asociados con la regulación a la baja de Bcl-2 (Fig. 3B, 3C, 3E, 3F).
El efecto de inducción de la apoptosis de las AMP en la línea celular PC-3 se confirmó utilizando el flujo de Anexina V-PI ensayo de citometría. AMP mostró efectos de la dosis y dependiente del tiempo en la inducción de la apoptosis PC-3 células (Fig. S2).
Efectos de la AMP sobre la migración y la invasión de células PC-3 y regulación a la baja del nivel de proteína CXCR4 in vitro
línea celular PC-3 se utilizó para evaluar el efecto de AMP sobre la migración celular de cáncer de próstata y la invasión. AMP a 25 y 50 M, inhibió la PC-3 migración de células en un 26% (P & lt; 0,05) y 63% (P & lt; 0,01), respectivamente (Fig 4A.), Y la invasión de 27% (P & lt; 0,05) y 45% (P & lt; 0,01), respectivamente (Fig 4B.). El efecto inhibidor de AMP sobre la migración celular PC-3 y la invasión se asoció con regulación a la baja de CXCR4 nivel de proteína (Fig. 4C, 4D), un biomarcador importante para la invasión de células de cáncer y la metástasis. Bajo la condición experimental (tratamiento de 16 hr), AMP no causa citotoxicidad-3 PC celular, tal como se mide por el ensayo de azul de tripano (Fig. S3). Se sugiere que las actividades anti-migración y anti-invasión observados de AMP no son secundariamente debido a su cytotixicity
A:. El efecto dosis-dependiente de AMP sobre la migración de las células PC-3; B: El efecto dependiente de la dosis de AMP sobre la invasión de células PC-3; C: El efecto dependiente de la dosis de AMP en los niveles de proteína CXCR4 en las células PC-3; D: La cuantificación de los niveles de proteína CXCR4 en células PC-3 por densitometría después de la normalización de ß-actina. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes, cada una por duplicado. Dentro del panel, el valor de una carta es significativamente diferente de la del control, a, p & lt; 0,05; b, p & lt; 0,01; c, p & lt;. 0.001
Efectos de AMP sobre el crecimiento y la metástasis de PC-3 tumores de próstata independientes de andrógenos y la modulación de la proliferación de células tumorales, la expresión de la apoptosis y CXCR4 y la angiogénesis de tumores en ratones
Un PC-3 modelo animal tumor ortotópico se utilizó para evaluar el efecto de la AMP en la prevención del crecimiento y la metástasis de tumor de próstata. AMP inhibió tanto el crecimiento del tumor y la metástasis in vivo de una manera dependiente de la dosis. AMP a 150 y 300 mg /kg de peso corporal reducido el peso final del tumor en un 28% (P & gt; 0,05) y 52% (P & lt; 0,05), respectivamente (Fig. 5A), la linfa inhibido linfáticos metástasis en un 27% (P & gt; 0,05) y 43% (P & gt; 0,05), respectivamente (Fig. 5B), y las metástasis pulmonares inhibidos por 57% (p & gt; 0,05) y 86% (P & lt; 0,05), respectivamente (Fig 5C.). Las imágenes representativas de metástasis de pulmón se muestran en la Fig. S4. Por otro lado, los tratamientos AMP no alteraron significativamente la ingesta total de alimentos (Fig. 5D) o el peso corporal final (Fig. 5E).
Los valores son la media de grupo ± SEM (n = 8 /grupo). Dentro del panel, el valor de una carta es significativamente diferente de la del control, a, p & lt;. 0.05
Los análisis de marcadores celulares mostraron que el tratamiento AMP significativamente inducida próstata apoptosis de células de cáncer en un 200% (Fig. 6A, P & lt; 0,001), la reducción de la próstata proliferación de células cancerosas en un 60% (Fig 6B, P & lt;. 0.001) y la angiogénesis del tumor de próstata inhibido en un 58% (Fig. 6C, P & lt; 0,05). Estos resultados confirmaron que AMP inhibió el crecimiento de tumores de próstata mediante la inducción de la apoptosis, reduciendo la proliferación, y la inhibición de la angiogénesis de tumores de próstata in vivo. Las imágenes representativas de los biomarcadores celulares se muestran en la Fig. S5. El tratamiento AMP también redujo la expresión de proteína CXCR4 en un 30% en los tumores de próstata (Figura 6D, P & lt;. 0,05).
