Extracto
Antecedentes
Evidencia implicado la importancia diagnóstica de microRNAs en los sedimentos enteros orina /orina en carcinoma urotelial de la vejiga (UCB). Sin embargo, las células de sangre contaminada en los pacientes con haematouria alteraron significativamente los perfiles de expresión de microARN urinaria, que influye en la exactitud de la prueba.
Métodos
perfiles de microARN de los sobrenadantes de orina de pacientes y controles sin ningún tipo de UCB malignidad y perfiles de los tejidos normales y malignos de la mucosa correspondientes de los pacientes se determinaron mediante microarrays microARN y se comparan para identificar microRNAs expresados diferencialmente. La expresión diferencial se verificó en los tejidos de un cohorte de pacientes independiente por RT-qPCR. La importancia diagnóstica de microARNs como biomarcadores seleccionados en el sobrenadante de la orina se investigó en las cohortes más amplios.
Resultados
microARN-99a y microARN-125 ter se redujeron regulado en los sobrenadantes de orina de pacientes UCB . El grado de regulación a la baja se asoció con el grado del tumor. Un modelo de diagnóstico se desarrolló utilizando un índice combinado de los niveles de microARN-99a y microARN-125 ter, en el sobrenadante de la orina con una sensibilidad del 86,7%, una especificidad del 81,1% y un valor predictivo positivo (VPP) del 91,8%. Discriminar entre alto y bajo grado de UCB, el modelo usando el nivel de microARN-125 ter solo exhibió una sensibilidad del 81,4%, una especificidad del 87,0% y un VPP del 93,4%.
Conclusiones
los resultados revelaron un patrón de expresión único microRNA en los sobrenadantes de orina de pacientes UCB para el desarrollo de pruebas de diagnóstico molecular. Un modelo basado en microARN urinaria libre de células efectiva fue desarrollado utilizando un índice combinado de los niveles de microARN-99a y microARN-125 ter para detectar UCB con una capacidad de discriminación, alta sensibilidad y alta especificidad
Visto:. Zhang DZ, Lau KM, Chan ESY, Wang G, Szeto CC, Wong K, et al. (2014)-Free Cell urinaria microARN-99a y microARN-125 ter son marcadores de diagnóstico para la detección no invasiva de cáncer de vejiga. PLoS ONE 9 (7): e100793. doi: 10.1371 /journal.pone.0100793
Editor: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Febrero, 2014; Aceptado: 29-may de 2014; Publicado: 11 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la subvención directa para la Investigación (2009.1.096), la Universidad china de Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma urotelial de vejiga (UCB) es la segunda neoplasia maligna más común en el sistema urinario [1]. Debido a su alta incidencia y recurrencia frecuente, instrumentos eficaces de evaluación de diagnóstico y la enfermedad son esenciales para el manejo clínico de los pacientes. La cistoscopia es actualmente la prueba clínica estándar para el diagnóstico y la vigilancia del cáncer. Sin embargo, el procedimiento es invasivo y desagradable, y tiene varias limitaciones prácticas. Por ejemplo, puede que no sea capaz de detectar tumores pequeños y /o planas, como el carcinoma
In situ
. Por lo tanto, se requiere un enfoque no invasivo alternativa que presenta una alta especificidad y sensibilidad. Aunque muchos biomarcadores de sangre y de orina se han identificado y evaluado en la literatura, ninguno ha sido ideal y lo suficientemente potente como para sustituir la cistoscopia [2].
