Extracto
Un gran desafío para los oncólogos y los farmacólogos es desarrollar fármacos menos tóxicos que mejoren la supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón. Frondoside A es un glucósido triterpenoides aislado del pepino de mar,
Cucumaria frondosa
y ha demostrado ser un compuesto altamente seguro. Se investigó el impacto de Frondoside A sobre la supervivencia, la migración y la invasión
in vitro
, y sobre el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis
in vivo
solo y en combinación con cisplatino. Frondoside A causó reducción dependiente de la concentración en la viabilidad de LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, y HepG2 más de 24 horas a través de una caspasa vía de la muerte celular 3/7-dependiente. Las concentraciones de IC50 (que produce una inhibición mitad de la máxima) a las 24 h fueron entre 1,7 y 2,5 M de Frondoside A. Además, Frondoside A indujo una inhibición de tiempo y dependiente de la concentración de la migración celular, la invasión y la angiogénesis
in vitro
. Frondoside A (0,01 y 1 mg /kg /día por vía intraperitoneal durante 25 días) redujo significativamente el crecimiento, la angiogénesis y la metástasis de los ganglios linfáticos de xenoinjertos de tumores en ratones atímicos LNM35, sin evidentes efectos secundarios tóxicos. Frondoside A (0,1-0,5 M) también previno significativamente basal y bFGF indujo la angiogénesis en el ensayo CAM angiogénesis. Por otra parte, Frondoside A aumentó la inhibición del crecimiento del tumor pulmonar inducida por el cisplatino como agente quimioterapéutico. Estos hallazgos identifican Frondoside A como un nuevo agente terapéutico prometedor para el cáncer de pulmón
Visto:. Attoub S, K Arafat, Gélaude A, MA Al Sultan, Bracke M, Collin P, et al. (2013) Frondoside A efectos supresores sobre el cáncer de pulmón de la supervivencia, el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la invasión y la metástasis. PLoS ONE 8 (1): e53087. doi: 10.1371 /journal.pone.0053087
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2012; Aceptado: 27 Noviembre 2012; Publicado: 8 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Attoub et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo contó con el apoyo financiero de la subvención número FMHS NP /08/27 (SA), la concesión Universidad EAU en virtud de un contrato no. 01-04-8-11 /09 (SA), el Fondo de Terry Fox para la Investigación del Cáncer (SA y TA), la NRF-UAEU 09/10 número de concesión 21MO72 (SA), y el Instituto de Tecnología de Maine, Gardiner, Maine, EE.UU., y el Instituto Nacional del cáncer, programa rápido (PC). Los organismos de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Peter Collin es director, jefe de laboratorio, los empleados y la población-titular de Coastside Bio recursos, un Maine, EE.UU. Corporation. Thomas Adrian y Peter Collin son co-inventores de la patente de Estados Unidos que describe Frondoside A y otros glicósidos de pepino de mar como agentes anti-cáncer putativo, y pueden beneficiarse económicamente si Frondoside A se convierte en un fármaco para cánceres humanos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer
pulmón es la forma más común de cáncer con una de las tasas más altas de mortalidad en el mundo. Las terapias dirigidas para los subgrupos de pacientes seleccionados constituyen un progreso notable en el tratamiento del cáncer de pulmón. Sin embargo, a pesar de estos avances, siguen siendo polémicas, los pacientes mueren, y una cura sigue siendo difícil de alcanzar [1]. Los compuestos naturales están surgiendo como una nueva generación de agentes contra el cáncer con una toxicidad limitada en pacientes con cáncer [2], [3]. Ellos pueden tener un alto valor en los tumores resistentes a la quimioterapia clásica o resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa tales como gefitinib
Los pepinos de mar se han valorado desde hace cientos de años en la dieta china como un manjar de alimentos, así como una medicina para una amplia variedad de enfermedades. En los Estados Unidos y Canadá, los tejidos de pepino de mar se secan, se pulverizan y se encapsulan como nutracéuticos para los suplementos dietéticos de salud over-the-counter, dirigidas principalmente a las enfermedades inflamatorias en seres humanos y animales de compañía [4]. Frondoside A es un glucósido triterpenoides aislada del pepino Atlántico,
Cucumaria frondosa
. (Véase [5] para la estructura química). Estudios recientes demuestran que las concentraciones bajas de Frondoside A inhiben el crecimiento y la apoptosis inducida de las células pancreáticas, leucemia y cáncer de mama humano a través de la activación de caspasa [6] - [8]
Los agentes quimioterapéuticos actualmente en uso para el cáncer de pulmón. aún no son satisfactorios debido a la co-lateral toxicidad y las drogas inducida por la resistencia asociada [9] - [11], que motiva nuestra investigación sobre el impacto de Frondoside a en la supervivencia del cáncer de pulmón de células no pequeñas, la migración humana y la invasión
in vitro
, y sobre el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis
in vivo
solo y en combinación con cisplatino.