Los valores son la media de grupo ± SEM (n = 8 /grupo). Dentro del panel, el valor de una carta es significativamente diferente de la del control, a, p & lt; 0,05; c, p. & lt; 0,001
Discusión
En el presente estudio, se encontró que el AMP inhibió significativamente la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata a través de la inducción de la apoptosis asociada con la regulación a la baja de la expresión de Bcl2, y la migración de células de cáncer de próstata suprimida y la invasión asociados con la regulación negativa de la expresión de CXCR4 in vitro. El estudio en animales confirmó además que AMP redujo significativamente el peso del tumor final asociado con la inducción de apoptosis de las células de próstata cáncer, la inhibición de la proliferación de células de cáncer de próstata y la reducción de la angiogénesis del tumor de próstata, y metástasis pulmonares inhibió significativamente. Por otro lado, AMP a dosis eficaces no mostró efectos adversos significativos en la ingesta de alimentos o el peso corporal. Este es el primer estudio, a lo mejor de nuestro conocimiento, que demuestra el efecto inhibidor de AMP sobre el crecimiento y la metástasis del cáncer de próstata in vitro y en un modelo ortotópico tumor clínicamente relevante.
Los estudios mostraron que los mecanismos celulares AMP inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata. Curiosamente, AMP detenido células LNCaP en la fase S (Fig. 2B), en parte, a través de la regulación negativa de CDK2 (Fig. 3B, 3C), un esencial biomarcador para la transición G1 /S, mientras que se detuvo a las células PC-3 en S y G2 /M fases (Fig. 2E, 2F) asociados con la regulación a la baja de Cdc2 (Fig. 3E, 3F). CDC2, también conocido como CDK1 (quinasa dependiente de ciclina 1), juega un papel importante durante el progreso del ciclo celular. CDC2 suele combinar con la ciclina B y regula la S y G2 /M fase de progresión. CDC2 ha sido considerada como un objetivo molecular esencial para el diseño de fármacos terapéuticos contra el cáncer [13]. El descenso de regulación de Cdc2 puede proporcionar un mecanismo molecular importante que AMP detiene la progresión del ciclo celular de las células PC-3 en S y G2 /M fases. Análisis de muestras de tumores in vivo también confirmó que inhibe el crecimiento del tumor PC-3 AMP asocia con la inhibición de la proliferación de células tumorales (Fig. 6B).
La inducción de la apoptosis de las células del cáncer de próstata es también un mecanismo importante por el cual AMP inhibición el crecimiento del cáncer de próstata. AMP apoptosis inducida de las células de cáncer de próstata in vitro (Fig. 3A, 3D) e in vivo (Fig. 6A). Investigaciones posteriores mostraron que la inducción de la apoptosis se asoció con regulación a la baja de los niveles de proteína bcl-2 (Fig. 3C, 3F). Bcl-2 es un regulador importante de la apoptosis. La expresión de Bcl-2 es más frecuente en los tumores de alto grado y metástasis que en menor grado y-tumores no metastásicos [14], [15]. resistencia a la apoptosis está asociada con niveles más altos de bcl-2 [15], [16], y la regulación por disminución de Bcl-2 sensibiliza a las células de cáncer de próstata para someterse a apoptosis [17]. Por lo tanto, la regulación por disminución de Bcl-2 podría representar un mecanismo molecular por el cual AMP importante induce la apoptosis de cáncer de próstata.
La angiogénesis es un paso crítico en el crecimiento del tumor [18]. El crecimiento de todos los tumores sólidos depende de la angiogénesis y la supresión de los vasos sanguíneos del tumor ofrece una nueva opción para la prevención y tratamiento del cáncer [19]. Estudios anteriores demostraron que AMP tenía actividad anti-angiogénesis mediante la inhibición de la secreción de VEGF factor de pro-angiogénico y bFGF a partir de células de carcinoma hepatocelular humano in vitro [11]. En este estudio, hemos demostrado que AMP inhibió el crecimiento de PC-3 de tumor de próstata asociado con la inhibición de la angiogénesis tumoral (Fig. 6C). Aunque no se midió el VEGF y bFGF niveles in vivo, nuestros resultados proporcionan evidencia experimental sugiere para apoyar a que uno de los mecanismos por los que AMP inhibe el crecimiento del tumor es a través de la inhibición de la angiogénesis. Se necesita más investigación para determinar los mecanismos moleculares subyacentes que AMP inhibe la angiogénesis tumoral.