Los microARN, que son pequeños ARN no codificantes, tienen poco valor diagnóstico y pronóstico significativo demostrado en varios tipos de cáncer [3] - [5]. MicroARNs exhiben alta estabilidad y fácil detectabilidad incluso a bajos niveles en varios tipos de muestras clínicas [6] - [8]. Se considera un excelente biomarcador de la enfermedad para la detección y seguimiento. Un estudio demostró que una serie de microRNAs se expresaron de forma aberrante en los tejidos tumorales de UCB y que estas aberraciones podrían estar involucrados en el diagnóstico y la estadificación de biopsias de cáncer de vejiga [9]. Además, la evaluación de los niveles de estos microRNAs expresadas aberrantemente que muestran firmas únicas en orina total o células de orina exfoliada es aún más prometedor para el diagnóstico y vigilancia de las enfermedades de UCB [10] - [11]. Sin embargo, los resultados son a veces poco fiable en el estudio de pacientes con hematuria, en los que las células de sangre contaminada alteran significativamente los perfiles de microARN urinario y así enmascarar las firmas. De hecho, el 85% de los pacientes exhiben diversos grados de hematuria [12] - [13]. Como resultado, se requiere un enfoque alternativo para microRNAs de medición. La evidencia ha sugerido que los ácidos nucleicos libres, tales como biomarcadores de ADN en los sobrenadantes de orina, proporcionan un índice de detección más alto y una mayor sensibilidad que las de los sedimentos para UCB diagnóstico [14] - [16]. Por lo tanto, la evaluación de los niveles de microARN en sobrenadante de la orina podría mejorar el uso de los microARNs como biomarcadores de diagnóstico para la detección de UCB, especialmente en pacientes con hematuria. En este estudio, se desarrolló la viabilidad del uso de microARN urinarios libres de células para el diagnóstico se determinó UCB y modelos para el diagnóstico de UCB y grados tumorales exigentes.
Métodos
Pacientes y muestras
Una visión general de este estudio se muestra en la figura S1. Con el consentimiento por escrito de los donantes y la aprobación de la Universidad Conjunta China de Hong Kong - Nueva Cluster territorios del este Clínica Comité de Ética de la Investigación, se recogieron muestras de tejido y de orina en el Servicio de Urología, Departamento de Cirugía, Hospital Príncipe de Gales, Hong Kong . la orina a mitad de camino se recogió de los pacientes con cáncer de vejiga antes de la cirugía. Tanto el tejido tumoral y normal mucosa de la vejiga situado & gt; 3 cm de distancia desde el borde del tumor se obtuvieron por cistoscopia. El diagnóstico de la OMS 1973 y el sistema de clasificación para el cáncer de vejiga [17] fue utilizado para el diagnóstico. Para los controles normales, las muestras de orina se recogieron de pacientes que tuvieron resultados normales, cistoscópicas ausencia de tumores malignos con a & gt; 6 meses de seguimiento y hematuria. Todas las muestras de orina se centrifugaron a 2500 r.c.f. durante 20 minutos y los sobrenadantes de orina se recogieron.
Micro RNA microarrays
El ARN total de los sobrenadantes de orina y tejido congelado se extrajo utilizando el Kit MirVanaPARIS (Ambion) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante . El Agilent humano miRNA Microarray Chip (Release 13.0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), que abarca 866 microRNAs humanos y 89 microRNAs virales, se utilizó para el perfil de la expresión de estos microRNAs en los sobrenadantes de orina y tejidos de cáncer y de control. El conjunto de datos se depositó a ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) y el número de acceso es E-MTAB-2573. La intensidad de señal de cada punto era mediana normalizada y más normalizada por regresión lineal.
inversa-reacción en cadena de la polimerasa de transcripción-cuantitativo (RT-qPCR)
primera cadena de ADNc se sintetizó a partir del ARN total de los sobrenadantes de orina y muestras de tejidos utilizando un kit de síntesis de ADNc universales (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca), de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El ADNc resultante se sometió a reacción de la polimerasa cuantitativa en cadena (qPCR) con SYBR Green maestro de la mezcla y el cebador microRNA LNA PCR (Exiqon) que reconoce específicamente a la microRNA objetivo en un rápido máquina RT-qPCR ABI 7900HT (Applied Biosystem /Life Technologies, Grand Island , Nueva York, EE.UU.). RNU6B se utilizó como control de referencia. Todas las muestras se ensayaron por duplicado. El nivel relativo de micro ARN se determinó utilizando el ΔΔC
método q.
Métodos estadísticos
Se analizaron los datos de microarrays de genes utilizando el software Primavera 11.0 (Agilent) para normalizar e identificar la forma diferencial microRNAs expresadas. software ABI SDS 2,3 (ABI /Life Technologies) se utilizó para analizar los datos de RT-qPCR. Los datos cuantitativos fueron sometidos a una prueba de Mann-Whitney y la prueba de Wilcoxon de rangos con signo usando el software SPSS 16.0 (IBM Co, Armonk, Nueva York, EE.UU.). En el análisis post-hoc posterior, se realizó un análisis de regresión logística bivariada para determinar el Índice Combinado (IC) para la combinación de dos niveles de expresión de microRNAs. Una característica de funcionamiento del receptor (ROC) análisis de la curva se realizó utilizando el software SPSS 16.0. La sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivos y negativos, y los cocientes de probabilidad positivos y negativos se calcularon.