Materiales y Métodos
cultivo de células y reactivos
pulmón humano las células cancerosas LNM35 (NSCLC) [12], A549 y NCI-H460-Luc2 (Caliper Life Sciences, EE.UU.) se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), el melanoma humano MDA-MB-435, mamario humano células de adenocarcinoma de células de hepatoma humano MCF-7, y HepG2 se mantuvieron en DMEM (Invitrogen, Paisley, UK). Todos los medios se suplementaron con antibióticos (penicilina 50 U /ml; estreptomicina 50 mg /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) y con suero bovino fetal al 10% (FBS, BioWest, Nouaille, Francia). Las células EndoGRO ™ de vena umbilical humana (HUVEC endoteliales) (Millipore, Temecula, CA) se mantuvieron en EndoGRO ™
-MV-VEGF completa Media Kit (Millipore, Temecula, CA). El cisplatino se adquirió de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia). Frondoside A se purificó a partir de
Cucumaria frondosa
, se recogieron cerca de Stonington, Maine y la pureza (99,9%) confirmó mediante RMN como se describe anteriormente [13], [14].
La viabilidad celular
Las células se sembraron a una densidad de 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Después de 24 h, las células se trataron durante otras 24 h con diferentes concentraciones de Frondoside A (0,01 a 5 M), en triplicado. Los cultivos de control se trataron con 0,1% de DMSO. El efecto de Frondoside A sobre la viabilidad celular se determinó usando un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo Luminescent (Promega Corporation, Madison, EE.UU.), basado en la cuantificación de ATP, lo que indica la presencia de células metabólicamente activas. La señal luminiscente se midió usando el sistema de GLOMAX luminómetro. Los datos se presentan como la viabilidad proporcional (%) comparando el grupo tratado con las células no tratadas, la viabilidad de los cuales se supone que es 100%.
Caspasa 3/7 de actividad
Las células fueron LNM35 se sembraron a la densidad de 5.000 células /pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con Frondoside a (1-2,5 M) durante 2 h y 24, por triplicado. Actividad de la caspasa-3/7 se midió utilizando una caspasa-Glo kit 3/7 ensayo luminiscente siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega Corporation, Madison, EE.UU.). Se añadió reactivo de la caspasa y la placa se mezcló usando un agitador orbital y se incubaron durante 2,5 h a temperatura ambiente. La luminiscencia se midió usando un sistema de GLOMAX luminómetro.
herida motilidad curación de ensayo
células LNM35 se cultivaron en placas de seis pocillos de cultivo de tejidos hasta confluencia. Los cultivos se incubaron durante 10 min con tampón de Moscona. Una raspadura se hizo a través de la monocapa confluente con una punta de pipeta de plástico de 1 mm de diámetro. Posteriormente, los platos se lavaron dos veces y se incubaron a 37 ° C en RPMI fresco que contenía suero bovino fetal al 10% en presencia o ausencia de las concentraciones no tóxicas de Frondoside A (0,1-0,5 M). En el lado inferior de cada plato, dos lugares arbitrarios fueron marcados en el que se mide la anchura de la herida con un microscopio invertido (objetivo × 4) (Olympus 1X71, Japón). Motilidad se expresó como la media ± SEM de la diferencia entre las mediciones en el tiempo cero y el periodo de 6, 24 y 30 h de tiempo considerado.