Estudios anteriores han demostrado que el AMP inhibió la invasión in vitro e in vivo la capacidad de metástasis del melanoma B16 [8] en. Sin embargo, no se ha estudiado si AMP tenía actividad anti-metástasis en el cáncer de próstata. Nuestros resultados demuestran que el AMP tenía actividades potentes en la inhibición de la migración y la invasión de células de cáncer de próstata in vitro y la metástasis del cáncer de próstata en el modelo animal del tumor de próstata ortotópico asociada con la regulación negativa de la expresión de CXCR4. CXCR4 está implicado en varias enfermedades tales como la angiogénesis, trastornos metabólicos y neurológicos, la artritis reumatoide y en diferentes formas de cáncer metastásico. CXCR4 es un factor crítico en la capacidad de invasión y proliferación de células de cáncer de mama [20], [21], [22] y desempeña un papel fundamental para el crecimiento de neuronal malignos y tumores gliales [23]. inhibidores de CXCR4 se sugieren para el tratamiento de diferentes formas de cáncer metastásico [24], [25], [26]. AMP se demuestra que es una pequeña molécula antagonista de CXCR4 [27], [28]. Aunque no estudiamos si CXCR4 era una diana molecular directa de AMP, nuestros estudios sugieren que uno de los mecanismos moleculares por los que AMP inhibe la metástasis del cáncer de próstata puede ser a través de la regulación negativa de la expresión y función CXCR4. La investigación adicional en la aplicación de AMP y /o sus derivados como nuevos agentes anti-metástasis para retrasar y /o prevenir la metástasis del cáncer podría tener un impacto significativo en la prevención y el tratamiento del cáncer.
En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencia experimental de importancia crítica para sugerir que AMP puede ser un nuevo agente eficaz y seguro candidato para inhibir el crecimiento y la metástasis de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
declaración Ética
todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y uso de animales institucional en el Beth Israel Deaconess Medical Center con la Guía para el Cuidado y uso de animales de laboratorio.
TFE, AMP y miricetina
se aplicó un procedimiento de extracción patentado para extraer TFE de
Ampelopsis grossedentata
con contenido de AMP en aproximadamente 80%. AMP se purificó de TFE por HPLC preparativa; y la pureza se verificó por análisis HPLC de fase inversa. La miricetina se adquirió de LKT Laboratories (St. Paul, MN). Se utilizó el análisis HPLC para verificar la calidad de los materiales. Todos los materiales se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) para estudios de cultivo de células.
Cultivo de células de cáncer de próstata, células epiteliales de próstata normales y células endoteliales
dos líneas celulares de cáncer de próstata humano, sensible a andrógenos LNCaP y independiente de andrógenos PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) fueron utilizados para los experimentos in vitro. líneas celulares de cáncer de próstata humano se mantuvieron como cultivos monocapa en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mol L-glutamina /ml, 100 U de penicilina /ml y 100 mg de estreptomicina /ml en un 95% de aire, 5% de CO
2, y la atmósfera saturada de agua. células PrEC se adquirieron de Lonza (Walkersville, MD) y se cultivaron en PrEGM más EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkersville, MD) en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2.
el crecimiento celular
el efecto de AMP, TFE y miricetina sobre la citotoxicidad de las células de cáncer de próstata o PrEC se determinó usando el Cell Titer 96 Aqueous Ensayo de proliferación celular (Promega, Madison, WI) como anteriormente hemos descrito [29] . El ensayo determina el número de células viables en proliferación, citotoxicidad y quimiosensibilidad. Todos los ensayos se repitieron tres veces independientemente por lo menos, cada una por triplicado, y los resultados se confirmaron mediante recuento directo de células utilizando un hemocitómetro.