Resultados
Identificación de microRNAs expresados diferencialmente entre los sobrenadantes de orina de pacientes y controles y UCB entre el cáncer y tejidos normales por microRNA microarray
sobrenadantes de orina de seis pacientes de UCB y tres controles normales junto con cuatro pares de tejidos UCB y sus correspondientes tejidos de la mucosa de la vejiga normal, se sometieron a análisis de microarrays de microARN. Las características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. Para determinar la presencia y ausencia de microARN en las muestras, una señal de umbral se define como la media de fondo más tres desviaciones estándar. Las señales por encima de este umbral se consideraron una "presencia" y señales por debajo del umbral se consideraron una "ausencia". Después de la normalización mundial, 117 ± 63,8 cabo de 866 microARN humanos se detectaron en los sobrenadantes de orina y se detectaron 314 ± 83,4 microRNAs en la vejiga tejidos. No hubo diferencia significativa en el número total de microRNAs detectadas entre los sobrenadantes de orina de pacientes con cáncer y controles y entre los tejidos de cáncer y de control. La comparación de los perfiles en los sobrenadantes de orina de los pacientes de UCB con las de los controles normales, 39 microRNAs mostraron expresión diferencial (prueba de Mann-Whitney, p & lt; 0,05; diferencias & gt veces; 1,60). Había 78 microRNAs expresados diferencialmente entre el cáncer y tejidos normales (emparejado prueba de Mann-Whitney, P & lt; 0,05; 2,0; & gt diferencias veces). Diez microRNAs se dysregulated comúnmente tanto en los sobrenadantes de orina y muestras de tejidos (Figura 1 y la Figura S1). De éstos, los niveles de microARN-1, microARN-99a, microARN-125 ter, microARN-133a, 133b-microARN, microARN-143 y microARN-1207-5p disminuyeron significativamente y los de microARN-16, microRNA-96 y microRNA- 183 aumentó en las muestras de UCB (Figura 1).
(a) mapa de calor de los niveles de 10 microRNAs seleccionados en muestras de sobrenadante de nueve de orina y cuatro pares de muestras de tejido. El ARN total se extrajo y se sometió a análisis de microarrays microARN utilizando un microARN microarrays de Chip Agilent Humanos. La intensidad de señal de cada punto era mediana normalizado y normalizado aún más por regresión lineal. Se presentan las intensidades de las señales normalizadas para cada uno de microARN en el sobrenadante de la orina y muestras de tejidos de pacientes y controles UCB. parcelas (B) de la dispersión de las sensibilidades de señales normalizadas de los 10 microRNAs seleccionados. Se realizó una prueba de Mann-Whitney para comparar los niveles de microARN en el sobrenadante de la orina de los pacientes UCB (TU) (n = 6) y controles (NU) (n = 3), y se realizó una prueba de Mann-Whitney U emparejado comparar los tumores (TT) (n = 4) y sus tejidos normales correspondientes mucosa (NT) (n = 4) en los pacientes UCB. Un nivel de significación de 0,01 se usó para todas las comparaciones. Los asteriscos (*) indican una diferencia estadísticamente significativa (p & lt; 0,01).
Validación de los 10 microRNAs seleccionados en cohortes independientes de muestras de tejido y de sobrenadante de la orina
Para validar los resultados de los microarrays, los niveles de los 10 microRNAs seleccionados se cuantificaron por RT-qPCR en otros 18 pares de cáncer de vejiga y tejidos mucosa normal correspondientes (Tabla 1). De éstos, la expresión diferencial de seis microRNAs entre el cáncer y tejidos normales fue validado (signos de Wilcoxon de dos muestras relacionadas prueba, p & lt; 0,05) (Figura 2). El microARN-1 se redujo reguladas en los 18 pares de tejidos de cáncer (p & lt; 0,01) y 17 de los 18 pares mostró baja regulación (p & lt; 0,01) en los cinco microRNAs restantes (microARN-99a, microARN-125b, microRNA- 133a, 133b y microARN-microARN-143). El microARN-1, microARN-99a, microARN-125 ter, microARN-133a, microARN-133b y microARN-143 se redujeron regulado 266,87 ± 2,06, 130,69 ± 2,30, 49,52 ± 3,39, 263.20 ± 1.99, 261.38 ± 2.11 y 67.18 ± 1.83 veces en los tejidos de cáncer, respectivamente.