Matrigel ensayo de invasión
La invasividad del cáncer de pulmón células tratadas con LNM35 Frondoside a (0,1-1 m) fue probada usando BD Matrigel Cámara Invasion (8-micras de tamaño de poro; BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) según el protocolo del fabricante. El inhibidor de PI3 quinasa LY294002 (20 mM) se utilizó como un inhibidor positivo de la invasión celular. Brevemente, las células (1 × 10
5 células en 0,5 ml de medio y la concentración indicada de Frondoside A) se sembraron en las cámaras superiores del sistema, los pocillos de fondo en el sistema se llenaron con RPMI suplementado con 10% del feto de suero bovino como quimio-atrayente y después se incubó a 37 ° C durante 24 h. células no penetrante se retiraron de la superficie superior del filtro con un hisopo de algodón. Las células que han migrado a través del Matrigel se fijaron con formaldehído al 4%, se tiñeron con DAPI y se contaron en 25 campos al azar bajo un microscopio. El ensayo se llevó a cabo por duplicado y se repitió tres veces para el análisis cuantitativo.
membrana corioalantoidea (CAM) ensayo de angiogénesis
Este ensayo se realizó como se describió anteriormente [15], con algunas modificaciones. Brevemente, los huevos fertilizados se incubaron durante 3 días a 37, 8 ° C con una humedad del 48%. El día 4, la albúmina se eliminó para separar la cáscara de la CAM y el desarrollo de una ventana se hizo en la cáscara del huevo, la exposición de la CAM, y se cubren con una película de respiración (Suprasorb F®). Los huevos se devolvieron a la incubadora hasta el día 10, antes de la aplicación de los compuestos de ensayo. El compuesto de ensayo y el compuesto de control (DMEM sin FBS al 10%) disuelto en DMEM sin FBS al 10% se vertieron en discos separados estériles (12 mm de diámetro), que se dejaron secar en condiciones estériles. Una solución de acetato de cortisona (125 g /disco) se vertió en todos los discos para evitar una respuesta inflamatoria. Los discos de sondadas con recombinante humano bFGF (Peprotech) sirvieron como control para la estimulación de la angiogénesis. En cada CAM, el compuesto de control de disco que contiene el compuesto de ensayo y disco que contiene se colocaron a una distancia de 1 cm. Las ventanas se cubrieron y los huevos se incubaron hasta el día 14, antes de la evaluación de la angiogénesis. Por lo tanto, los huevos se inundaron con 10% de formalina tamponada y los huevos se mantuvieron a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos. La CAM, el área de los discos incluidos, se colocó en una placa de Petri con 10% de formalina tamponada. Los discos de plástico se retiraron y se tomaron imágenes de contraste de fase de la zona de los discos de plástico. El índice vascular se midió como se describe anteriormente [16]. Se contaron las intersecciones vasculares en una cuadrícula que contiene tres círculos concéntricos (6, 8 y 10 mm de diámetro con como centro el centro del disco). El índice angiogénico =
(TC) /c
, con
t
el número de intersecciones en el área cubierta por el disco de prueba y
c
el número de intersecciones en la área cubierta por el disco de control en el mismo huevo. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para el análisis estadístico (p & lt; 0,05).
Vascular formación de tubos de ensayo
Evaluación de
in vitro
formación capilar en Matrigel utilizado (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Francia). Matrigel es una matriz de membrana basal carcinoma de células escamosas, compuesta principalmente de colágeno IV, laminina, entactina, y proteoglicanos de sulfato de heparán. La matriz de Matrigel se descongeló, se mezcla suavemente hasta la homogeneidad utilizando pipetas se enfrió y se diluyó v /v con el EndoGRO Complete ™ medio kit de medios
-MV-VEGF (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.). Matrigel, 50 l /pocillo, suplementado con péptidos angiogénicos y otros efectores se utilizó para revestir los pocillos de placas de 96 pocillos. A continuación, la placa se incubó durante una hora a 37 ° C para permitir que la solución de matriz se solidifique antes del tratamiento. HUVECs (a una densidad de aproximadamente 4 × 10
4 células /pocillo y la concentración indicada de Frondoside A) se sembraron en cada pocillo y se incubaron durante 8 horas a 37 ° C en 0,1 ml de EndoGRO ™
-MV -VEGF medio completo kit de medios (Millipore, Temecula, CA, EE.UU.). A continuación, las células se fotografiaron usando un fotomicroscopio de contraste de fase invertida. El área de crecimiento de la red tubular se comparó en el control y tratados con inhibidor de matriz de Matrigel. la formación del tubo se cuantificó contando el número de estructuras similares a tubos formadas en cada pocillo. El efecto de Frondoside A en la viabilidad de las HUVEC se determinó usando un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo Luminescent (Promega Corporation, Madison, EE.UU.), como se describe anteriormente para las células cancerosas.