Análisis de la progresión del ciclo celular de cáncer de próstata y la fragmentación del ADN
El efecto de tratamiento AMP sobre la distribución del ciclo celular de las líneas celulares de cáncer de próstata se determinó por citometría de flujo siguiendo los procedimientos descritos [30]. Las células tratadas con diferentes concentraciones de AMP se recogieron, se tiñeron con yoduro de propidio (a una concentración final de 50 mg /ml) y RNasa (a una concentración final de 50 mg /ml), y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las células teñidas se analizaron entonces mediante FACScan (Becton Dickinson, Immunocytometry Sistemas, Mountview, CA) para la distribución del ciclo celular y el ADN fragmentado. Los experimentos se repitieron tres veces independientemente por lo menos, cada uno por duplicado.
Anexina V y tinción PI para la detección de apoptosis
El efecto de AMP sobre la apoptosis de las células PC-3 se determinó además por Anexina V-PI kit de detección de apoptosis (Chemicon International Inc, Billerica, MA) siguiendo las instrucciones del kit. Brevemente, las células tratadas con PC-3 se resuspendieron en solución de anexina V y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min, PI se añadió entonces para otra incubación de 5 min en la oscuridad. Las células apoptóticas se analizaron por citometría de flujo (Becton Dickinson, Immunocytometry Sistemas, Mountview, CA). Los experimentos se realizaron de forma independiente al menos dos veces, cada una por duplicado.
Ensayos
migración de células del cáncer y la invasión
Una suspensión de células PC3 (6000 células para la migración y la invasión de las células 30000) en 250 l de DMEM libre de suero con AMP o el vehículo (DMSO) se cargó en un inserto recubiertos de fibronectina para el ensayo de migración o una inserción de matrigel recubierto para el ensayo de invasión (Biocoat, placa de 24 pocillos, 8 m, Becton Dickinson). Cada inserto de cultivo se estableció en un pozo que contiene 750 l de DMEM con 5% de FBS. Después de la incubación durante 16 horas a 37 ° C, las células en la parte superior de los insertos se eliminaron con cuidado usando una punta de algodón, y las células en la parte inferior de la membrana de inserción se tiñeron con soluciones de tinción Diff-Quick (Dade Behring Inc., Newark, DE) y las imágenes fueron capturadas. Las células se contaron con un microscopio. Todos los ensayos se realizaron de forma independiente al menos tres veces, cada uno por triplicado.
Para confirmar que el anti-migración y anti-invasión actividades de AMP no eran secundariamente debido a su citotoxicidad para las células PC-3, las células PC-3 fueron tratados con AMP (0, 25, y 50 mM) durante 16 h, y el número de células se midieron mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. El experimento se realizó de forma independiente al menos tres veces, cada uno por duplicado.
análisis de transferencia de Western
Para el estudio in vitro, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de AMP, se prepararon lisados de células y proteínas niveles se determinaron por análisis de transferencia de Western siguiendo los procedimientos que se describió anteriormente [31]. Los anticuerpos primarios utilizados en transferencia de Western contra antígenos humanos fueron los siguientes: la ciclina B1 (1:200), cdc2 (1:500) y bax (1:500) (Oncogene Research Products, Boston, MA), bcl-2 (1 :100), p21 (1:200) y p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Selleck químicos, Houston, TX), CXCR4 (1:200) ( R & amp; D Systems, Inc, USA), y β-actina (1:10,000) (Merck Co., Darmstadt, Alemania). Para el estudio in vivo, se recogieron muestras de tumores, tanto en el control y los grupos tratados con AMP para el análisis de transferencia Western de nivel de proteína CXCR4.
Estudio de Animales
La actividad de intervención quimiopreventivo de AMP en el el crecimiento y la metástasis de tumores de PC-3 se determinó en un modelo ortotópico de PC-3 animales tumor. ratones inmunodeficientes combinada severa masculino (6-8 semanas de edad) fueron adquiridos de Taconic (Germantown, NY), y se aloja en el animalario del Beth Israel Deaconess Medical Center en un entorno libre de patógenos equipada con campanas de flujo laminar y estándar jaulas de vinilo con filtros de aire. Después de una semana de aclimatación y adaptación a la dieta AIN-93, los ratones se asignaron al azar en uno de los siguientes tres grupos experimentales (en cada grupo, n = 8) y tratan previamente por medio de alimentación forzada al día durante 2 semanas: (i) Control: la vehículo (aceite de maíz 100 l); (Ii) AMP a 150 mg /kg de peso corporal (PC); y (iii) AMP a 300 mg /kg de peso corporal. Después, cada ratón se implantó ortotópicamente con células PC-3 (2 × 10
6 células /50 l) y continúa en los tratamientos correspondientes a lo largo del experimento. La ingesta de alimentos y el peso corporal se midieron semanalmente. Al final del experimento (8 semanas después de la PC-3 implantación de células), se sacrificaron los ratones; tumores primarios se extirparon y se pesaron. Una rebanada tumor de cada tejido del tumor primario fue cuidadosamente diseccionada y se fija en 10% de formalina buffer-neutralizado, embebido en parafina, y se seccionaron a 4 m de espesor para inmunohistoquímica. Todos los procedimientos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Beth Israel Deaconess Medical Center con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio [32]. Se repitió el estudio animal.