El ARN total fue extraído a partir de 18 pares de tejidos de cáncer de vejiga y sus correspondientes tejidos normales adyacentes de la mucosa. Los niveles de estos microRNAs se cuantificaron por RT-qPCR por duplicado. Se presentan los niveles de expresión relativos (2-ΔCq). Se realizó una prueba de Mann-Whitney para comparar pares de los tumores y sus correspondientes tejidos normales de la mucosa en pacientes UCB. Columnas, medios; Bares, S.D. .; n = 18. ** indica p & lt;. 0.001
El poder de discriminación de los microARN seis validados en los sobrenadantes de orina y luego se evaluó utilizando 71 muestras de sobrenadante de la orina, incluyendo 50 muestras de pacientes con cáncer de vejiga (15 los casos de cáncer de bajo grado y 35 casos de cáncer de alto grado) y 21 muestras del grupo control (Tabla 1). En este conjunto ampliado de muestras, los sobrenadantes de orina de los pacientes UCB poseían niveles más bajos de microRNA-99a (p & lt; 0,01), microRNA-125 ter (p & lt; 0,01), microRNA-133b (p & lt; 0,05) y microRNA-143 (p & lt ;. 0,01) que la de los controles (Figura 3A), pero no de microARN-133a y microARN-1 |
Desarrollo de modelos de microARN urinarios libres de células para la detección de UCB y la discriminación de los grados tumorales
la curva ROC se determinó para evaluar la fuerza de diagnóstico de estos microRNAs en la detección de UCB. Alta área bajo la curva (AUC) los valores se encontraron resultados para microRNA-99a (0.800, que van desde 0,715 hasta 0,886) y microRNA-125 ter (0,813, que van desde 0,729 hasta 0,897) (Figura 3B), mientras que el microARN-133b y microARN-143 la fuerza de diagnóstico baja expuso con valores de AUC alrededor de 0,6. A fin de determinar la importancia diagnóstica de microARN-99a y microARN-125 ter, puntos de corte relacionados se determinaron a partir de las curvas ROC basado en la regla Índice de Youden. Los puntos de corte para los niveles de expresión normalizados de microARN-99a y microARN-125 ter eran 2
2,18 y 2
4,1, respectivamente. Un paciente con un sobrenadante de la orina cuyo nivel micro ARN fue menor o igual que el punto de corte fue considerado un caso de cáncer, y que se considera normal si el nivel era más alto que el punto de corte. De acuerdo con este sistema, la sensibilidad, especificidad, valor de predicción positivo (VPP), valor de predicción negativo (VPN), de probabilidad positivo (LR +) y negativa de probabilidad (LR) de microARN-99A fueron 78,0%, 85,7%, 92,7%, 61,0%, 5,46 y 0,26, respectivamente, y para microARN-125 ter fueron 84,8%, 76,2%, 89,3%, 68,1%, 3,57 y 0,20, respectivamente (Tabla 2). Para lograr un mejor rendimiento diagnóstico, una combinación de las expresiones de microARN-99a y microARN-125 ter, se sometió a una regresión logística bivariada. El CI obtenido mejores resultados que el uso de cada uno de microARN solos. El valor AUC aumentó a 0.876. La fórmula IC fue IC = 1 /{1 + exp [- (2.332 + 0.425 xΔCq
microARN-125 ter + 0,069 xΔCq
microARN-99a)]}. Cuando el punto de corte se fijó en 0,6244 basado en la regla Índice de Youden, el sistema de predicción mejorado con una mayor sensibilidad (86,7%) y VPN (71,4%) y un LR- disminuido (0,16), con valores comparables para la especificidad,