El crecimiento del tumor y la metástasis ensayo
los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el comité de ética animal y el animal de Atención Institucional de la Facultad de Medicina & amp; Ciencias de la Salud /UAE University. Seis semanas de edad, atímicos NMRI hembra ratones desnudos (nu /nu, Charles River, Alemania) fueron alojados en cabinas de flujo laminar de aire filtrado y manipulados en condiciones asépticas. Los procedimientos que implican animales y su cuidado se realizaron de conformidad con las directrices institucionales que se encuentran en el cumplimiento de la Facultad de Medicina & amp; Ciencias de la Salud, las leyes y políticas (Directiva 86/609 CEE del Consejo, DO L 358, 1 12 de diciembre de 1987; y la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Publicación NIH No. 85-23, 1985) nacionales e internacionales. células LNM35 (1 × 10
6 células en 200 l de PBS) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco lateral de los ratones desnudos. Una semana después de la inoculación, cuando los tumores habían alcanzado el volumen de aproximadamente 150 mm
3, los animales (seis en cada grupo) fueron tratados en el primer protocolo durante 25 días con Frondoside A (0,01 y 1 mg /kg /día, ip ) o solución de vehículo (control) con el fin de determinar el efecto de Frondoside a solo en el crecimiento tumoral y la metástasis. En el segundo protocolo, los animales fueron tratados durante sólo 10 días con la dosis más baja de Frondoside A (0,01 mg /kg /día, ip), cisplatino (1 mg /kg /día, ip), o con el tratamiento combinado Frondoside A y cisplatino . Los animales de control fueron tratados con solución de vehículo. dimensiones del tumor y los pesos de los animales se midieron cada 3 días. El volumen del tumor (V) se calculó usando la fórmula: V = 0,4 × a × b
2, con "a" es la longitud y "b" de la anchura del tumor. Después del sacrificio, los tumores y los ganglios linfáticos axilares se extirparon y se pesaron.
determinación inmunohistoquímica de CD31 /plaquetas endotelial molécula de adhesión celular 1 (PECAM-1) para la densidad de los microvasos
El efecto Una de Frondoside sobre la angiogénesis se evaluó utilizando CD31 inmuno-tinción. Los tejidos tumorales se congelaron rápidamente en isopentano a -130 ° C y se almacenaron a -70 ° C hasta su posterior procesamiento. Ocho micras secciones congeladas se fijaron en acetona, y se incubaron durante la noche con un anticuerpo CD31 (clon MEC13.3, 1:100) (BD Pharmingen, San Jose, CA, EE.UU.). a continuación, se lavaron los portaobjetos tres veces en PBS y se incubaron con anticuerpo secundario marcado con rodamina (de cabra anti-rata 1:100) durante una hora a temperatura ambiente. El área ocupada por los microvasos CD31-positivas y área total del tejido por sección se compararon entre los ratones tratados y de control. Todos los análisis se realizaron de forma ciega.
Los resultados se expresan como medias ± S.E.M. del número de experimentos. La diferencia entre los valores experimentales y de control se evaluaron mediante ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett post-hoc. El crecimiento del tumor y la metástasis estudios se analizaron mediante la prueba t de Student no pareado. P & lt; 0,05 indican una diferencia significativa
Resultados
Efecto de Frondoside A en la viabilidad celular
Como se muestra en la Fig.. 1, las concentraciones Frondoside A (0,01-5 M) causó una disminución dependiente de la concentración en la viabilidad celular de LNM35, A549, NCI-H460-Luc2, MDA-MB-435, MCF-7, y HepG2 células de más de 24 horas. Las concentraciones de IC50 (que produce una inhibición mitad de la máxima) a las 24 h estuvieron en el rango de 1,7 y 2,5 M Frondoside A para todas las líneas celulares.
crecimiento exponencial LNM35 (A), A549 (B), NCI-H460 -Luc2 (C), MDA-MB-435 (D), las células MCF-7 (e), y HepG2 (F) se trataron con vehículo (0,1% DMSO) y las concentraciones indicadas de Frondoside A. las células viables se ensayaron como se se describe en Materiales y Métodos. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces.