La detección in situ de índice apoptótico
Las células apoptóticas se determinaron por un ensayo de deoxinucleotidil transferasa terminal mediada desoxiuridina trifosfato-biotina etiquetado final nick (TUNEL) (Chemicon International Inc , Billerica, MA) siguiendo los protocolos descritos [30], [33], [34]. Se seleccionaron seis áreas representativas de cada sección sin necrosis y ambas células apoptóticas y células núcleos totales se contaron bajo un microscopio de luz a 400 × magnificación. El índice de apoptosis se expresó como el porcentaje de células tumorales apoptóticas positivas a células totales del tumor, y el efecto del tratamiento sobre la apoptosis se expresó como el porcentaje con el control.
determinación inmunohistoquímica de la proliferación de células tumorales
el índice de proliferación se evaluó mediante el cálculo de la proporción de células con Ki-67 tinción, siguiendo los procedimientos en el laboratorio [31]. Tanto las células proliferantes y células tumorales totales Ki-67-positivas fueron contados en seis áreas no necróticas de cada sección usando microscopio de luz a 400 × magnificación. El índice de proliferación se calculó como el porcentaje de células tumorales Ki-67-positivas a células totales del tumor, y el efecto del tratamiento sobre la proliferación se expresó como el porcentaje con el control.
detección inmunohistoquímica de la densidad de los microvasos (MVD )
MVD se utilizó como marcador de la angiogénesis tumoral, y se cuantifica por tinción inmunohistoquímica del Factor VIII después de nuestro método descrito previamente [30], [33], [34]. MVD se calculó contando microvasos en 200 × campos con microscopía de luz en seis sitios representativos sin necrosis de cada sección, y el efecto del tratamiento sobre la angiogénesis se expresó como el porcentaje con el control.
El análisis estadístico
Los resultados se expresaron como medias de los grupos ± SEM y se analizaron para la significación estadística mediante análisis de varianza [35] seguida de protegido diferencia menos significativa de Fisher sobre la base de las comparaciones de dos secundarios entre los grupos experimentales utilizando programa Statview 5.0 (SAS Institute, Inc. , Cary, NC). Un
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Apoyo a la Información
Figura S1.. Francia El cromatograma representativo que muestra la pureza de AMP por análisis HPLC de fase inversa. HPLC condiciones experimentales fueron: Instrumento: Waters 2695 con muestreador automático y la matriz de fotodiodos del detector (PDA); columna de HPLC: Phenomenox C-18 (5 m de diámetro interior, 10 × 250 mm); Fases móviles: A (H
2O con 0,1% de ácido acético) y B (acetonitrilo); condición de gradiente: 0-30 min, 5% de B a 35% B; 30 a 35 min, 35% B a 95% B; 35 a 40 min, 95% de B hasta 5% B; 40-45 min, 5% de B; Caudal:. 1 ml /min
doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Representante FACS histogramas que muestran el efecto dependiente del tiempo de los tratamientos de AMP (0, 20, y 50 mu M) sobre la apoptosis de las células PC-3, medido por el flujo de Anexina-PI ensayo de citometría.
doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s002 gratis (TIF)
Figura S3. Francia El efecto de AMP en PC-3 citotoxicidad de las células, tal como se mide por el ensayo de exclusión de azul de tripano. Las células fueron tratadas con AMP a diferentes concentraciones durante 16 horas, al mismo tiempo se utiliza para los ensayos de migración y la invasión. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes, cada uno por duplicado. Los valores son estadísticamente significativos entre los grupos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0038802.s003 gratis (TIF)
figura S4.