también se evaluó PPV y LR + (Tabla 2). La relevancia clínica de los cuatro microARN seleccionados para discriminar bajo grado de cánceres de alto grado. Los niveles de orina microARN-99a y microARN-125 ter eran significativamente menor en los pacientes con cánceres de alto grado (G2 y G3) que en aquellos con cáncer de bajo grado (G1) (prueba de Mann-Whitney, p & lt; 0,01). Los niveles de microARN-133b y microARN-143 mostraron ningún valor discriminación grado del tumor (Figura 3A). Los valores de AUC diferenciadores entre los cánceres de alto y bajo grado de microARN-99a y microARN-125 ter fueron 0,819 y 0,791, respectivamente (Figura 3B). Los puntos de corte de los niveles normalizados de microARN-99a y microARN-125 ter de la clasificación del tumor eran 2
1,71 y 2
0,91, respectivamente. Sobre la base de estos puntos de corte, el sistema con el nivel de microARN-99a exhibió una sensibilidad del 74,2%, una especificidad del 83,3%, un VPP del 91,5%, un valor presente neto de 58,1%, LR + 4,46 y un LR- de 0,31. En el caso de microARN-125 ter, estos valores fueron 81,4%, 87,0%, 93,4%, 67,0%, 6,11 y 0,21, respectivamente, para discriminar los grados tumorales (Tabla 2). Cuando se combinan los niveles de microARN-99a y microARN-125 ter, en el sistema, se convirtió en la fórmula IC IC = 1 /{1 + exp [- (1.742 + 0.0295xΔCq
microARN-125 ter + 0.496xΔCq
microARN-99a )]}, con 0.7398 como el punto de corte. La sensibilidad, especificidad, VPP, VPN, LR + y LR- fueron 79,4%, 88,0%, 94,7%, 61,1%, 6,61 y 0,23, respectivamente (Tabla 2). Todos estos valores eran o comparables con o inferiores a las de los sistemas que utilizan ya sea microARN-99a o microARN-125 ter solo. Tomadas en su conjunto, el sistema utilizando microARN-125 ter solo realiza mejor en la diferenciación entre alto y bajo grado de UCB.
Correlación entre la expresión de microARN-99a y microARN-125 ter en sobrenadantes de orina y cáncer de vejiga y tejidos de control
a través de un análisis de correlación de Pearson, los niveles de microARN-99a y microRNA-125 ter, tanto en los tejidos y sobrenadantes de orina de los pacientes y los controles fueron altamente correlacionados (R = 0,896, p & lt; 0,001 para las muestras de tejido; R = 0,982, p & lt; 0,001 para las muestras de sobrenadante de la orina) (Figura 3C), lo que sugiere que su expresión puede haber sido co-regulados. De hecho, estos genes se agruparon en la región q21.1 del cromosoma 21 (Figura 3D).
Restauración de microARN-99a y microRNA-125 ter expresiones en pacientes postoperatorios
Para demostrar el vínculo crucial entre el estado de cáncer de vejiga y la disminución de microARN-99a y los niveles de microARN-125 ter en los sobrenadantes de orina, estos dos microARN fueron cuantificados en los sobrenadantes de orina de pacientes preoperatorios y postoperatorios. Veinte pacientes fueron reclutados (Tabla 1). orina post-operatorio se recogió 4 semanas después de la resección transuretral. Después de la resección, los pacientes fueron capaces de restaurar los niveles de microARN-99a y microARN-125b en el sobrenadante de la orina (signos de Wilcoxon de dos muestras relacionadas prueba, p & lt; 0,01) (Figura 4) a niveles comparables con los de la muestras de control normal (figura S2).