Columnas
, media;
bares, S.E.M. ** Significativamente diferente en P & lt; 0,01, *** significativamente diferentes a P & lt;. 0.001
Frondoside A induce la actividad de caspasa-3/7 de activación
La caspasa-3/7 es esencial en las vías de muerte celular por apoptosis. La actividad relativa de las caspasas 3/7 se analizó en las células LNM35 tratados durante 2 y 24 h con Frondoside A (1-2,5 M), y se normalizó para el número de células por pocillo. Como se muestra en la Fig. 2, caspasa 3/7 de actividad aumenta en 2.5 y 10.8 veces en las células LNM35 tratadas durante 24 h con Frondoside A 1 y 2,5 M respectivamente. Se observó un efecto similar después de tratamiento con Frondoside A (1-2,5 M) durante 2 h (datos no mostrados).
se analizó en las células LNM35 tratadas durante 24 h con Frondoside A (1-2,5 M), normalizado con el número de células viables por pocillo y se expresó como veces de inducción en comparación con el grupo control. * Significativamente diferente en P & lt;. 0,05
Impacto de Frondoside A en xenoinjertos LNM35
Para confirmar la relevancia farmacológica de los
in vitro
datos, la actividad contra el cáncer de Frondoside se investigó un
in vivo en ratones atímicos
inoculados con células de cáncer de pulmón LNM35. El crecimiento de los xenoinjertos de tumor humano LNM35 se controló cada tercera o cuarta día durante 25 días consecutivos después de i.p. inyección de 0,01 mg y 1 mg /kg de Frondoside A. El tratamiento con la dosis más baja de Frondoside A (0,01 mg /kg /día) redujo el volumen de los xenoinjertos LNM35 por 41% (Fig. 3A). Una diferencia similar se encuentra también en el peso del tumor al final del experimento (2,1 +/- 0,3 g frente a 4,5 +/- 0,8 g;
P & lt; 0,05
; Fig. 3C). El tratamiento con la dosis más alta (100 veces más) de Frondoside A (1 mg /kg /día) reduce el volumen del tumor de 43,9% de los xenoinjertos LNM35 (Fig. 3B). Casi diferencia similar se encontró en el peso del tumor al final del experimento (3 +/- 0,5 g frente a 4,5 +/- 0,8 g; Fig. 3D). Este experimento demostró claramente que la dosis más baja de Frondoside A (0,01 mg /kg /día) es óptima para la inhibición del crecimiento tumoral. No hubo efectos indeseables manifiestos de Frondoside un tratamiento en el comportamiento animal o peso corporal en ninguno de los experimentos (Fig. 3E y 3F). Además, no hubo anormalidades visibles en la necropsia, o cualesquiera otros signos evidentes de toxicidad como se ha descrito previamente por nuestro equipo [7]
A) & amp.; B) El volumen del tumor de xenoinjertos LNM35 inoculó por vía subcutánea en ratones desnudos y se trató con Frondoside A (0,01 y 1 mg /kg, las inyecciones intra-peritoneal, respectivamente) o la solución de control de portador solo, para un total de 25 días. Los puntos de datos representan la media ± S.E.M. de 6 ratones por grupo. C) & amp; D) El peso del tumor obtenido de la misma control y ratones desnudos tratados. Los puntos de datos representan la media ± S.E.M. de 6 ratones por grupo.