El ARN total fue extraído a partir de los sobrenadantes de orina de pacientes con UCB bajo grado (n = 15) (barra sombreada) o cánceres de alto grado (n = 35) ( barra de color negro) y los controles normales (n = 21) (barra blanca). Los niveles de seis microRNAs en las muestras se cuantificaron por RT-qPCR por duplicado. (A) Los niveles relativos (2-ΔCq) de microARN-133a, microRNA99a, microRNA-1, microARN-143, se presentan microARN-133b y microARN-125 ter, en las muestras de sobrenadante de la orina. Se realizó una prueba de Mann-Whitney para comparar los pacientes y los controles normales de UCB. Columnas, medios; Bares, S.D. .; ** Indica p & lt; 0,01; * Indica p & lt; 0,05. (B) Curvas ROC de microARN-99a solos (línea azul), microARN-125 ter solo (línea roja) y microRNA-99a y microARN-125 ter, en combinación (línea de color negro) para el diagnóstico de UCB (izquierda) y la discriminación entre los bajos y tumores de alto grado (derecha). Los puntos de corte se establecieron los valores AUC determinan con base en el Índice de Youden. (C) Los resultados de un análisis de correlación de Pearson de los niveles de microARN-99a y microARN-125 ter en los tejidos y muestras de sobrenadante de la orina. se presentan gráficos de dispersión de los niveles relativos de estas dos microRNAs en las muestras. El coeficiente de correlación de Pearson R se calculó mediante un análisis de correlación de Pearson y se determinó el valor de p. (D) las regiones cromosómicas de los genes (
hsa-miR-99a
y
hsa-miR-125 ter-2
). Se utilizó Consorcio del Genoma Humano de Referencia GRCh37 Patch versión 12 de montaje.
HSA-mir-99a
está localizado en el cromosoma 21: 17,909,409-17,913,489, y
hsa-miR-125 ter-2
está localizado en el cromosoma 21:. 17,960,557-17,964,645
Las muestras de orina se recogieron de 20 pacientes antes de UCB (preoperatorio) y después (post-operatorio) resección transurethial. El ARN total fue extraído a partir de los sobrenadantes de orina y sometido a RT-qPCR para cuantificar los niveles de microARN-99a (izquierda) y microRNA-125 ter (derecha). Se realizó una prueba de Wilcoxon para muestras relacionadas de dos firmado-rank para comparar los niveles de microARN-99a y microARN-125 ter entre las muestras pre y post-operatorio. * Indica p & lt;. 0,01
Discusión
En este estudio se desarrolló un modelo basado en microARN urinaria libre de células eficaz para detectar la UCB con una capacidad de discriminación (AUC = 0,876) y alta sensibilidad (86,7%) y especificidad (81,1%). La viabilidad del uso de microARN urinarios como el cáncer de vejiga biomarcadores de diagnóstico fue investigado previamente. La relación de microRNA-126 a microRNA-152 en la orina se estudió para detectar UCB a una sensibilidad de 82% y una especificidad del 72%, con un valor de AUC de 0,768 [7]. Mediante el estudio de los niveles de expresión de microARN-96 y microARN-183 en el sedimento de orina, pruebas utilizando estos dos biomarcadores de microARN independientemente mostraron sensibilidad de 71% y 74%, especificidad de 89% y 77% y los valores de AUC de 0.8331 y 0.817, respectivamente [ ,,,0],18]. Usando el CI del microARN-99a y los niveles de microARN-125 ter, en el sobrenadante de la orina aquí mejorado significativamente la eficacia de la prueba de diagnóstico para la detección de UCB. Por otra parte, el rendimiento diagnóstico era mejor que la de biomarcadores a base de orina disponibles en el mercado (Tabla S1).
A diferencia de ARNm, que es vulnerable a la RNasa ambiental, microRNAs son relativamente estables en muestras clínicas. Los microARN permanecen intactos incluso en condiciones desfavorables, tales como altas temperaturas o niveles de pH extremos y 10 ciclos de congelación-descongelación [6]. Por otra parte, se detectan fácilmente en plasma o suero humano por RT-qPCR, incluso a niveles muy bajos [7] - [8]. cambios asociados a tumores a los perfiles de expresión de microARN en el sistema de circulación han proporcionado un nuevo enfoque para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. En 2008, Lawrie et al. [19] informó de que un nivel sérico elevado de microARN-21 se asoció con la supervivencia libre de recaída de los pacientes con linfoma de células B grandes difuso. Ng et al. [20] demostraron la importancia diagnóstica de microRNAs de plasma en la detección del cáncer colorrectal. Estos estudios indicaron el potencial de circulación microRNAs en el suero /plasma como biomarcadores para la detección del cáncer. Además de suero /plasma, microRNAs son muy estables en la orina [17] - [18] y por lo tanto la detección de microRNAs intacta en la orina es prometedor. Wang et al. [21] identificado libre de células urinaria microARN-146a y microARN-155 biomarcadores de diagnóstico como eficaces para el lupus eritematoso sistémico, que implican a la significación clínica de los microARN urinarios libres de células en el diagnóstico de enfermedades y, posiblemente, el pronóstico. Aunque el rendimiento de microRNAs de sobrenadante de la orina es relativamente bajo en comparación con los de orina total o sedimento de orina, orina sobrenadante se considera la mejor opción como un biomarcador para el diagnóstico y el pronóstico [21] enfermedad. La comparación de la utilidad de ADN urinaria en sobrenadante y sedimento para la detección de UCB, Szarvas et al. [11] analizaron el ADN de forma simultánea urinaria en sobrenadantes y sedimentos en los pacientes y los comparó con los controles. Sus resultados indicaron que los sobrenadantes de orina produjeron mayor sensibilidad que el sedimento [11]. Probablemente esto se relaciona con la contaminación de células de la sangre en las muestras de orina de pacientes hematuria. Las células de sangre contaminada puede haber alterado los perfiles de microARN /ADN en las muestras de orina y por lo tanto interferido con la clasificación de la detección del cáncer. Por el contrario, incluso los sobrenadantes de orina de pacientes con hematuria macroscópica fueron relativamente más homogénea y sin interferencias debidas a las células de sangre contaminada en los perfiles de microARN. Por lo tanto, los sobrenadantes de orina, pueden proporcionar especímenes más convenientes y fiables para el diagnóstico del cáncer y el seguimiento de la enfermedad.
perfiles de microARN urinarios son sometidos a diversas modificaciones como la liberación directa de microRNAs de tejidos de cáncer, la respuesta inmune al cáncer y las células sanguíneas de pacientes hematuria. Un estudio de viabilidad que implica un candidato enfoque microRNA por qPCR se realizó para examinar un pequeño panel de microRNAs en los sobrenadantes de orina de pacientes con cáncer de vejiga [22]. Aquí, los perfiles completos de microARN se obtuvieron con microarrays de microARN de sobrenadantes libres de células de orina de pacientes y controles UCB que fueron confirmados tener ninguna anormalidad cystological u otras neoplasias concurrentes, y se compararon para identificar microRNAs urinarios libres de células expresados diferencialmente para UCB. Los microRNAs se hicieron un foco debido a su liberación directa a partir de tejido de cáncer y los niveles de estos candidatos en los tejidos de cáncer y sus homólogos normales se compararon para validar los tejidos. Los microRNAs identificados son probablemente funcionalmente implicado en el desarrollo de UCB y /o progresión de la enfermedad. Se pueden utilizar como biomarcadores para la detección y seguimiento de la enfermedad. Los resultados del análisis de microarrays microRNA indicaron la presencia de más de 100 microRNAs en los sobrenadantes de orina. Entre ellos, había más microARN-regulado por los microARN que hasta reguladas en sobrenadantes de orina de los pacientes con cáncer. Este hallazgo fue similar a una anterior conclusión de que la mayoría de los microRNAs expresadas diferencialmente en los tejidos de cáncer de vejiga se redujeron regulado [23]. Estas microARN-regulado pueden desempeñar funciones supresoras tumorales en la carcinogénesis [24]. La expresión alterada de seis candidatos microRNA identificado por comparación de los perfiles de microARN libres de células urinarios de pacientes y controles UCB, también se observaron en el tejido del tumor de vejiga en. El uso de un conjunto independiente de las muestras de orina, se confirmaron las expresiones reguladas por los de cuatro microARN . Como el tejido tumoral puede secretar directamente microRNAs en plasma de un paciente [25], es probable que microRNAs urinarios son secretadas originalmente por tejidos de cáncer de vejiga y /o liberados de las células epiteliales malignas e incluso no malignas /apoptóticas necróticas, el moldeo de los perfiles de microARN de los sobrenadantes de orina. Por lo tanto, los patrones de expresión de diversas microRNAs en células de cáncer de vejiga podrían ser reflejadas por sus perfiles de sobrenadante de la orina. Sin embargo, no todos los microRNAs expresados diferencialmente en los tejidos de cáncer se pueden utilizar como biomarcadores de diagnóstico urinario para UCB. se había informado anteriormente las expresiones de microARN-1 y microARN-133a a ser baja regulado en tejidos de cáncer de vejiga y mostró significación funcional en la carcinogénesis a través de la orientación TAGLN2 en las células del cáncer [26]. En el presente estudio, se examinaron sus niveles en el sobrenadante de la orina, pero no se mostró ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes con cáncer y controles. Esto puede implicar otros factores de confusión tales como la liberación de microARN de las células epiteliales urinarias normales y las células inmunes que moldean el perfil de microARN en los sobrenadantes de orina para enmascarar la expresión diferencial de algunos microRNAs relacionados con el cáncer
.