Columnas
, media;
bares, S.E.M. E) & amp; F) El peso corporal de estos ratones. Los puntos de datos representan la media ± S.E.M. de 6 ratones por grupo. * Significativamente diferente en P & lt;. 0,05
La inhibición de la angiogénesis por Frondoside A en los tumores xenoinjertados y el ensayo CAM
in vivo
y en las estructuras de tipo capilar
en vitro
la angiogénesis es un objetivo atractivo en la terapia del cáncer, no sólo porque suministra oxígeno y nutrientes para la supervivencia de las células tumorales sino que también proporciona la ruta de diseminación metastásica de estas células de cáncer. En primer lugar, se demuestra que en las áreas que proliferan en la periferia del tumor, la densidad de microvasos (medido por tinción de CD31) se redujo significativamente por Frondoside A (0,01 mg /kg /día) (Fig. 4, panel derecho) en comparación con el tumores tratados con control (Fig. 4, panel izquierdo). A continuación, se utilizó el ensayo de CAM que implica la coordinación y la integración de las respuestas multicelulares durante el desarrollo del embrión de pollo para confirmar este potencial efecto anti-angiogénico de Frondoside A. Como se muestra en la Fig. 5 y 6, bFGF (2 mg /ml), estimuladas formación de nuevos vasos 15% con índices angiogénicos estadísticamente diferentes en comparación con el medio DMEM control. Frondoside A (100 y 500 nM) inhibió la angiogénesis basal de una manera dependiente de la concentración con respectivamente 7% y el 12% de inhibición de índice angiogénico comparación con el control (Fig. 5 y 6). La formación de nuevos vasos sanguíneos inducidos por bFGF también fue completamente suprimida por Frondoside A (500 nM) (Fig. 5 y 6). Por último, para evaluar si el efecto antiangiogénico de Frondoside A implica una interacción directa del compuesto con las células endoteliales, llevamos a cabo estudios comparativos sobre la formación de estructuras de tipo capilar
in vitro
, usando HUVEC chapada en Matrigel placas recubiertas. Como se muestra en la Fig. 7A, las células endoteliales humanas tienen la capacidad de formar estructuras capilares cuando se sembró y se cultivaron en la parte superior de sustrato Matrigel. Las células de control se mueven de su patrón uniforme inicial de capas de células dispersas y se asocian para formar una red de grupos de células conectadas por procesos largos y multicelulares que conducen a la formación de estructuras similares a tubos. La adición de concentraciones no tóxicas de Frondoside A (0,01 a 1 mM) resultó en una inhibición marcada de este fenotipo angiogénico espontáneo (Fig. 7A, y 7B). Frondoside A inducida por la inhibición de este fenotipo angiogénico espontánea se produjo sin reducción significativa de la viabilidad celular (Fig. 7C). Tomados en conjunto, estos datos confirman un fuerte potencial antiangiogénico de Frondoside A.
tinción inmunohistoquímica de los tumores de xenoinjertos de pulmón para CD31 (densidad de microvasos).
CAM se trató con control (medio libre de suero), 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 mg /ml bFGF, fue fotografiado 2 mg /ml de bFGF + 500 nM Frondoside A y la vascularización de discos de prueba.
Barras
indican los índices angiogénicos (%) de palpada de CAM con 2 mg /ml de bFGF, 100 nM Frondoside A, 500 nM Frondoside A, 2 mg /ml de bFGF + 500 nM Frondoside A. Los datos representan la media ± SD (Mann-Whitney U-test, *: p & lt; 0,05, ***: p & lt; 0,01). En cada experimento, seis huevos se probaron por condición.
A) Los patrones de la angiogénesis inducida por las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en cultivo en matriz de Matrigel en placas de 96 pocillos en ausencia o presencia de la Frondoside A. B) Cuantificación de la morfogénesis tubular inducida en células HUVEC cultivadas en ausencia o presencia de la formación de A. tubo Frondoside se determinó por la longitud de estructuras tubulares que contienen células conectadas. Los datos son la media ± S.E.M. a partir de tres experimentos separados. Los asteriscos indican que significativamente diferentes valores fueron obtenidos en presencia de los inhibidores indicados frente a la correspondiente estimulación control. *** Significativamente diferentes a P & lt; 0,001. células HUVEC) C fueron tratados con vehículo (0,1% DMSO) y las concentraciones indicadas de Frondoside A. Las células viables se ensayaron como se describe en Materiales y Métodos. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces.