De los cuatro microARN , microARN-99a y microARN-125 ter tuvieron los mayores valores de AUC en las curvas ROC para la detección y podrían funcionar como biomarcadores de diagnóstico para el cáncer de vejiga. También se encontró que eran más significativamente las reguladas en alto grado que en UCB bajo grado UCB. Después de una resección transuretral completa de los tumores, los niveles de las reguladas anteriormente microARN-99a y microARN-125 ter en los sobrenadantes de orina aumentó, lo que implica una fuerte asociación entre los niveles y estados tumorales de los pacientes. Esto apoya aún más sus posibles funciones como biomarcadores de diagnóstico para la UCB y biomarcadores de vigilancia de la recurrencia de monitorización de tumores. Sobre la base de estos modelos, cuando un paciente tiene un resultado de la prueba de orina positiva sobrenadante con un CI mayor que el punto de corte (0,6244), él o ella probablemente tiene cáncer de vejiga, con una precisión del 91,8%. Si el nivel de expresión normalizada de microARN-125 ter es inferior a 2
1,71, existe la posibilidad de 93,4% que el paciente tiene cáncer de alto grado. Sin embargo, debido a que el valor predictivo negativo fue del 71,4% en este estudio, los resultados negativos no se pueden utilizar para descartar la posibilidad de cáncer de vejiga en los pacientes.
El presente estudio demostró que los niveles de microARN-99a y microRNA- 125 ter en el sobrenadante de la orina de los pacientes y los controles de UCB fueron altamente correlacionado con los que están en los tejidos. De hecho, los dos genes (
hsa-miR-99a
y
hsa-miR-125 ter-2
) están situados en el intrón 6 de la larga intergénicas no codificantes de proteínas ARN 478 (
LINC00478
) en el cromosoma 21. Sus expresiones son probablemente co-regulados por el promotor que controla la transcripción de la
LINC00478
gen. El mecanismo subyacente a la baja regulación de estos dos microARN en UCB puede estar relacionado con el observado con frecuencia la pérdida de 21q genómico en UCB. Tzai et al. [27] informó de una pérdida alélica frecuente de 36,6% en el brazo largo del cromosoma 21, donde se encuentran los dos genes, en la UCB. Además, los pacientes con síndrome de Down mostraron una disminución en el riesgo de muerte por neoplasias urológicas, lo que sugiere la presencia de los genes en el cromosoma 21, la supresión de los tumores de cáncer urológico [28].
microARN-99a y microARN-125 ter, se ha demostrado que tener funciones de tumor supresor en diversos cánceres humanos [29] - [34]. En el cáncer de próstata, microRNA-99a suprime la expresión de antígenos específicos de la próstata y la proliferación de células de cáncer de próstata al interferir con la expresión de dos factores de remodelación de la cromatina, relacionado SNF-smarca5 (SWI /regulador dependiente de actina asociados a matriz de la subfamilia de la cromatina Un miembro 5) y relacionados SNF-SMARCD1 (SWI /regulador dependiente de actina asociado a matriz de la subfamilia de la cromatina miembro de D 1), y el crecimiento quinasa reguladora del mTOR (objetivo mamífero de la rapamicina) [29]. De hecho, una alta expresión de mTOR fosforilada se encontró en 74% de los carcinomas urothelical musculares invasiva, en asociación con el aumento de etapas patológicas y disminución de la supervivencia relacionada con la enfermedad [30]. Se encontró que la inhibición de mTOR para disminuir
in vitro
y
vivo
vejiga crecimiento de células de cáncer [30]. Como microARN-99a se dirige a mTOR en las células de cáncer de próstata [29], la baja regulación de este microARN en UCB ha demostrado en el presente estudio puede suprimir los efectos promotores de tumores de mTOR en las células, lo que resulta en el desarrollo del cáncer. Sin embargo, se requiere una demostración más de la regulación de mTOR por microRNA-99a en células de cáncer de vejiga.