Columnas
, media;
bares, SEM
Frondoside A también afecta la migración celular y la invasión del cáncer de pulmón
in vitro
y metástasis
in vivo
progresión del cáncer se asocia con la supresión de los controles normales que limitan la migración celular y la invasión, llevando eventualmente a la metástasis. pacientes con cáncer de pulmón tienen un alto riesgo de recurrencia en forma de enfermedad metastásica. Metástasis comienza con la migración de células en el tumor primario, lo que lleva a la invasión del tejido local y la entrada en vasos linfáticos o sanguíneos. La capacidad de Frondoside A a reducir la migración celular se investigó mediante un
in vitro
modelo de cicatrización de la herida en el clásico. Frondoside A redujo la migración celular de las células LNM35 de una manera de la concentración y dependiente del tiempo (Fig. 8A). Del mismo modo, Frondoside Un deteriora la invasión de las células LNM35 en ensayo de invasión de Matrigel (Fig. 8B). Frondoside A inducida por la inhibición de la migración celular y la invasión de matrigel se produjo sin reducción significativa de la viabilidad celular (Fig. 1A).
) Heridas A se introdujeron en LNM35 confluentes monocapas cultivadas en presencia o ausencia (control) de Frondoside A (0,1-0,5 M). La distancia media que las células viajaron desde el borde de la zona raspada por 6, 24 y 30 horas a 37 ° C se midió de una manera ciega, utilizando un microscopio invertido (4 x aumentos). Los datos son medias ± S.E.M. de dos experimentos independientes. B) las células LNM35 se incubaron durante 24 h en presencia o ausencia de Frondoside A (0,01 a 1 M) y LY294002 (20 M). Las células que invadieron en Matrigel se puntuaron como se describe en Materiales y Métodos.
Columnas
, media; bares, S.E.M. Ganglios linfáticos peso metástasis de xenoinjertos establecidos de pulmón humano con cáncer tratados con Frondoside A 0,01 mg /kg (C) y 1 mg /kg (D) todos los días durante 25 días.
Columnas
, media;
bares, S.E.M. * Significativamente diferente en P & lt; 0,05, ** Significativamente diferente en P & lt; 0,01, *** significativamente diferentes a P & lt;. 0.001
A continuación, se evaluó el comportamiento metastásico de la línea de células pulmonares humanas LNM35 mediante el examen de ganglios linfáticos axilares. El examen histológico de los ganglios linfáticos de ratones portadores de LNM35 reveló la presencia de células LNM35 en todos los ganglios linfáticos de ambos el control y Frondoside A los ratones tratados (datos no mostrados). En el grupo control tratado con, el peso medio ganglios linfáticos fue 548,5 +/- 112,8 mg en comparación con 256 +/- 43,3 y 268,8 +/- 55,7 mg en los grupos tratados con Frondoside A 0,01 mg y 1 mg /kg /día, respectivamente (Fig. 8C y 8D).
Frondoside a aumenta la actividad contra el cáncer de cisplatino
Como se muestra en la Fig. 9A, la administración diaria de Frondoside A a ratones desnudos redujo el crecimiento de xenoinjertos de tumor humano LNM35 por 40,3% en el día 10. La inhibición de la LNM35 crecimiento de xenoinjerto de tumor por Frondoside A fue comparable con la producida por el agente contra el cáncer cisplatino que daña el ADN (46,9% ). El tratamiento combinado de Frondoside A con cisplatino resultó en una potenciación notable (67,6%;
P & lt; 0,05
) del efecto terapéutico cisplatino (Fig. 9A). No hubo efectos secundarios manifiestas del tratamiento combinado en el comportamiento de los animales o el peso corporal (Fig. 9B).
A) Frondoside Una mejora la eficacia del cisplatino frente a las células NSCLC LNM35 que crecen como xenoinjertos. B) Impacto de Frondoside A y cisplatino solo o en combinación en el peso corporal. * Significativamente diferente en P & lt;. 0,05
Discusión
A pesar de los avances en biología molecular del cáncer de pulmón, la mejora del diagnóstico y terapias diana óptima, incluso, los protocolos actuales para el tratamiento de cáncer de pulmón cáncer son aún insuficientes para producir golpear beneficios clínicos y la cura de pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo infructuosos. Los medicamentos de terapia dirigida actuales desarrollan resistencia y que son muy caros y no está disponible para la mayoría de pacientes con cáncer de pulmón en el mundo. Muchos medicamentos tienen una actividad relativamente baja; pocos pacientes se curan, con una breve, si alguno, aumento de la supervivencia [17]. La historia de agentes contra el cáncer, tales como paclitaxel, muestra que el mecanismo de acción se identificó varios años después de su eficacia clínica se demostró. A pesar de no conocer el mecanismo de la droga de acción, creemos que el
in vitro
, así como la fuerte
in vivo
efectos anticancerígenos de Frondoside Una deberían traducirse en la clínica para un nuevo potente agente anti-cáncer de pulmón.
en el presente estudio, se investigó el impacto de Frondoside a en las células de cáncer de pulmón progresión. Demostramos que Frondoside A causó concentración sensible (0,01-5 M) disminuye en la viabilidad de LNM35, A549 y células NCI-H460-Luc2 más de 24 horas a través de la caspasa 3/7-dependientes vía de la muerte celular. Las concentraciones de IC50 (que produce una inhibición mitad de la máxima) a las 24 h fueron entre 1,7 y 2,5 M Frondoside A. Estos resultados son consistentes con los resultados publicados previamente que la baja concentración de Frondoside A inhibe el crecimiento de células de cáncer pancreático humano y la apoptosis inducida a través de la caspasa 9 /3/7, el aumento de bax, disminución de bcl-2 y MCL-1, y detenido ciclo celular y [8], la apoptosis inducida hasta reguladas p21 en células de leucemia humana a través de la activación de caspasa [6], y disminuye significativamente la viabilidad de la receptor de estrógeno (ER) negativos-MDA-MB-231 células de cáncer de mama mediante la inducción de la apoptosis a través de la vía 7-Caspase9 Caspase3 /intrínseca [7]. También se ha demostrado que Frondanol A5, un extracto impuro de
Cucumaria frondosa
piel de la que Frondoside A se deriva originalmente, la inhibición del crecimiento inducida en S y la fase G2-M con una disminución en Cdc25C y un aumento de la p21
WAF1 /CIP1 con apoptosis significativo asociado con la fosforilación de H2AX y la caspasa-2 de escisión en las células HCT116 de cáncer de colon derivada de [4]. Un segundo documento también demostró que Frondanol-A5P, un precipitado sub-fracción polar de Frondanol-A5, inhibió la proliferación inducida y G2 detención del ciclo celular /M fase de dos células de cáncer pancreático con disminución de la expresión de la ciclina A, ciclina B, y cdc25c [ ,,,0],18]. Este efecto contra el cáncer de Frondoside A no es específica de tejido, y en este contexto hemos demostrado que Frondoside A indujo una disminución dependiente de la concentración de la viabilidad celular del melanoma MDA-MB-435, la MCF-7 de mama, y las células de hepatoma HepG2.
Para evaluar los efectos de un Frondoside en el desarrollo de tumores de pulmón
in vivo
, xenoinjertos LNM35 se realizaron en ratones inmunosuprimidos. Hemos demostrado que la administración intraperitoneal de Frondoside A causó una fuerte regresión de tumores establecidos. La inhibición máxima se obtuvo con la dosis baja de 0,01 mg /kg /día durante 25 días. Una dosis 100 veces superior da efectos similares que indican que el aumento de la dosis no mejorará la eficacia anti-cáncer de Frondoside A. El efecto inhibidor del cáncer de Frondoside A se ha observado anteriormente en AsPC-1 pancreático y MDA-MB-231 xenoinjertos en atímicos ratones [7], [8]. Este efecto anti-tumor de Frondoside A puede ser debido en parte a su efecto inmuno-estimuladoras [13] y el efecto /o anti-angiogénico. En este estudio, hemos demostrado por primera vez, que Frondoside A es un agente anti-angiogénico fuerte. Se reduce la densidad de los microvasos (medido por tinción de CD31) en el tumor xenoinjertado tratados con Frondoside A y también revertir significativamente basal y la angiogénesis inducida por bFGF en el ensayo de CAM de angiogénesis. formación de la estructura capilar mismo modo, Frondoside A totalmente suprimida en Matrigel sustrato por las células endoteliales humanas.
La angiogénesis es un objetivo atractivo en la terapia del cáncer, no sólo porque suministra oxígeno y nutrientes para la supervivencia de las células tumorales sino que también proporciona la ruta para la diseminación metastásica de estas células cancerosas. la progresión del cáncer se asocia con la supresión de los controles normales que limitan la migración celular y la invasión, lo que conduce finalmente a la metástasis.